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1、食品理化检验食品中转基因成分的检验第1页，此课件共71页哦v“转基因转基因”是指利用分子生物学手段是指利用分子生物学手段将外源性基因转移到某种特定生物体将外源性基因转移到某种特定生物体中，使其生物性状或机能发生部分改中，使其生物性状或机能发生部分改变。变。v转基因食品转基因食品就是以转基因生物体直接就是以转基因生物体直接作为食品或以其为原料加工生产的食作为食品或以其为原料加工生产的食品品。转基因食品（转基因食品（GMF）的定义）的定义Genetically Modified Foods第2页，此课件共71页哦转基因技术的基本步骤转基因技术的基本步骤 1.辨辨认认能能体体现现所所期期望望特特征征
2、的的目目的的基基因因代代码码，才才可可能能从从具具有有该该基基因因的天然活体中分离。的天然活体中分离。2.DNADNA的分离。利用特殊的剪切酶。的分离。利用特殊的剪切酶。在特定位点上将供体的在特定位点上将供体的DNADNA分裂成分裂成含有目的基因的片段，然后分离、含有目的基因的片段，然后分离、纯化。纯化。第3页，此课件共71页哦3.3.利用载体将目的基因转移，而利用载体将目的基因转移，而其中典型的载体是由细菌或病毒其中典型的载体是由细菌或病毒的的DNADNA环型片段组成的环型片段组成的4.4.目的基因的扩大培养及嫁入寄目的基因的扩大培养及嫁入寄主细胞主细胞5.5.选择性的标记基因选择性的标记基
3、因第4页，此课件共71页哦6.为控制基因表达而必需的为控制基因表达而必需的DNADNA序列（启动子、终止子的序列（启动子、终止子的DNADNA序序列必须结合其中）列必须结合其中）7.7.筛选和繁殖。经过转基因的寄筛选和繁殖。经过转基因的寄主细胞必须经过严格筛选、测试主细胞必须经过严格筛选、测试才能用于食品生产。才能用于食品生产。第5页，此课件共71页哦目前上市的转基因食品目前上市的转基因食品 抗除草剂基因大豆抗除草剂基因大豆 抗虫基因玉米抗虫基因玉米 抗病毒基因油菜抗病毒基因油菜 抗病毒土豆抗病毒土豆 抗软化基因西红柿抗软化基因西红柿 转抗虫基因棉花转抗虫基因棉花第6页，此课件共71页哦BT（
4、苏云金芽胞杆菌）玉米（苏云金芽胞杆菌）玉米苏云金芽胞杆菌苏云金芽胞杆菌 产生毒害剂的基因产生毒害剂的基因 除害剂基因与质粒结合除害剂基因与质粒结合 BT 玉米玉米 含转基因的幼苗含转基因的幼苗 植物细胞与植物细胞与重组基因重组基因 重组基因在细菌中重组基因在细菌中 细菌细菌共同培养共同培养 培养扩增细菌培养扩增细菌 基因重组基因重组第7页，此课件共71页哦质粒质粒v细菌细胞内一种自我复制的环状双链细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，存在于细胞质中分子，存在于细胞质中v能稳定地独立存在于染色体外，并传递到能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。子代，一般不整合
5、到宿主染色体上。v现在常用的质粒大多数是经过改造或人现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因工构建的，常含抗生素抗性基因，是重，是重组组DNA技术中重要的工具。技术中重要的工具。第8页，此课件共71页哦转基因食品的优势转基因食品的优势增加作物单位面积产量增加作物单位面积产量降低生产成本降低生产成本增强作物抗虫害、抗病毒能力增强作物抗虫害、抗病毒能力提高农产品的耐贮性，延长保鲜期提高农产品的耐贮性，延长保鲜期摆脱季节、气候的影响，四季低成本供应摆脱季节、气候的影响，四季低成本供应食品的品质和营养价值提高食品的品质和营养价值提高富含富含 胡萝卜素的转基因胡萝卜素的转基因“金色
6、水稻金色水稻”第9页，此课件共71页哦转基因食品安全性争论转基因食品安全性争论v赞同的人：赞同的人：认为该项技术及其产品能认为该项技术及其产品能大大提高人们的生活水平大大提高人们的生活水平v怀疑的人：怀疑的人：认为它走得认为它走得“太快太快”了，了，在现实生活中可能会产生副作用在现实生活中可能会产生副作用 v目前对转基因植物的安全性评价主要集目前对转基因植物的安全性评价主要集中在两个方面，中在两个方面，一个是环境安全性，一个是环境安全性，另一个是食品安全性另一个是食品安全性。第10页，此课件共71页哦v英国英国“普兹台事件普兹台事件”：1998年，英国罗伊特研究所年，英国罗伊特研究所普兹台教授
7、说他的实验证明，幼鼠食用转基因土豆普兹台教授说他的实验证明，幼鼠食用转基因土豆会使内脏和免疫系统受损。会使内脏和免疫系统受损。转基因安全事件转基因安全事件第11页，此课件共71页哦v美国的美国的“斑蝶事件斑蝶事件”：1999年美国康乃尔大学副教年美国康乃尔大学副教授约翰授约翰罗西在罗西在自然自然上发表文章说，一种转基因上发表文章说，一种转基因玉米可产生杀死害虫的花粉，而身为益虫的一种美玉米可产生杀死害虫的花粉，而身为益虫的一种美州大蝴蝶食用了这种转基因玉米花粉后有州大蝴蝶食用了这种转基因玉米花粉后有44死亡。死亡。转基因安全事件转基因安全事件第12页，此课件共71页哦过敏反应问题过敏反应问题：
8、对于一种食物过敏的人有时还会对一种：对于一种食物过敏的人有时还会对一种以前他们不过敏的食物产生过敏以前他们不过敏的食物产生过敏比如：科学家将玉米的某一段基因加入到核桃、小麦比如：科学家将玉米的某一段基因加入到核桃、小麦和贝类动物的基因中，蛋白质也随基因加了进去，那和贝类动物的基因中，蛋白质也随基因加了进去，那么，以前吃玉米过敏的人就可能对这些核桃、小麦和么，以前吃玉米过敏的人就可能对这些核桃、小麦和贝类食品过敏。贝类食品过敏。营养问题营养问题：科学家们认为外来基因会以一种人们目：科学家们认为外来基因会以一种人们目前还不甚了解的方式破坏食物中的营养成分。前还不甚了解的方式破坏食物中的营养成分。第
9、13页，此课件共71页哦对抗生素的抵抗作用对抗生素的抵抗作用：当科学家把一个：当科学家把一个外来基因加入到植物或细菌中去，这个基外来基因加入到植物或细菌中去，这个基因会与别的基因连接在一起。人们在服用因会与别的基因连接在一起。人们在服用了这种改良食物后，产生抗药性了这种改良食物后，产生抗药性对环境的威胁对环境的威胁：不在改良范围之内的其它：不在改良范围之内的其它物种有可能成为改良物种的受害者物种有可能成为改良物种的受害者第14页，此课件共71页哦技术特征技术特征v利用载体系统（细菌质粒、病毒的环形基利用载体系统（细菌质粒、病毒的环形基因）的重组因）的重组DNA技术技术v利用物理、化学和生物学等
10、方法将重组利用物理、化学和生物学等方法将重组DNA导入有机体的技术导入有机体的技术转基因食品的特征转基因食品的特征显微注射、基因枪等显微注射、基因枪等农杆菌介导转化法农杆菌介导转化法 第15页，此课件共71页哦转基因食品的特征转基因食品的特征产品特征产品特征v具有食品或食品添加剂的特征具有食品或食品添加剂的特征v产品的基因组构成发生了改变，并存在产品的基因组构成发生了改变，并存在外外源源DNA（基因重组体构成元件）（基因重组体构成元件）v产品中存在外源产品中存在外源DNA表达产物及其生物活性表达产物及其生物活性v产品具有基因工程所设计的性状和功能产品具有基因工程所设计的性状和功能第16页，此课
11、件共71页哦基因重组体构成元件基因重组体构成元件v载体载体v目的基因（定义目的基因（定义P184）病毒衣壳蛋白基因病毒衣壳蛋白基因病毒卫星病毒卫星RNA病毒复制酶基因病毒复制酶基因苏云金杆菌杀虫蛋白基因苏云金杆菌杀虫蛋白基因蛋白酶抑制剂基因蛋白酶抑制剂基因植物凝集素基因等植物凝集素基因等第17页，此课件共71页哦v调控元件调控元件启动子（花椰菜花叶病毒的启动子（花椰菜花叶病毒的35S启动子等）启动子等）终止子（花椰菜花叶病毒的终止子（花椰菜花叶病毒的35S终止子等）终止子等）v标记基因和报告基因标记基因和报告基因 标记基因：已知效应的基因，能够使个体标记基因：已知效应的基因，能够使个体具备特定
12、的特征并且通过生理学、形态学、具备特定的特征并且通过生理学、形态学、生物化学或分子生物学检测能够发现其存生物化学或分子生物学检测能够发现其存在的基因。在的基因。基因重组体构成元件基因重组体构成元件第18页，此课件共71页哦标记基因的作用标记基因的作用是一种已知功能或已知序列的基因，是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用能够起着特异性标记的作用重组重组DNA载体的重要标记，用来检验载体的重要标记，用来检验目的基因转化成功与否目的基因转化成功与否检测目的基因在细胞中的定位检测目的基因在细胞中的定位抗生素抗性基因、除草剂抗性基因抗生素抗性基因、除草剂抗性基因第19页，此课件共71页
13、哦n目的基因是需要表达的基因，标记基因目的基因是需要表达的基因，标记基因是有一定特点的基因是有一定特点的基因标记基因与目的基因的区别标记基因与目的基因的区别大肠杆菌大肠杆菌的某种的某种质粒质粒具有具有青霉素抗性基因青霉素抗性基因，当，当这种质粒与目的基因组合在一起形成重组质粒，这种质粒与目的基因组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体是否具有并被转入受体细胞后，就可以根据受体是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。然后，选择含有青霉素的培养基来培然后，选择含有青霉素的培养基来培养受体细胞，能够在培养基中存活下养受体细胞，
14、能够在培养基中存活下来的受体细胞就可以认为是成功的导来的受体细胞就可以认为是成功的导入了外源入了外源DNA，标记基因就起作用了，标记基因就起作用了第20页，此课件共71页哦报告基因与标记基因的异同报告基因与标记基因的异同n作用与标记基因相同作用与标记基因相同n标记基因的缺陷：标记基因的缺陷：q检测慢（蛋白酶作用需要时间）检测慢（蛋白酶作用需要时间）q依赖外界筛选压力（如抗生素、除草剂）依赖外界筛选压力（如抗生素、除草剂）n而报告基因则是指其编码产物能够被快速而报告基因则是指其编码产物能够被快速测定、且不依赖于外界压力的一类基因。测定、且不依赖于外界压力的一类基因。第21页，此课件共71页哦理想
15、的报告基因具备如下要求理想的报告基因具备如下要求n受体细胞中不存在相应内源等位基因的活性受体细胞中不存在相应内源等位基因的活性n它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞n具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性测特性 常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、荧光素酶基因（）、荧光素酶基因（luc）、）、-葡萄糖苷葡萄糖苷酸酶基因（酸酶基因（gus）等）等第22页，此课件共71页哦氯霉素乙酰基转移酶氯霉素乙酰基转移酶(CAT)：n可催化乙酰可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素
16、的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒羟基，而使氯霉素解毒n用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测其活性，也可进行蛋白质检测其活性，也可进行蛋白质印迹印迹(Westernblotting)和免疫组织化学分和免疫组织化学分析析第23页，此课件共71页哦荧光素酶荧光素酶n催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。细胞无内源性荧光素酶。n最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶。萤火虫荧光素酶。n用荧光比色计即可检测酶活性。用荧光比色计即可检测酶活性。第24页，此
17、课件共71页哦半乳糖苷酶半乳糖苷酶n由大肠杆菌基因编码，可催化半乳糖苷水由大肠杆菌基因编码，可催化半乳糖苷水解解n最大优势是易于用免疫组织化学法观测其最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一基因之一n以邻以邻硝基苯硝基苯D半乳吡喃糖苷半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶为底物可用标准的比色法检测酶活性活性第25页，此课件共71页哦GMFGMF成分检测成分检测外源蛋白质的检测外源蛋白质的检测外源基因的检测外源基因的检测蛋白蛋白质印质印迹法迹法蛋白蛋白芯片芯片试纸试纸条法条法“侧流侧流”型免疫型免疫测定测定
18、酶联酶联免疫免疫吸附吸附试验试验PCRSouthern杂交杂交基因基因芯片芯片定性定性PCRPCR实时定量实时定量荧光荧光PCRPCR法法定量竞争性定量竞争性QC-PCRQC-PCR法法PCR-ELISA法法定量定量PCRPCR反转录反转录RT-PCRRT-PCR法法其它技术其它技术第26页，此课件共71页哦优势优势:v 除蛋白芯片法外。快速除蛋白芯片法外。快速,具有一定的具有一定的灵敏度灵敏度,也能进行半定量也能进行半定量v尤其是试纸条法尤其是试纸条法,不需特殊仪器设备不需特殊仪器设备,适用于现场检验或初筛适用于现场检验或初筛外源蛋白质检测方法外源蛋白质检测方法第27页，此课件共71页哦v局
19、限性局限性:1.1.由于抗原抗体反应的专一性由于抗原抗体反应的专一性,每种每种转基因产品都要开发和建立专门的检转基因产品都要开发和建立专门的检测试剂和方法测试剂和方法,而转基因产品种类繁而转基因产品种类繁多多,要建立所有转基因产品的蛋白要建立所有转基因产品的蛋白质检测法工作量很大。质检测法工作量很大。2.2.只能定性和半定量检测只能定性和半定量检测外源蛋白质检测方法外源蛋白质检测方法第28页，此课件共71页哦 3.3.对于加工过的转基因食品对于加工过的转基因食品,其蛋白其蛋白质很容易被破坏质很容易被破坏,从而影响检测结果从而影响检测结果的准确性。的准确性。4.4.有些插入基因根本不表达或表达量
20、有些插入基因根本不表达或表达量很低，无法检测。很低，无法检测。外源蛋白质检测方法外源蛋白质检测方法第29页，此课件共71页哦载体载体目的基因目的基因调控元件调控元件（启动子、终止子、增强子）（启动子、终止子、增强子）标记基因标记基因报告基因报告基因PCR检测外源检测外源DNA外外源源DNA第30页，此课件共71页哦 根据检测目的和检测结果特异性水平的不同，外源根据检测目的和检测结果特异性水平的不同，外源DNA的检测方法有：的检测方法有：v初筛试验：对通用元件的检测初筛试验：对通用元件的检测 局限性：只能鉴别产品是否含有基因重组体，不局限性：只能鉴别产品是否含有基因重组体，不能鉴定转基因产品的种
21、类能鉴定转基因产品的种类v基因特异性试验基因特异性试验 能检测不同的目的基因、标记基因或报告基因，能检测不同的目的基因、标记基因或报告基因，区别不同的植物品系区别不同的植物品系PCR检测外源检测外源DNA第31页，此课件共71页哦v组成结构特异性试验组成结构特异性试验q检测目的基因与调控基因连接处的检测目的基因与调控基因连接处的核苷酸序列区段核苷酸序列区段q区别某类植物的各种转基因株系区别某类植物的各种转基因株系n插入位点构成特异性试验插入位点构成特异性试验q区别同一插入序列在基因组中的不区别同一插入序列在基因组中的不同重组状态同重组状态第32页，此课件共71页哦o聚合酶链式反应（聚合酶链式反
22、应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。得以迅速扩增。o步骤步骤 DNA的提取的提取 DNA纯化纯化 设计并合成引物设计并合成引物 探针制备探针制备 PCR检测检测PCR检测外源检测外源DNA定性、定量定性、定量第33页，此课件共71页哦第34页，此课件共71页哦v植物细胞中植物细胞中DNA主要存在于细胞核内主要存在于细胞核内v细胞质中的
23、细胞质中的DNA主要存在于线粒体和叶绿体中主要存在于线粒体和叶绿体中v细胞内各种细胞内各种DNA总称为总总称为总DNAv进行转基因检测需要提取的是总进行转基因检测需要提取的是总DNAv95%以上的以上的DNA是与蛋白质结合的是与蛋白质结合的DNA的提取和纯化的提取和纯化第35页，此课件共71页哦基本原理是：从样品中释放基本原理是：从样品中释放DNA，去除其他杂质：，去除其他杂质：去污剂或有机试剂破坏细胞膜，释放游离去污剂或有机试剂破坏细胞膜，释放游离DNA蛋白质：蛋白酶或有机试剂去除；蛋白质：蛋白酶或有机试剂去除；多糖（如果胶、纤维素、淀粉等），以相应的酶多糖（如果胶、纤维素、淀粉等），以相应
24、的酶或有机溶剂（或有机溶剂（CTAB/氯仿等）去除氯仿等）去除脂类：酶或溶剂（如正己烷）去除脂类：酶或溶剂（如正己烷）去除 RNA：RNA酶去除酶去除盐类（提取盐类（提取/裂解缓冲液或沉淀液的残留物）裂解缓冲液或沉淀液的残留物）DNA的提取和纯化的提取和纯化第36页，此课件共71页哦v沉淀法沉淀法：乙醇和异丙醇等沉淀乙醇和异丙醇等沉淀DNAv固体介质吸附法固体介质吸附法：采用阴离子交换树脂、：采用阴离子交换树脂、硅石或玻璃珠、硅藻土、膜等吸附硅石或玻璃珠、硅藻土、膜等吸附DNA。DNA的提取和纯化方法的提取和纯化方法植物总植物总DNA的提取方法的提取方法苯酚氯仿法苯酚氯仿法CTAB法法SDS法
25、法二氧化硅法二氧化硅法胍盐胍盐第37页，此课件共71页哦vDNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂 vCTAB溶解细胞膜，使蛋白质变性，与溶解细胞膜，使蛋白质变性，与DNA形成复形成复合物合物vCTAB与与DNA的复合物在高盐溶液中可溶的复合物在高盐溶液中可溶，而蛋白，而蛋白质、多糖、多酚溶解性降低会沉淀质、多糖、多酚溶解性降低会沉淀CTAB法提取和纯化法提取和纯化DNA原理原理十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)第38页，此课件共71页哦vCTAB与与DNA的复合物低盐溶液中沉淀的复合物低盐溶液中沉淀；而多糖、色素等不沉淀而多糖、色素等不沉淀
26、v使沉淀物溶于高盐溶液，加入乙醇和异使沉淀物溶于高盐溶液，加入乙醇和异丙醇沉淀丙醇沉淀DNACTAB法提取和纯化法提取和纯化DNA原理原理两个关键试剂：两个关键试剂：CTAB缓冲液缓冲液高盐溶液高盐溶液CTAB沉淀液沉淀液低盐溶液低盐溶液适合糖类和酚类含量较高的样品适合糖类和酚类含量较高的样品第39页，此课件共71页哦 加入加入CTAB缓冲液缓冲液加入加入氯仿氯仿反复颠倒反复颠倒试管试管 离心离心取上清取上清加入加入CTAB沉沉淀液淀液离心离心取沉淀取沉淀CTAB法提取和纯化法提取和纯化DNA步骤步骤第40页，此课件共71页哦CTAB法提取和纯化法提取和纯化DNA步骤步骤加入高浓度加入高浓度N
27、aCl溶液溶液加入氯仿加入氯仿离心、取上清液离心、取上清液加入异丙醇加入异丙醇离心、取沉淀离心、取沉淀反复加入乙醇反复加入乙醇离心、取沉淀离心、取沉淀自然晾干自然晾干去离子水或去离子水或TE缓冲液溶解缓冲液溶解第41页，此课件共71页哦提纯提纯DNA质量的检测质量的检测电泳原理：电泳原理：DNA分子在高于分子在高于等电点的等电点的PH溶液溶液中带负电荷，在中带负电荷，在电场中向正极移电场中向正极移动。其迁移速度动。其迁移速度与相对分子质量与相对分子质量的对数成反比的对数成反比。第42页，此课件共71页哦260nm、280nm处测定吸光度处测定吸光度v A260nm/A280nm在在1.61.9
28、：纯度高，可用：纯度高，可用vA260nm/A280nm1.6：蛋白质或溶剂污染：蛋白质或溶剂污染vA260nm/A280nm1.9：RNA污染污染提纯提纯DNA纯度的检测纯度的检测用用RNA酶酶或或苯酚氯仿法苯酚氯仿法进一步纯化进一步纯化第43页，此课件共71页哦PCR技术技术的原理的原理 PCR技术类似于技术类似于DNA的天然复制过程。的天然复制过程。在适宜的条件下，人工合成寡核苷酸引物与模在适宜的条件下，人工合成寡核苷酸引物与模板板DNA单链互补结合，在单链互补结合，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸下，以四种脱氧核苷酸(dNTP)为底物，不断为底物，不断延伸，使被扩增
29、的基因片断以几何倍数增长。延伸，使被扩增的基因片断以几何倍数增长。定性定性PCR的检测方法的检测方法第44页，此课件共71页哦变性退火延伸变性退火延伸模板模板DNA的变性的变性：加热至：加热至93-95，模板，模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA离解成为单离解成为单链；链；模板模板DNA与引物的退火（复性）：与引物的退火（复性）：温度降至温度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序列配单链的互补序列配对结合；对结合；PCR过程的基本步骤过程的基本步骤第45页，此课件共71页哦 引物的延伸引物的延伸：温度升至：温度升至72左右，在左右，在Taq D
30、NA聚合酶的作用下，以聚合酶的作用下，以dNTP为为反应原料，合成一条与模板反应原料，合成一条与模板DNA单链互单链互补链。补链。重复变性退火延伸三个过程，目的基重复变性退火延伸三个过程，目的基因被扩增放大几百万倍。每个循环需因被扩增放大几百万倍。每个循环需2-4min，整个，整个PCR反应需要反应需要2-3h。第46页，此课件共71页哦PCR原理示意图原理示意图PCR引物与模板结合示意图引物与模板结合示意图 第47页，此课件共71页哦v模板、引物、酶、模板、引物、酶、dNTP和和Mg2+是是PCR反应的五个重要因素，决定了反应的五个重要因素，决定了PCR反应的成败反应的成败。模板模板DNA：
31、抽提的：抽提的DNA溶液中含有溶液中含有氯仿、乙醇等有机溶剂、氯仿、乙醇等有机溶剂、Taq酶抑制酶抑制剂和杂蛋白等会影响剂和杂蛋白等会影响PCR扩增，产生扩增，产生假阴性。假阴性。PCR反应的主要因素反应的主要因素第48页，此课件共71页哦 引物：引物：PCR产物的特异性取决于引物与模产物的特异性取决于引物与模板板DNA互补的程度，互补的程度，引物的设计和合成对引物的设计和合成对PCR结果起着决定性作用结果起着决定性作用。引物的设计方法：引物的设计方法：n参考文献报道常用的效果最佳的引物参考文献报道常用的效果最佳的引物n采用计算机软件，例如采用计算机软件，例如Permier Primer、Ol
32、igo等。在软件的基础上辅以人工分析，等。在软件的基础上辅以人工分析，以达到最佳效果。以达到最佳效果。第49页，此课件共71页哦 Taq DNA聚合酶：聚合酶：n是一种耐热的是一种耐热的DNA聚合酶，由于发现于水生聚合酶，由于发现于水生栖热菌（栖热菌（Thermus aquaticus）内，故命名为）内，故命名为Taq聚合酶，也称为聚合酶，也称为TaqDNA聚合酶聚合酶n 其活力的高低决定了其活力的高低决定了PCR扩增是否成功扩增是否成功n最适温度很高（最适温度很高（79），使引物在高温下进行），使引物在高温下进行退火和延伸，增加了反应的特异性和扩增效率。退火和延伸，增加了反应的特异性和扩增效
33、率。第50页，此课件共71页哦 dNTPn三磷酸脱氧核糖核苷酸的缩写三磷酸脱氧核糖核苷酸的缩写nN代表代表A、G、C、T等中的一种，是它们的等中的一种，是它们的混合物混合物n在在PCR中起原料作用中起原料作用n浓度过低会降低浓度过低会降低PCR产物的产量；浓度过高产物的产量；浓度过高会导致错配会导致错配DNA聚合酶水解下来两个磷酸后把脱氧单磷酸核聚合酶水解下来两个磷酸后把脱氧单磷酸核苷酸连在苷酸连在DNA模板链上模板链上第51页，此课件共71页哦 Mg2+浓度浓度n Mg2+是是Taq DNA聚合酶活性所必需聚合酶活性所必需的，直接影的，直接影响着酶的活性和可靠性响着酶的活性和可靠性nMg2+
34、浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增扩增n浓度过低会降低浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应聚合酶的活性，使反应产物减少产物减少nDNA模板、引物和模板、引物和dNTP可与可与Mg2+结合，降低结合，降低Mg2+实际浓度实际浓度第52页，此课件共71页哦假阳性、假阴性假阳性、假阴性引起假阳性现象的原因引起假阳性现象的原因v极微量的目标极微量的目标DNA污染都有可能出现扩污染都有可能出现扩增条带。增条带。v引物设计不合适也会出现假阳性现象引物设计不合适也会出现假阳性现象PCR检测常见问题检测常见问题第53页，此课件共71页哦引起假阴性现象的
35、原因引起假阴性现象的原因v 模板中含有杂蛋白质，模板中含有杂蛋白质，Taq酶抑制剂，酚、氯仿、酶抑制剂，酚、氯仿、乙醇等有机溶剂乙醇等有机溶剂v DNA量不足量不足v Taq酶失活、酶活降低或量不足酶失活、酶活降低或量不足v 引物设计不合理引物设计不合理v 变性温度低，时间短变性温度低，时间短v 退火温度不适合等等退火温度不适合等等PCR检测常见问题检测常见问题第54页，此课件共71页哦v非特异性扩增：引物与靶序列不非特异性扩增：引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚完全互补、或引物聚合形成二聚体体v涂抹带、片状带、地毯样带涂抹带、片状带、地毯样带（Smear现象）。现象）。v原因：酶过多
36、或酶质量差，原因：酶过多或酶质量差，dNTP浓度过高，浓度过高，Mg2+浓度过高，浓度过高，退火温度过低等。退火温度过低等。PCR检测常见问题检测常见问题第55页，此课件共71页哦v DNA的提取纯化的提取纯化 设置阳性对照、阴性对照设置阳性对照、阴性对照v 确定待测目标序列确定待测目标序列v 引物设计引物设计v PCR反应体系的构建反应体系的构建v PCR扩增扩增v 电泳及结果分析电泳及结果分析转基因成分的转基因成分的PCR检测一般程序检测一般程序第56页，此课件共71页哦n原理原理 通过通过PCR扩增和凝胶电泳分离可扩增和凝胶电泳分离可得到大小为得到大小为170bp的的DNA片段，包片段，
37、包括括花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子启动子和玉米基因组的和玉米基因组的DNA序列。序列。PCR定性检测抗虫转基因玉米定性检测抗虫转基因玉米MON810品系品系第57页，此课件共71页哦设计引物设计引物n正向引物正向引物：玉米基因，：玉米基因，5-TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CG-3n反向引物反向引物：CaMV35S启动子（启动子（GeneBank编号：编号：V000141，J02048），），5-TCC ATC TTT GGG ACC ACT GTC G-3注释：注释：GeneBank是美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库，汇集并是美国国立卫生研
38、究院维护的基因序列数据库，汇集并注释了所有公开的核酸序列。注释了所有公开的核酸序列。第58页，此课件共71页哦PCR反应体系的构建反应体系的构建试剂试剂终浓度终浓度加样体积加样体积/l模板模板DNA10-50ng2水水14.810PCR缓冲液（不含缓冲液（不含MgCl2）12.5MgCl2溶液溶液2mmol/L2.0dNTP溶液溶液0.4mmol/L1.0正向引物正向引物0.5 mol/L1.25反向引物反向引物0.5 mol/L1.25Taq酶（酶（5IU/ml）1IU0.2第59页，此课件共71页哦PCR扩增扩增预变性预变性10min，9520s，95扩增扩增40s，6440s，72循环数
39、循环数40最终延伸最终延伸3min，72第60页，此课件共71页哦电泳及结果分析电泳及结果分析n方法：取方法：取PCR产物在含有溴化乙锭的琼脂糖产物在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳，用紫外灯或凝胶成像系统观凝胶上进行电泳，用紫外灯或凝胶成像系统观察并记录察并记录PCR产物电泳条带。产物电泳条带。n结果：结果：l阴性：无电泳条带阴性：无电泳条带l阳性：有电泳条带阳性：有电泳条带l待测样品待测样品n有电泳条带：含转基因成分有电泳条带：含转基因成分n无电泳条带：不含转基因成分无电泳条带：不含转基因成分170bpM 1 2 3 4 第61页，此课件共71页哦原理原理v特异性强、自动化程度高、不使用
40、溴化乙锭、特异性强、自动化程度高、不使用溴化乙锭、不污染环境等特点不污染环境等特点v指在指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标进程，最后通过标准曲线（标准品）对未知模板进行定量分析的准曲线（标准品）对未知模板进行定量分析的方法。方法。v使用的化学物质：荧光探针和荧光染料使用的化学物质：荧光探针和荧光染料实时荧光定量实时荧光定量PCR第62页，此课件共71页哦TaqMan荧光探针荧光探针nPCR扩增时，加入一对引物，同时加入一个特异性的扩增时，加入一对引物，同时加入一个特异性的荧光探针。荧光探针。n
41、该探针为一寡核苷酸，两端分别标记了一个报告荧光基团该探针为一寡核苷酸，两端分别标记了一个报告荧光基团和一个猝灭荧光基团。和一个猝灭荧光基团。n探针完整时，报告基团发射的荧光信号被猝灭基团吸收；探针完整时，报告基团发射的荧光信号被猝灭基团吸收；PCR扩增时，扩增时，Taq酶的酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与形成，实现了荧光信号的累积与P
42、CR产物形成完全同产物形成完全同步。步。第63页，此课件共71页哦TaqMan探针法原探针法原理图理图 第64页，此课件共71页哦v荧光扩增曲线的三个阶段：荧光背景信号阶段荧光扩增曲线的三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期）（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）荧光信号指数扩增阶段（对数期）、平台期。平台期。v只有在荧光信号指数扩增阶段，只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系数值与起始模板量之间存在线性关系，所以选择，所以选择在这个阶段进行定量分析。在这个阶段进行定量分析。v为了定量和比较的方便，引入了两个非常重要的为了定量和比较的方便，引入了
43、两个非常重要的概念：概念：荧光阈值和荧光阈值和Ct值值 PCR的定量方法的定量方法第65页，此课件共71页哦 荧光域值（荧光域值（threshold）q是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，可以是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上q理论上，第理论上，第3-15个循环的荧光值作为个循环的荧光值作为baseline，这段区域荧光标准偏差的三倍就是，这段区域荧光标准偏差的三倍就是threshold。q手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时性对照的荧光最高值，同时
44、要尽量选择进入指要尽量选择进入指数期的最初阶段数期的最初阶段第66页，此课件共71页哦Ct（Cycle threshold）值）值 是指每个反应管内的荧光信号到达是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。设定域值时所经历的循环数。第67页，此课件共71页哦PCR的定量方法的定量方法反映反映PCR循环次数和荧光强度的曲线循环次数和荧光强度的曲线 第68页，此课件共71页哦第69页，此课件共71页哦Ct值与起始模板的关系：值与起始模板的关系：n模板的模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，在线性关系，起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，Ct值越小值越小。n利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代标代Ct值值。n因此，只要获得未知样品的因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。第70页，此课件共71页哦Ct值与起始拷贝数的对数的直线关系值与起始拷贝数的对数的直线关系起始拷贝数的对数起始拷贝数的对数Ct值值第71页，此课件共71页哦