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1、细胞器的分离、纯化细胞器的分离、纯化 细胞分级分离法细胞分级分离法秦川实验目的实验目的实验原理实验原理实验用品实验用品实验方法实验方法应用范围：应用范围：1.病毒及亚细胞病毒及亚细胞 组份分离组份分离 2.蛋白梯度分离蛋白梯度分离 3.脂蛋白分离脂蛋白分离 4.RNA梯度沉淀梯度沉淀 5.质粒质粒DNA提纯提纯 Back认识离心机及学习离心机的使用方法学习细胞器的分离及纯化的一般原理和方法实验目的实验目的Back实验原理实验原理 离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颖粒的沉降系数、质量、密度及浮力，根据物质颖粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因
2、子的不同，而使物质分离的分离分析技术。力等因子的不同，而使物质分离的分离分析技术。细胞分级分离式一种通过离心从而分离细胞细胞分级分离式一种通过离心从而分离细胞内不同结构成分的细胞器。不同的细胞器的大小内不同结构成分的细胞器。不同的细胞器的大小和密度不同，在同一离心场内的沉降速度不同，和密度不同，在同一离心场内的沉降速度不同，用差速离心法、密度梯度离心法、密度梯度平衡用差速离心法、密度梯度离心法、密度梯度平衡离心法分离细胞器。离心法分离细胞器。差速离心法是从低到高不同的转速离心，使差速离心法是从低到高不同的转速离心，使较大的颗粒先在低转速中沉淀，再用较高转速将较大的颗粒先在低转速中沉淀，再用较高
3、转速将原来悬浮的小颗粒物质沉淀下来，从而达到逐级原来悬浮的小颗粒物质沉淀下来，从而达到逐级分离。分离。相对离心力（RCF）v由由于于转转头头有有不不同同的的制制造造商商制制造造，半半径径不不同同，故故用用相相对对离离心心力来表示离心力的大小。力来表示离心力的大小。vRCF(g)=Fc/F重力重力=mG/mg=r2/g=1.11910-5N2r=11.2r(N/1000)2也有：也有：根根据据这这个个公公式式，相相对对离离心心力力（RCF）和和每每分分钟钟转转数数（N）之之间便可以互换，这种互换关系是很有实用价值的。间便可以互换，这种互换关系是很有实用价值的。Back为了简便为了简便实验用品实验
4、用品1.1.材料：新鲜菠菜材料：新鲜菠菜2.2.器材：器材：显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心管、管、200200目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器。目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器。3.3.试剂：试剂：线粒体离心匀浆介质。线粒体离心匀浆介质。1%1%詹纳斯绿詹纳斯绿B B的的0.25M0.25M蔗糖溶液。蔗糖溶液。0.05M Tris-HCl0.05M Tris-HCl液体液体 Ph=8.0Ph=8.0 0.35mol/L NaCl 0.35mol/L NaCl Back匀浆介质，一般为一定浓度的蔗糖溶液加入其它匀浆介质，一般为一定浓度的蔗糖溶
5、液加入其它离子成分，可以维持亚细胞组分的渗透压。离子成分，可以维持亚细胞组分的渗透压。台式高、超台式高、超速离心机速离心机0.6-10万万rpm离心机离心机制备性制备性分析性分析性分析性超速离心机分析性超速离心机普通离心机普通离心机冰冻离心机冰冻离心机台式（或台式（或地面式）地面式）普通离心普通离心机机大容量冰大容量冰冻离心机冻离心机小于小于0.6万万rpm高速冰冻高速冰冻离心机离心机0.6-2.5万万超速冰冻超速冰冻离心机离心机2.5-8万或万或更高更高(分析性超速离心主要用于检测大分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特征和结构等分子物质的沉降特征和结构等)概述概述Back ！离心机一
6、般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。Back一般制备离心一般制备离心一一般般制制备备离离心心是是指指在在分分离离、浓浓缩缩、提提纯纯样样品品中中，不不必必制制备备密密度度梯梯度度的的一一次次完完成成的的离离心心操操作作，实实验验室室用用低、高速离心机可应用于此项技术。低、高速离心机可应用于此项技术。台式或地面式普通离心机台式或地面式普通离心机Back高速冰冻离心机高速冰冻离心机Back 从从低低速速到到高高速速逐逐级级沉沉淀淀分分离离，使使较较大大的的颗颗粒粒先先在在较较低低转转速速中中沉沉淀淀，
7、再再用用较较高高转转速速将将原原先先悬悬浮浮在在上上清清液液中中的的较较小小颗颗粒粒分分离离沉沉淀淀下下来来，从从而而使使各各种亚细胞组分得以分离。种亚细胞组分得以分离。差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。其其优优点点是是：操操作作简简单单，离离心心后后用用倾倾倒倒法法即即可可将将上上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺缺点点是是：分分离离效效果果差差，不不能能一一次次得得到到纯纯颗颗粒粒；壁壁效效应应严严重重，特特别别是是当当颗颗粒粒很很大大或或浓浓度度很很高高时时，在在离离心心管管一一侧侧会会出出现现
8、沉沉淀淀；颗颗粒粒被被挤挤压压，离离心心力力过过大大、离离心心时时间间过过长长会会使使颗颗粒粒变变形形、聚聚集集而而失失活。活。细胞器沉降顺序依次为：核、线粒体、溶酶体核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体。差速离心法：差速离心法：Low speedHigh speed差数离心法差数离心法Back密度梯度离心法：密度梯度离心法：用具有梯度的介质来替换离心管中密度均一用具有梯度的介质来替换离心管中密度均一的介质，使介质分为不同的层次，浓度低的在上层，的介质，使介质分为不同的层次，浓度低的在上层，高的在底层。细胞匀浆加在最上层，随后离心。
9、这高的在底层。细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大小、形态、密度的颗粒，就会以不同的样，不同大小、形态、密度的颗粒，就会以不同的速度向下移动，击中到不同的区域，可以分别收集速度向下移动，击中到不同的区域，可以分别收集。该法的优点是：该法的优点是：分离效果好，可一次获得较纯颗分离效果好，可一次获得较纯颗粒；粒；适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗粒不会颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。由于对流而引起混
10、合。缺点：缺点：离心时间较长；离心时间较长；需要制备梯度；需要制备梯度；操操作严格，不宜掌握。作严格，不宜掌握。Back 将将离离心心机机转转数数换换算算为为相对离心力时，相对离心力时，首首先先，在在 r r标标尺尺上上取取已已知知的的半半径径和和在在 N N 标标尺尺上上取已知的离心机转数。取已知的离心机转数。然然后后，将将这这两两点点间间划划一一条条直直线线，在在图图中中间间 RCFRCF标标尺尺上上的的交交叉叉点点即即为为相相应的相对离心力数值。应的相对离心力数值。注注意意，若若已已知知的的转转数数值值处处于于 N N 标标尺尺的的右右边边，则则应应读读取取 RCF RCF 标标尺尺右右
11、边边的的数数值值；同同样样，转转数数值值处处于于 N N 标标尺尺左左边边，则则读读取取 RCFRCF标尺左边的数值。标尺左边的数值。半径半径相对离心力相对离心力转速转速方法：方法：两点一两点一线法线法Back应急处理：应急处理：如果离心时发现离心管破裂，必须先停止实验，将破裂管如果离心时发现离心管破裂，必须先停止实验，将破裂管密封放入生物垃圾桶，再用密封放入生物垃圾桶，再用75%75%酒精进行擦拭消毒，如必要需酒精进行擦拭消毒，如必要需用移动紫外灯照射用移动紫外灯照射30306060分钟后才能开始实验。分钟后才能开始实验。注意事项：注意事项：a a）离心机应始终处于水平位置，与外接电源电压匹
12、配，并要求）离心机应始终处于水平位置，与外接电源电压匹配，并要求有良好的接地线。有良好的接地线。b b）开机前应检查机腔有无异物掉入。注意事项：）开机前应检查机腔有无异物掉入。注意事项：c c）样品应预先平衡，使用离心机微量离心时离心套管与样品应）样品应预先平衡，使用离心机微量离心时离心套管与样品应同时平衡。同时平衡。d d）挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保）挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免侵蚀机腔或造成事故。液体不外漏以免侵蚀机腔或造成事故。e e）每次操作完毕，应做好使用情况记录，应定期对机器各项性）每次操作完毕，应做好使用情况记录，应
13、定期对机器各项性能进行检修。能进行检修。f f）离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术）离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员检修。人员检修。Back玉米黄化幼苗线粒体的分离（整个过程保持在玉米黄化幼苗线粒体的分离（整个过程保持在0-0-4 4）1.1.将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约5g5g，在冰箱中放置，在冰箱中放置1 1小小时时2.2.将幼苗剪碎直接倒入研钵中以将幼苗剪碎直接倒入研钵中以1:3(1:3(重量体积比重量体积比g:ml)g:ml)比例加比例加入离心匀浆介质，快速研磨，注意先加入少许介质液，研入离心匀浆介质，快
14、速研磨，注意先加入少许介质液，研碎后将余液加入碎后将余液加入3.3.用双层尼龙网过滤，除去残渣。用双层尼龙网过滤，除去残渣。4.4.取滤液在低温高速离心机伤取滤液在低温高速离心机伤2300rpm2300rpm离心离心10min10min弃沉淀弃沉淀5.5.取上清液在低温高速离心机上取上清液在低温高速离心机上9950rpm9950rpm离心离心10min10min弃上清弃上清液液6.6.所留沉淀用匀浆介质液洗涤，以所留沉淀用匀浆介质液洗涤，以9950rpm9950rpm离心离心10min10min弃上弃上清清7.7.将所得沉淀悬浮于将所得沉淀悬浮于0.5M0.5M，ph=7.2ph=7.2甘露醇
15、中，至于冰箱备用。甘露醇中，至于冰箱备用。8.8.将制备的线粒体悬液滴于干净的载玻片上用将制备的线粒体悬液滴于干净的载玻片上用1%1%詹纳斯绿詹纳斯绿B B的的0.25M0.25M蔗糖液（蔗糖液（ph=7.4ph=7.4）染色）染色20min20min9.9.加干净的盖玻片。镜检最好用相差显微镜，所有的线粒体加干净的盖玻片。镜检最好用相差显微镜，所有的线粒体都被染成蓝绿色颗粒，检验制备的线粒体的纯度都被染成蓝绿色颗粒，检验制备的线粒体的纯度实验方法实验方法菠菜叶叶绿体的分离（整个过程保持菠菜叶叶绿体的分离（整个过程保持0 0 ）1 1取去叶脉的的新鲜菠菜叶取去叶脉的的新鲜菠菜叶5g5g于研钵中
16、，加入于研钵中，加入0.35mol/L NaCl0.35mol/L NaCl溶液溶液15ml15ml研磨。注意开始研磨时研磨。注意开始研磨时也是先加入少许介质，研磨后加入余液也是先加入少许介质，研磨后加入余液2 2绿色的匀浆液用尼龙网过滤，滤液分别转入两支干绿色的匀浆液用尼龙网过滤，滤液分别转入两支干净的离心管中，以净的离心管中，以1000rpm1000rpm离心离心4min4min，除去沉淀。，除去沉淀。3 3上清液在高速低温离心机上以上清液在高速低温离心机上以3000rpm3000rpm离心离心5min5min，所得的沉淀是叶绿体，所得的沉淀是叶绿体4 4用用0.35mol/L NaCl 0.35mol/L NaCl 溶液稀释，放置于冰箱中保存。溶液稀释，放置于冰箱中保存。在干净的载玻片上滴加叶绿体悬液，加盖玻片在显在干净的载玻片上滴加叶绿体悬液，加盖玻片在显微镜下光差叶绿体的形态微镜下光差叶绿体的形态Back