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1、实 验 研 究针刺“足三里”对免疫抑制大鼠的作用及穴区 CGP 表达影响的研究*摘要:目的:观察针刺足三里对免疫抑制大鼠的作用及与穴区降钙素基因相关肽(CGP)表达的相关性。方法:采用环磷酰胺腹腔注射法制备免疫抑制动物模型，将 30 只 SD 雄性大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组和针刺组，每组各 6 只。检测各组大鼠体重、脾脏指数、胸腺指数及白细胞计数;应用 T PC 法检测各组大鼠穴区局部 CGP 表达情况。结果:针刺组大鼠体重、脾脏指数、胸腺指数及白细胞计数与模型组相比显著增加;电针组和针刺组处理后穴区 CGPmNA 表达量显著下降，与模型组比较有显著性差异;针刺组下降程度显著
2、高于电针组，两组比较有显著性差异，提示针刺方法和刺激量与 CGP 表达呈现一定的量效关系。结论:针刺对免疫抑制大鼠有一定的治疗作用，其机制可能与针刺调节穴区神经肽的表达使局部 CGP 表达下降相关。关键词:针刺;降钙素基因相关肽;足三里;免疫抑制中图分类号:224 2文献标识码:A文章编号:1005 0779(2018)05 0049 03*基金项目:中国博士后科学基金，编号:2013M531081;黑龙江省自然科学基金面上项目，编号:D201276;黑龙江省博士后科研启动金，编号:LBH Q15138。作者简介:代巧妹(1975 )，女，副教授，主要从事免疫病理学研究。通讯作者:颜培宇(19
3、76 )，女，助理教授，黑龙江中医药大学博士后在站人员，主要从事中医药免疫调节机制的研究。Effect of Needling ST36 on Immunosuppressive ats:Studyof CGP Expression around AcupointsDAI Qiaomei1，WANG Meiqiao1，YAN Peiyu1，2，SHANG Yanqi1，LIANG Hui1，CAI Wenhui1，WANG Yao1(1 Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;2 Macau Univers
4、ity of Science and Technology，Macau 519020，China)Abstract:Objective:To observe the effect of needling Zusanli(ST36)on immunosuppressive rats and its cor-relation with the expression of calcitonin gene related peptide(CGP)around acupoints Methods:Animalmodel of immune suppression was prepared by intr
5、aperitoneal injection of Cyclophosphamide 30 male SD ratswere randomly divided into the normal group，the sham operation group，the model group，the electro acu-puncture group and the acupuncture group，with 6 rats in each group Body weight，indexes of spleen and thy-mus，and WBC count were measured in ea
6、ch group T PC method was used to observe the expression ofCGP esults:The body weight，indexes of spleen and thymus，as well as WBC count were significantly in-creased in the acupuncture group compared to those in the model group CGP mNA expression decreasedsignificantly in the acupuncture group and th
7、e electro acupuncture group，compared to that in the modelgroup;the decreasing degree of the acupuncture group was significantly higher than that of the electro acu-puncture group，which suggested that the needling method and the stimulation amount had a certain relationshipwith CGP expression Conclus
8、ion:Acupuncture has certain therapeutic effect on immunosuppressive rats，andits mechanism may be related to the expression of neuropeptides around acupuncture point，which may be relat-ed to the decrease of local CGP expressionKey words:Acupuncture;Calcitonin gene related peptide;Zusanli(ST36);Immuno
9、suppression94针灸临床杂志 2018 年第 34 卷第 5 期足三里为胃经合穴，有补益脾胃、调和气血、祛邪防病之功。对针刺腧穴的作用机理研究证明:腧穴作用中的“调和气血”即包括了现代解剖学中的淋巴系统1 4。有报道针刺可以调整人体白细胞总数，使之趋向正常;家兔动物实验亦证实针灸足三里穴对白细胞总数有一定影响，且中性粒细胞的变化与白细胞总数的变化呈平行关系。另有研究显示针刺足三里治疗疟疾可以使淋巴细胞的转化率提高5。这些研究表明足三里穴可能对免疫系统产生一定作用，但缺乏相关动物实验研究的进一步证实。皮肤重要神经递质的降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related p
10、eptide，CGP)与表皮和真皮内的多种靶细胞接触，可直接影响皮肤内重要的具有抗原提呈功能的树枝状细胞 郎格汉斯细胞以及微血管内皮细胞的功能。针刺调节神经末梢 CGP 的释放，与针刺的神经保护、抗缺血、调节血压、调节胃肠运动、保护胃黏膜、免疫调节、镇痛作用等均有密切联系，这些研究结果提示 CGP 可能参与针刺效应，而这种效应在不同的疾病中会引起不同靶器官效应6 8。在本研究中，笔者用免疫抑制剂环磷酰胺建立免疫抑制大鼠模型，使用传统针刺和电针两种方法针刺大鼠足三里穴，并研究局部穴区 CGP变化，从而揭示针刺治疗疾病的作用机制。1材料与仪器1 1实验动物健康 SD 雄性大鼠 30 只，体质量 2
11、80 350 g。由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号:scxk(京)2007 0001。1 2药品和试剂Super M MLV 反转录酶(北京百泰克生物技术有限公司)，NA simple Total NA Kit(天根生化科技北京有限公司)，环磷酰胺(上海谷研实业有限公司)，2 Power Taq PC MasterMix(北京百泰克生物技术有限公司)，Nase 固相清除剂(北京天恩泽基因科技有限公司)，引物(生工生物工程上海有限公司)。1 3仪器电针仪(汕头市医用设备厂)，凝胶成像分析仪(北京六一生物科技有限公司)，水平电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，PC 仪(杭州博日科技有限
12、公司)，ADVIA 120 血球分析仪(德国西门子公司)。2实验方法2 1实验分组及造模正常 SD 雄性大鼠 30 只，随机分为正常组、假手术组、模型组、针刺组和电针组共 5 组，每组各 6 只。正常组小鼠不做任何处理，假手术组腹腔注射 0 9%无菌生理盐水 3 天，第 4 天加强注射 1 次。其余各组均腹腔注射新鲜配制的环磷酰胺注射液(50 mg/kg)，连用 3 天，第 4 天加强注射 1 次，制备免疫抑制模型9。2 2针刺选穴及针刺操作方法根据华兴邦大鼠穴位针灸图谱，取“足三里”穴。针具选择 30 号针，进针 3 mm。针刺手法:补法(重插轻提、徐徐捻转、吸气时进针)8。针刺组施行补法治
13、疗，留针30 min，每日1 次。电针组给予电针补法治疗，连续波，频率 20 Hz，强度 1 2 mA，持续30 min，每日 1 次。实验各组大鼠绑缚固定操作，正常组、假手术组及模型组分别绑缚但不针刺，治疗 7 天。2 3测定白细胞计数大鼠尾静脉取血，用乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂，用 ADVIA 120 血球分析仪检测白细胞计数。2 4测定脾脏、胸腺指数各组大鼠称重，无菌取大鼠脾与胸腺，称重，根据文献计算脾脏与胸腺指数9。2 5总 NA 提取及 cDNA 的制备治疗结束后，处死大鼠，取“足三里”区大约皮下10 mm 3 mm 区域组织，迅速冷冻于液氮瓶。研砵预冷，加入液氮充分研磨组织
14、，待组织呈粉末状加入1 mL Z 裂解液，充分混匀，在室温下放置 5 min。利用总 NA 提取试剂盒提取样本总 NA。比色杯测NA 浓度，用1 g 的 NA 去逆转录，每12 L 体系中加 入 oligo(dT)151L，random1L，dNTP(2 5 mMeach)2 L，5 Buffer 4 L，Nasin 0 5 L，M MLV 1 L，实验样品 NA 2 L。逆转录反应条件:25 温浴 10 min，42 温浴 50 min，95 加热5 min终止反应，将逆转录后的 cDNA 产物置于 20保存。2 6PC 反应PC 反应体系，2 Taq PC Master mix 10 L，
15、CDNA 1 L，上游特异性引物 1 L，下游特异性引物1 L，ddH2O 补足至 20 L。actin 引物序列:上游引物:5GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TAG C3，下游引物:5GGC CGG ACT CAT CGT ACT CCT GCTT3，actin 扩增条件:95 5 min 预变性，95 20 s变性，60 20 s 退火，72 延伸，4 5 min 终末延伸。30 循环，4保温。CGP 引物序列:上游引物:5CAG GAG GAG GAA CAG GAG GCT3，下游引物:5CAG GTG CTC CAA CCC CAA T38，CGP 扩增条件:
16、95 5 min 预变性，95 20 s 变性，62 20 s 退火，72 延伸，4 5 min 终末延伸。30 循环，4保温。2 7统计方法实验数据采用 SPSS17 0 及 EXCEL2003 软件进行统计学处理。珋x s 用来表示计量资料数据，单因素方05JCAM May 2018，Vol 34，NO 5差分析法被用于多组间差异的显著性分析，SNK 检验用于比较组间两两之间的差异，P0 05 确定为差异有统计学意义。3结果3 1各组免疫抑制相关指标评价针刺组大鼠体重、脾脏、胸腺指数及白细胞计数与模型组相比显著增加，电针组大鼠体重、胸腺指数与模型组相比显著增加，见表 1。3 2各组穴区内
17、CGP 表达比较T PC 结果显示:电针组和针刺组治疗后，穴区 CGPmNA 表达量显著下降，与模型组比较有显著性差异;针刺组下降程度显著高于电针组，两组比较有显著性差异。见图 1、表 2。图 1针刺对“足三里”穴区 CGPmNA 表达的影响注:M:Marker;MJ:模型组;AJ:电针组;BJ:针刺组表 1各组大鼠免疫抑制相关指标测定比较(珋x s，n=6)组别体重(g)WBC(103/ul)脾脏指数胸腺指数正常组30041 62591127 388237 0 76215 0 64假手术组 28719 59281093 356225 0 58193 0 74模型组23421 6657492
18、199146 0 62118 0 49电针组25459 7062*655 235161 0 60157 0 60*针刺组26643 7273*923 318 198 0 73 18 0005 6 注:与模型组比较，P 001，*P 0 05表 2各组大鼠“足三里”穴区内 CGP 表达情况比较(珋x s)组别n相对表达量正常组61066 7 0 057 8假手术组61073 3 0 125 0模型组(MJ)62436 7 0 368 6电针组(AJ)61716 7 0 265 6*针刺组(BJ)61250 0 0 446 4 注:与模型组比较，*P 0 05，P 0 01;与电针组比较，P 0.
19、054讨论环磷酰胺是一种周期特异性烷化剂，主要作用于细胞周期的 S 期，影响 DNA 合成。其免疫抑制作用强而持久，能抑制体液免疫和细胞免疫反应9。本实验用环磷酰胺制造免疫抑制大鼠模型，大鼠注射环磷酰胺后出现体重减轻、尿血、脱毛等免疫抑制症状。在本研究中，笔者用补法针刺免疫抑制大鼠足三里穴，结果显示:针刺组大鼠体重、脾脏、胸腺指数及白细胞计数与模型组相比显著增加，电针组大鼠体重、胸腺指数与模型组相比显著增加。环磷酰胺具有骨髓抑制作用，可以导致粒细胞减少，针刺组与模型组相比大鼠白细胞计数显著增加，而电针组与模型组相比大鼠白细胞计数虽然增加，但没有统计学意义。胸腺属于中枢免疫器官，脾脏属于外周免疫
20、器官，通过对大鼠脾脏指数与胸腺指数的检测，可以考察针刺对免疫抑制大鼠免疫功能的影响。针刺组与模型组相比脾脏指数与胸腺指数均显著增加，而电针组与模型组相比仅胸腺指数显著增加。灵枢经 云:“虚实之要，九针最妙，补泻之时，以针为之”。传统针灸的补法、次数与留针时间对疾病的疗效具有重要影响。体现在本研究中，对于免疫抑制大鼠模型的治疗效果，针刺组要优于电针组。针刺起效的过程可分为局部进针，启动针刺信息，信息沿复杂网络途径传导，最后在靶器官发挥针刺效应等几个环节。其中进针后启动针刺信息为重要的始动环节。通过穴位进针，捻转补泻，引起穴位周边微环境各种特异性应答变化，例如:交感肾上腺髓质系统的兴奋，各种化学介
21、质的释放，不同细胞功能被激活等，最后作用于靶器官，引起靶器官针刺效应10。CGP是感觉神经主要递质，主要由背神经节合成，某些非神经细胞也可表达，如淋巴细胞和内皮细胞。CGP 具有重要的免疫调节作用，可调节多种免疫细胞功能，它可调节离体 T 淋巴细胞增殖和细胞毒作用，调节 T 淋巴细胞分泌 IL 2 和巨噬细胞分泌 TNF 、IL 6、IL 12、CXC 趋化因子 KC 和巨噬细胞炎症蛋白 2 以及一氧化氮和前列腺素11 12。T PC 结果显示:电针组和针刺组处理后，穴区 CGPmNA 表达量显著下降，与模型组比较有显著性差异;针刺组下降程度显著高于电针组，两组比较有显著性差异，其原因可能15
22、针灸临床杂志 2018 年第 34 卷第 5 期为针刺局部的神经递质 CGP 与机体的皮肤树突细胞相互作用，通过分泌相应的细胞因子，影响了 T 细胞的分化和功能，参与了机体的免疫过程。本研究使中医传统理论与现代医学结合，丰富了神经 内分泌 免疫的研究内容，促进了针灸免疫学这一边缘学科的发展，而 CGP 对皮肤树突细胞分化的影响及对机体T 细胞应答方向的调控，将是今后研究的重点。参考文献:1郭孟玮，赵雅芳，王顺 电针“百会”“足三里”穴对 IBS 模型大鼠行为及丘脑中 CGP mNA 表达的影响 J 长春中医药大学学报，2017，33(1):31 33 2Liu C，Zhou ZG，Li B，e
23、t al Overview of researches on central actionmechanism of needling Zusanli(ST 36)J Journal of Acupuncture andTuina Science，2017，15(3):191 198 3 李娴，覃永贞，赵彩娇 针灸足三里穴延缓衰老的实验研究 J 中国民族民间医药，2014，12(6):16，21 4 陈文婷，傅国强，沈卫东 电针足三里对胃黏膜保护机制的研究进展 J 辽宁中医杂志，2015，42(3):658 661 5刘良 针灸对细胞免疫功能的影响J 陕西中医，1984，5(1):40 41 6
24、张毅民 降钙素基因相关肽合成与释放调节J 国际病理科学与临床杂志，2010，30(2):153 157 7秦蔚，顾炳全 针刺慢性萎缩性胃炎患者足三里穴后血浆 ET、NO、CGP 和 EGF 水平的检测J 国际检验医学杂志，2015，36(17):2512 2513 8王丽，井明，鑫建梅 捻转补泻手法对应激性高血压大鼠 CGP、NO 含量的影响J 中国针灸，2011，31(4):337 341 9张俊，Yong Seong Shin，胡安君，等 环磷酰胺致大鼠免疫抑制和免疫亢进模型的建立与评价J 中国实验动物学报，2015，23(4):395 400 10 潘丽佳，赵雪，郭义 CGP 与针刺效应
25、相关性的研究进展J 上海针灸杂志，2016，35(1):117 120 11 aes G，De Baetselier P，Van Ginderachter JA Clinical and fundamen-tal aspects of monocyte，macrophage and dendritic cell plasticityJEur J Immunol，2012，42(1):13 16 12 陈慧诚，李健峰 降钙素基因相关肽及其在免疫系统的功能J动物医学进展，2006，27(6):50 52收稿日期:檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼
26、檼檼檼檼檼2017 11 11刺 灸 聚 英“刘氏环五针”治疗坐骨神经痛的临床研究摘要:目的:观察“刘氏环五针”治疗坐骨神经痛的临床疗效。方法:共纳入 146 例患者，并按照随机数字表法分为环五针组和常规针刺组，每组各 73 例，在接受基础治疗的同时，常规针刺组予针刺患侧以“环跳穴”为核心的常用穴位;环五针组针刺患侧以“新环跳穴”为核心的 5 个组合穴位，疗程均为 10天。疗效评价标准采用视觉模拟评分法(VAS)与改良日本骨科学会下腰痛评分法(JOA)。结果:环五针组总改善率 95 8%，常规针刺组总改善率 83 6%，两组比较环五针组优于常规针刺组，差异有统计学意义(P 0 05)。治疗后环
27、五针组 VAS 评分、PI 评分均较常规针刺组低，而 JOA 评分较常规针刺组高，差异均有统计学意义(P 0 05)。环五针组不良反应总发生率为 4 2%，而常规针刺组为 2 7%，组间差异无统计学意义(P 0 05)。结论:“刘氏环五针”可有效缓解坐骨神经痛，且优于常规针刺疗法，值得进一步研究和临床推广应用。关键词:刘氏环五针;针刺;环跳;坐骨神经痛;腰腿痛中图分类号:246 6文献标识码:A文章编号:1005 0779(2018)05 0052 05作者简介:李卓荣(1980 )，男，主治中医师，研究方向:中医针灸结合现代康复治疗神经系统疾患的临床研究及治疗。通讯作者:梁慧(1982 )，
28、女，主治中医师，研究方向:针灸结合现代康复治疗神经系统、骨科系统相关疾患。Clinical Study of“LIUs ing Five Needle”in the Treatment of SciaticaLI Zhuorong1，LIU Benli2，LIANG Hui3，LIN Haibo1(1 Jiangmen Wuyi TCM Hospital，Jiangmen TCM Hospital Affiliated to Jinan University，Jiangmen 529031，China;2 Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine，Integrated Traditional25JCAM May 2018，Vol 34，NO 5