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1、化学保护与化学敏感关键词化学保护化学敏感抗药基因药物敏感基因提要化学保护和化学敏感是基因治疗与化学治疗相结合的一种新的肿瘤治疗技术。本文就化学保护和化学敏感的基本策略,几种抗药基因和药物敏感基因,以及存在的问题和发展方向做了综述。中国图书资料分类号 R730.5长期以来,影响化疗效果的一个重要因素是它的剂量限制问题,因为超剂量的化疗药物对人正常组织的危害极大,其中最为突出的是引起骨髓抑制。在化疗之后,进行自身骨髓移植或辅以细胞因子治疗,可在一定程度上提高高剂量化疗的安全性,但还不能完全治愈肿瘤,因为刚移植完的骨髓,其细胞构成比较低,对化疗引起的骨髓抑制更为敏感。从 1992 年开始,人们开始尝
2、试向骨髓细胞内导入多药抗药基因(MDR-1),然后将经过基因修饰的骨髓移植入患者体内,以提高骨髓对化疗药物的抗性。这种基因治疗技术与化学治疗相结合的新型治疗手段,就叫做化学保护1。某些化疗药物如环磷酰胺(CPA)处于原药状态时,没有毒性,只有被肝细胞的细胞色素酶(P450)分解后,才具有杀肿瘤作用 2。人体肿瘤组织一般较少含有这样的酶类,若将能分解原药的酶基因导入实体瘤,然后全身用药,则原药可在瘤内被转变为有毒性的代谢物,从而达到使肿瘤消退的目的,这就叫做化学敏感。另外,向肿瘤细胞内导入抑癌基因 3或癌基因的反义核酸4,以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,也叫做化学敏感。1 化学保护基因治疗包括
3、 3个基本要素:载体、靶细胞和治疗基因。在化学保护中,最常用的还是逆转录病毒载体,因为它能整合到原始造血细胞的染色体上,并随着染色体的复制而传给子代细胞。下面着重介绍靶细胞和抗药基因。1.1 靶细胞由于成熟造血细胞的寿命都比较短,要维持外源基因的长期表达,多能造血干细胞是首选的靶细胞。急性造血损伤与祖细胞直接相关,也是化学保护的重点对象。化学保护的主要步骤如下:先对患者实施化疗,在其骨髓抑制开始缓解的早期,分离其骨髓或外周血,经过 FACS收集 CD34+的原始细胞。然后转染携带 MDR-1 基因的逆转录病毒,再将经基因修饰的骨髓或外周血回输给患者。这样,当患者的造血功能恢复之后,便可逐渐加大
4、化疗药物的剂量,实施多次的化疗,而不至于造成骨髓抑制。干细胞的增殖不活跃,不利于逆转录病毒的转染。在培养基中加入细胞因子虽然能刺激其增殖,但干细胞将分化为成熟的后代细胞,失去了其多能性。通过在体外建立一个与体内营养环境类似的造血基质细胞层,可维持干细胞的功能和提高逆转录病毒的转染效率5。1.2 抗药基因现已发现的抗药基因很多,它们的作用和所对抗的化疗药物如表 1 所示。其中对编码抗多种药物的转运糖蛋白 P-gp基因 MDR-1 和编码 O6-烷基鸟嘌呤-DNA转移酶 ATase的基因研究得最多。利用 MDR-1 基因对造血干细胞进行保护的实验,在美国的几个研究中心已进入 期临床阶段6。P-gp
5、是一种膜结合型糖蛋白,相对分子质量(Mr)为 170 000,其作用是加速药物外流,以保证胞浆内的药物浓度维持在一个较低的水平。表 1 抗药基因的功能抗性作用化疗药物抗多种药物蛋白(P-gp)蒽环类抗生素(阿霉素、柔红霉素)长春花碱(长春新碱、长春碱)DN A修复(A Tase)O6烷化剂(双氯亚硝脲)DN A修复(多种)放射谷胱苷肽转移酶蒽环类抗生素醛脱氢酶环磷酰胺胸苷合成酶5 氟尿嘧啶二氢叶酸还原酶氨甲喋呤金属硫因顺铂、苯甲酸氮芥作者简介:孙蕾,女,27 岁,博士生北京市太平路 27 号,Tel.(010)66932313239细胞与分子免疫学杂志(J Cell Mol Immunol)1
6、998Sep;14(3)DOI:10.13423/ki.cjcm i.002207化疗药物甲基亚硝基脲(MNU)、双氯亚硝基脲(BCNU)和甲磺酸甲脂(MMS)是 O6烷基化物质。它们的作用机理是使 DNA上的碱基发生烷基化,这种烷基化作用或者引起 DNA两条链之间的交联,阻断 DNA复制;或者引起碱基错误配对,最终导致 DNA链断裂。ATase的作用是将 DNA上的烷基转移到其自身而失活,以修复 DNA碱基中的 O6-烷基化突变。人正常组织中,肝细胞中ATase的含量最高,骨髓中含量最低,因此,烷基化类化疗药物的严重副作用是造成骨髓抑制。将ATase基因转移入造血干或祖细胞,也是化学保护的一
7、条途径。另外,肿瘤细胞中 ATase的存在会降低上述化疗药物的抗肿瘤作用。故应用 ATase的竞争性抑制剂降低肿瘤细胞的 ATase活性,可提高肿瘤细胞对药物的敏感性。在美国,临床上正试验游离的 O6-苯基鸟嘌呤(O6-beG)和烷化类化疗药物的联合使用,来增强化疗药的抗肿瘤作用。但由于 O6-beG对肿瘤和正常组织中 ATase的灭活无选择性,这种联合用药的毒副作用也显著增强。O6-beG对细菌 ATase(简称 ada)无作用,用 ada进行化学保护的小鼠,在接受 O6-beG和化疗药物的联合治疗时,没有贫血和血小板减少的发生。然而在人体细胞内表达细菌蛋白易引发免疫反应。ATase双突变体
8、(P140A/G156A)的构建,则完全克服了这些问题。P140A/G156A与 ada 的作用相当,其与 O6-beG反应的 IC50比野生型高 3 000 倍。1.3 化学保护存在的问题和未来发展方向首先,维持抗药基因在靶细胞中长期高水平表达的问题还没有解决。由于造血干细胞和逆转录病毒本身的特性,一般很难达到较高的基因转移效率。现用的病毒和哺乳动物类启动子在原始造血细胞中的转录水平不高,而且常因高甲基化作用而失活。其次,化疗的副作用不仅限于骨髓,对肺、胃肠道和肾都有副作用。因此,即使骨髓得到了基因保护,也存在一个剂量限制的问题。最后,对于已经发生了转移的实体瘤,例如晚期乳腺癌和前列腺癌,因
9、骨髓中有转移来的癌细胞,在对骨髓进行基因保护的同时,癌细胞也得到了保护9,影响了药物的抑瘤作用。因此,发展能表达结合于特定细胞类型的抗体或配体的新型载体,或者发展具有造血组织特异性的启动子是非常必要的。尽管存在这许多问题,化学保护为肿瘤的化学治疗展示了一个新的发展方向。它不仅提高了现有化疗手段的疗效,而且由于造血干细胞得到保护,以前的一些由于对骨髓具有很强的毒性而放弃的药物,又可被重新考虑使用。临床单一药物治疗的例子并不多见,通常是几种化疗药物组合用药。因此,要想达到化学保护的最佳效果,需向骨髓导入多种抗药基因。抗药基因的共同表达和表达水平的提高是未来的一个发展方向。利用基因工程手段,构建抗药
10、基因突变体也是化学保护的发展方向。2 化学敏感现已报道的化学敏感基因有胸苷激酶基因(HSV-tk)、胞嘧啶脱氨酶基因(cd)、脱氧胞嘧啶激酶基因(dCK)和细胞色素酶基因(P450)。HSV-tk研究得最早也最多,它能将抗病毒药物 9(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(GCV)或无环鸟苷(ACV)磷酸化而变成能阻断细胞 DNA合成的化合物。这些化合物可通过细胞间的缝隙连接扩散到相邻的细胞中,使周围细胞也死亡,叫做“旁观者效应”。通过大鼠脑瘤模型的实验发现,如果 10%的脑瘤细胞转染了 HSV-tk,则 50%以上的脑瘤细胞可被杀死。应用 HSV-tk基因治疗比较成功的肿瘤为卵巢癌和脑瘤。19
11、92年 12 月在 NIH有 12 个脑瘤患者接受了应用逆转录病毒载体携带的 HSV-tk进行的基因治疗。向患者脑瘤部位多点趋实体式注射病毒生产细胞(VPC),1 周后,每天两次静脉输注 GCV,连续输 14 d,其中 8 个患多形性胶质瘤和转移性脑瘤的患者,出现了一定的抗瘤反应,并且无与基因转移方式相关的毒性反应发生10。脑瘤一般生长在一个有丝分裂不活跃的环境中,适合于用逆转录病毒进行基因治疗的研究。但逆转录病毒载体的转染效率相对较低,而且只有那些与 VPC紧挨着的脑瘤细胞能被转染。相反,腺病毒载体具有滴度高、转染效率高和分布广的优点。将腺病毒 VPC注射到被胶质瘤浸润的大鼠脑部,在整个水肿
12、部位都能见到被腺病毒转染的细胞11。但腺病毒载体应用于脑瘤基因治疗不及逆转录病毒载体的方面是,它对分裂细胞和不分裂细胞都能转染。因此,使用腺病毒载体,最好是选择对细胞周期的选择性自杀基因,例如 cd基因或 P450基因进行治疗。细菌 cd基因的作用是将抗真菌药物 5 氟胞嘧啶(5-FC)脱氨,生成具有细胞毒性的 5 氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU是结肠癌、直肠癌、乳腺癌、骨、胰腺癌和肺癌的化疗药物,但由于存在毒副作用,限制了其使用。哺乳动物细胞中不含有 cd基因,不能(下转封三)240细胞与分子免疫学杂志(J Cell Mol Immunol)1998Sep;14(3)(上接第 240 页)将
13、 5-FC转换成 5-FU,转染 cd基因后,对 5-FC的敏感性高于对 5-FU的敏感性11。5-FU可通过细胞膜自由扩散,它的“旁观者”效应不依赖于细胞-细胞间的直接接触。化疗药物 CPA及其异构物 IFA(异环磷酰胺)只有被 P450 代谢为 4-羟基 CPA和 4-羟基 IFA,并自发裂解成丙烯醛、亚磷酰芥和异磷酰芥后,才能发挥抗肿瘤作用。人体只有肝脏含有 P450,全身给药,在肝脏形成的 CPA和 IFA代谢物分布到骨髓、肾脏和心血管,对这些组织和器官的毒性很大。肿瘤细胞一般极少可检测到 P450 的编码基因 CYP。实验发现,经 CYP2B1 转染的大鼠胶质瘤细胞和乳腺癌细胞,对
14、CPA和 IFA的敏感性增强,而且没有毒副反应发生11。CPA/P450 的旁观者效应也不需要细胞-细胞间的直接接触。dCK是脱氧核苷酸生物合成补救途径的一个重要的酶。它的作用是将核苷类化疗药物,例如阿糖胞苷(AraC)、2-氯-脱氧腺苷(CdA)、2-氟-阿糖腺苷(FAraA)和二氟脱氧胞苷(dFdC)磷酸化。Deana等证明,转基因的肿瘤细胞对这些化疗药物的敏感性可提高 2.5 106 倍12。重复使用一种药物敏感基因进行化学敏感治疗,肿瘤细胞会对其产生抗性。抗药基因的共表达不仅可减少产生抗性的机率,而且由于抗药基因之间的协同作用,可提高原药的作用效果 13。GCV和 5-FC代谢产生主要
15、杀死处于 S期的细胞,具有细胞周期选择性;而 CPA/IFA代谢产物杀死细胞的作用与细胞周期无关。CPA/P450 和 S期特异性的 GCV/HSV-tk联合使用,是将来化学敏感治疗的发展方向。脑瘤的位置一般比较固定,利用外科手术的方式(趋实体式)可将 V PC注射到脑瘤部位,是用于基因治疗的比较好的实验模型。但约占颅内脑瘤40%50%的胶质细胞瘤,则有浸润的倾向,手术、放疗、化疗和免疫治疗对它都不是很有效的。胶质细胞具有沿着几条特定路线(纤维束、血管、主、实质)迅速迁移的特性,Tamura等14尝试用腺病毒作为 VPC发现,在小鼠脑部同一个位点第 2 次注射的经自杀基因修饰的胶质瘤细胞,会沿
16、着第 1次注射的未经修饰的胶质瘤细胞的路线迁移,并与之混合。对小鼠进行 GCV处理,结果第 1 次移植的胶质瘤细胞完全被杀死,肿瘤消退,这是用成纤维细胞作为 VPC所不能达到的。参考文献1 Greenwald P,Kelloff G,Burch WCet al.Chemoprevention.CA Cancer J Clin,1995;45:31-492 Chen L,Wax man DJ,Chen Det al.Sensitization of humanbreast cancer cells to cyclophosphamide and ifosfamide by trans-fer o
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