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1、会计学1细胞器的分离、纯化实验细胞器的分离、纯化实验应用范围：应用范围：1.病毒及亚细胞病毒及亚细胞 组份分离组份分离 2.蛋白梯度分离蛋白梯度分离 3.脂蛋白分离脂蛋白分离 4.RNA梯度沉淀梯度沉淀 5.质粒质粒DNA提纯提纯 Back第1页/共17页n n认识离心机及学习离心机的使用方法认识离心机及学习离心机的使用方法认识离心机及学习离心机的使用方法认识离心机及学习离心机的使用方法n n学习细胞器的分离及纯化的一般原理学习细胞器的分离及纯化的一般原理学习细胞器的分离及纯化的一般原理学习细胞器的分离及纯化的一般原理和方法和方法和方法和方法实验目的实验目的Back第2页/共17页实验原实验原
2、理理 离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颖粒的沉降系数、质量、密度及力，根据物质颖粒的沉降系数、质量、密度及力，根据物质颖粒的沉降系数、质量、密度及力，根据物质颖粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的分离分析浮力等因子的不同，而使物质分离的分离分析浮力等因子的不同，而使物质分离的分离分析浮力等因子的不同，而使物质分离的分离分析技术。技术。技术。技术。细胞分级分离式一种通过离心从而分离细胞细胞分级分离式一种通过离心从而分离细胞细胞分级分离式一种通过
3、离心从而分离细胞细胞分级分离式一种通过离心从而分离细胞内不同结构成分的细胞器。不同的细胞器的大内不同结构成分的细胞器。不同的细胞器的大内不同结构成分的细胞器。不同的细胞器的大内不同结构成分的细胞器。不同的细胞器的大小和密度不同，在同一离心场内的沉降速度不小和密度不同，在同一离心场内的沉降速度不小和密度不同，在同一离心场内的沉降速度不小和密度不同，在同一离心场内的沉降速度不同，用差速离心法、密度梯度离心法、密度梯同，用差速离心法、密度梯度离心法、密度梯同，用差速离心法、密度梯度离心法、密度梯同，用差速离心法、密度梯度离心法、密度梯度平衡离心法分离细胞器。度平衡离心法分离细胞器。度平衡离心法分离细
4、胞器。度平衡离心法分离细胞器。差速离心法是从低到高不同的转速离心，使差速离心法是从低到高不同的转速离心，使差速离心法是从低到高不同的转速离心，使差速离心法是从低到高不同的转速离心，使较大的颗粒先在低转速中沉淀，再用较高转速较大的颗粒先在低转速中沉淀，再用较高转速较大的颗粒先在低转速中沉淀，再用较高转速较大的颗粒先在低转速中沉淀，再用较高转速将原来悬浮的小颗粒物质沉淀下来，从而达到将原来悬浮的小颗粒物质沉淀下来，从而达到将原来悬浮的小颗粒物质沉淀下来，从而达到将原来悬浮的小颗粒物质沉淀下来，从而达到逐级分离。逐级分离。逐级分离。逐级分离。第3页/共17页相对离心力（RCF）v由于转头有不同的制造
5、商制造，半径不同，故用相对离心力来表示离心力的大小。vRCF(g)=Fc/F重力=mG/mg=r2/g=1.11910-5N2r=11.2r(N/1000)2也有：根据这个公式，相对离心力（RCF）和每分钟转数（N）之间便可以互换，这种互换关系是很有实用价值的。Back为了简便为了简便第4页/共17页实验用品实验用品1.1.材料：新鲜菠菜材料：新鲜菠菜材料：新鲜菠菜材料：新鲜菠菜2.2.器材：器材：器材：器材：显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心管、管、管、管、20020
6、0目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器。目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器。目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器。目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器。3.3.试剂：试剂：试剂：试剂：线粒体离心匀浆介质。线粒体离心匀浆介质。线粒体离心匀浆介质。线粒体离心匀浆介质。1%1%詹纳斯绿詹纳斯绿詹纳斯绿詹纳斯绿B B的的的的0.25M0.25M蔗糖溶液。蔗糖溶液。蔗糖溶液。蔗糖溶液。0.05M Tris-HCl0.05M Tris-HCl液体液体液体液体 Ph=8.0Ph=8.0 0.35mol/L NaCl 0.35mol/L NaCl Back匀浆介质，一般为一定浓度的蔗糖溶液加入其它匀浆介质，一般为一
7、定浓度的蔗糖溶液加入其它离子成分，可以维持亚细胞组分的渗透压。离子成分，可以维持亚细胞组分的渗透压。第5页/共17页台式高、台式高、超速离心超速离心机机0.6-10万万rpm离心机离心机制备性制备性分析性分析性分析性超速离心机分析性超速离心机普通离心普通离心机机冰冻离心冰冻离心机机台式（或台式（或地面式）地面式）普通离心普通离心机机大容量冰大容量冰冻离心机冻离心机小于小于0.6万万rpm高速冰高速冰冻离心冻离心机机0.6-2.5万万超速冰冻超速冰冻离心机离心机2.5-8万或万或更高更高(分析性超速离心主要用于检测分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特征和结构等大分子物质的沉降特征和结构等
8、)概述概述Back ！第6页/共17页n n离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。Back第7页/共17页一般制备离心一般制备离心一般制备离心是指在分离、浓缩、提纯样品中，不必制备密度梯度的一次完成的离心操作，实验室用低、高速离心机可应用于此项技术。台式或地面式普通离心机台式或地面式普通离心机Back第8页/共17页高速冰冻离心机Back第9页/共17页 从从从从低低低低速速速速到到到到高高高高速速速速逐逐逐逐级级级级沉沉沉沉淀淀淀淀分分分分离离离离，使使使使较较较较大大大大的的的的颗颗颗颗
9、粒粒粒粒先先先先在在在在较较较较低低低低转转转转速速速速中中中中沉沉沉沉淀淀淀淀，再再再再用用用用较较较较高高高高转转转转速速速速将将将将原原原原先先先先悬悬悬悬浮浮浮浮在在在在上上上上清清清清液液液液中中中中的的的的较较较较小小小小颗颗颗颗粒粒粒粒分分分分离离离离沉沉沉沉淀淀淀淀下下下下来来来来，从从从从而而而而使使使使各各各各种亚细胞组分得以分离。种亚细胞组分得以分离。种亚细胞组分得以分离。种亚细胞组分得以分离。差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。n n其其其其优优优优点点点点是是是
10、是：操操操操作作作作简简简简单单单单，离离离离心心心心后后后后用用用用倾倾倾倾倒倒倒倒法法法法即即即即可可可可将将将将上上上上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。n n缺缺缺缺点点点点是是是是：分分分分离离离离效效效效果果果果差差差差，不不不不能能能能一一一一次次次次得得得得到到到到纯纯纯纯颗颗颗颗粒粒粒粒；壁壁壁壁效效效效应应应应严严严严重重重重，特特特特别别别别是是是是当当当当颗颗颗颗粒粒粒粒很很很很大大大大或或或或浓浓浓浓度度度度很很很很高高高高时时
11、时时，在在在在离离离离心心心心管管管管一一一一侧侧侧侧会会会会出出出出现现现现沉沉沉沉淀淀淀淀；颗颗颗颗粒粒粒粒被被被被挤挤挤挤压压压压，离离离离心心心心力力力力过过过过大大大大、离离离离心心心心时时时时间间间间过过过过长长长长会会会会使使使使颗颗颗颗粒粒粒粒变变变变形形形形、聚聚聚聚集集集集而而而而失失失失活。活。活。活。细胞器沉降顺序依次为：核、线粒体、溶酶体核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体。差速离心法：差速离心法：第10页/共17页Low speedHigh speed差数离心法Back第11页/共17页密度梯度离心法：用
12、具有梯度的介质来替换离心管中密度均一的介质，使介质分为不同的层次，浓度低的在上层，高的在底层。细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大小、形态、密度的颗粒，就会以不同的速度向下移动，击中到不同的区域，可以分别收集。该法的优点是：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点：离心时间较长；需要制备梯度；操作严格，不宜掌握。Back第12页/共17页 将离心机转数换算为相对离心力时，首先，在 r标尺上取已知的半径和在 N 标尺上取已知的离心机转数。然后，将这两点
13、间划一条直线，在图中间 RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。注意，若已知的转数值处于 N 标尺的右边，则应读取 RCF 标尺右边的数值；同样，转数值处于 N 标尺左边，则读取 RCF标尺左边的数值。半径半径相对离心相对离心力力转速转速方法：方法：两点一两点一线法线法Back第13页/共17页应急处理：应急处理：如果离心时发现离心管破裂，如果离心时发现离心管破裂，必须先停止实验，将破裂管密封放必须先停止实验，将破裂管密封放入生物垃圾桶，再用入生物垃圾桶，再用75%酒精进行酒精进行擦拭消毒，如必要需用移动紫外灯擦拭消毒，如必要需用移动紫外灯照射照射3060分钟后才能开始实验。分钟后才能开
14、始实验。注意事项：注意事项：a）离心机应始终处于水平位置，与）离心机应始终处于水平位置，与外接电源电压匹配，并要求有良好外接电源电压匹配，并要求有良好的接地线。的接地线。b）开机前应检查机腔有无异物掉入。）开机前应检查机腔有无异物掉入。注意事项：注意事项：c）样品应预先平衡，使用离心机微）样品应预先平衡，使用离心机微量离心时离心套管与样品应同时平量离心时离心套管与样品应同时平衡。衡。d）挥发性或腐蚀性液体离心时，应）挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免侵蚀机腔或造成事故。外漏以免侵蚀机腔或造成事故。e）每次操作完毕，应做好使用情况）每
15、次操作完毕，应做好使用情况记录，应定期对机器各项性能进行记录，应定期对机器各项性能进行检修。检修。f）离心过程中若发现异常现象，应）离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员立即关闭电源，报请有关技术人员检修。检修。Back第14页/共17页玉米黄化幼苗线粒体的分离（整个过程保持在玉米黄化幼苗线粒体的分离（整个过程保持在玉米黄化幼苗线粒体的分离（整个过程保持在玉米黄化幼苗线粒体的分离（整个过程保持在0-0-4 4）1.将玉米黄化幼苗剪下，称重每小将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约组约5g，在冰箱中放置，在冰箱中放置1小时小时2.将幼苗剪碎直接倒入研钵中以将幼苗剪碎直接倒入研钵中以
16、1:3(重量体积比重量体积比g:ml)比例加入离比例加入离心匀浆介质，快速研磨，注意先心匀浆介质，快速研磨，注意先加入少许介质液，研碎后将余液加入少许介质液，研碎后将余液加入加入3.用双层尼龙网过滤，除去残渣。用双层尼龙网过滤，除去残渣。4.取滤液在低温高速离心机伤取滤液在低温高速离心机伤2300rpm离心离心10min弃沉淀弃沉淀5.取上清液在低温高速离心机上取上清液在低温高速离心机上9950rpm离心离心10min弃上清液弃上清液6.所留沉淀用匀浆介质液洗涤，以所留沉淀用匀浆介质液洗涤，以9950rpm离心离心10min弃上清弃上清7.将所得沉淀悬浮于将所得沉淀悬浮于0.5M，ph=7.2
17、甘露醇中，至于冰箱备用。甘露醇中，至于冰箱备用。8.将制备的线粒体悬液滴于干净的将制备的线粒体悬液滴于干净的载玻片上用载玻片上用1%詹纳斯绿詹纳斯绿B的的0.25M蔗糖液（蔗糖液（ph=7.4）染色）染色20min9.加干净的盖玻片。镜检最好用相加干净的盖玻片。镜检最好用相差显微镜，所有的线粒体都被染差显微镜，所有的线粒体都被染成蓝绿色颗粒，检验制备的线粒成蓝绿色颗粒，检验制备的线粒体的纯度体的纯度实验方法实验方法第15页/共17页菠菜叶叶绿体的分离（整个过程菠菜叶叶绿体的分离（整个过程保持保持0）1 1取去叶脉的的新鲜菠菜叶取去叶脉的的新鲜菠菜叶取去叶脉的的新鲜菠菜叶取去叶脉的的新鲜菠菜叶5
18、g5g于研钵中，加入于研钵中，加入于研钵中，加入于研钵中，加入0.35mol/L NaCl0.35mol/L NaCl溶液溶液溶液溶液15ml15ml研磨。注意开始研磨时研磨。注意开始研磨时研磨。注意开始研磨时研磨。注意开始研磨时也是先加入少许介质，研磨后加入余液也是先加入少许介质，研磨后加入余液也是先加入少许介质，研磨后加入余液也是先加入少许介质，研磨后加入余液2 2绿色的匀浆液用尼龙网过滤，滤液分别转入两支干绿色的匀浆液用尼龙网过滤，滤液分别转入两支干绿色的匀浆液用尼龙网过滤，滤液分别转入两支干绿色的匀浆液用尼龙网过滤，滤液分别转入两支干净的离心管中，以净的离心管中，以净的离心管中，以净的
19、离心管中，以1000rpm1000rpm离心离心离心离心4min4min，除去沉淀。，除去沉淀。，除去沉淀。，除去沉淀。3 3上清液在高速低温离心机上以上清液在高速低温离心机上以上清液在高速低温离心机上以上清液在高速低温离心机上以3000rpm3000rpm离心离心离心离心5min5min，所得的沉淀是叶绿体所得的沉淀是叶绿体所得的沉淀是叶绿体所得的沉淀是叶绿体4 4用用用用0.35mol/L NaCl 0.35mol/L NaCl 溶液稀释，放置于冰箱中保存。溶液稀释，放置于冰箱中保存。溶液稀释，放置于冰箱中保存。溶液稀释，放置于冰箱中保存。在干净的载玻片上滴加叶绿体悬液，加盖玻片在在干净的载玻片上滴加叶绿体悬液，加盖玻片在在干净的载玻片上滴加叶绿体悬液，加盖玻片在在干净的载玻片上滴加叶绿体悬液，加盖玻片在显微镜下光差叶绿体的形态显微镜下光差叶绿体的形态显微镜下光差叶绿体的形态显微镜下光差叶绿体的形态Back第16页/共17页