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1、会计学1细胞器的分级分离细胞器的分级分离 目的要求目的要求目的要求目的要求 n n1 1掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。n n2 2 2 2熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离和和和和 纯化的实验方法。纯化的实验方法。纯化的实验方法。纯化的实验方法。第1页/共13页 实验原理实验原理实验原理实验原理 球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质球形颗粒的沉降速率取决于其密
2、度、半径、介质球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。黏度和离心力。黏度和离心力。黏度和离心力。差速离心法（差速离心法（差速离心法（差速离心法（differential centrifugationdifferential centrifugation）是将细是将细是将细是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心沉淀上大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心沉淀上
3、大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心沉淀上大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心沉淀上清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的目的。目的。目的。目的。密度梯度离心法（密度梯度离心法（密度梯度离心法（密度梯度离心法（density gradient density gradient centrifugationcentrifugation）是一定介质形成一连续或不连续的是一定介质形成一连续或不连续的是一定介质形成一连续或不连续的是一定介质形成一连续或不连续的密
4、度梯度，顶部的细胞匀浆在重力或离心力场的作密度梯度，顶部的细胞匀浆在重力或离心力场的作密度梯度，顶部的细胞匀浆在重力或离心力场的作密度梯度，顶部的细胞匀浆在重力或离心力场的作用下分层、分离。用下分层、分离。用下分层、分离。用下分层、分离。一般先通过差速离心法将细胞器初步分离，再进一般先通过差速离心法将细胞器初步分离，再进一般先通过差速离心法将细胞器初步分离，再进一般先通过差速离心法将细胞器初步分离，再进一步通过密度梯度离心法分离纯化细胞器。一步通过密度梯度离心法分离纯化细胞器。一步通过密度梯度离心法分离纯化细胞器。一步通过密度梯度离心法分离纯化细胞器。第2页/共13页 细胞器的分离常通过细胞器
5、的分离常通过细胞器的分离常通过细胞器的分离常通过组织细胞匀浆组织细胞匀浆组织细胞匀浆组织细胞匀浆、分级分级分级分级分离分离分离分离和和和和分析分析分析分析三个步骤完成。三个步骤完成。三个步骤完成。三个步骤完成。分级分离方法有两种，即：分级分离方法有两种，即：分级分离方法有两种，即：分级分离方法有两种，即：差速离心法差速离心法差速离心法差速离心法和和和和密度梯度离心法密度梯度离心法密度梯度离心法密度梯度离心法。第3页/共13页 实验用品实验用品实验用品实验用品 1 1器具：器具：器具：器具：玻璃匀浆器、低速离心机、高速冷冻离心机、玻璃匀浆器、低速离心机、高速冷冻离心机、玻璃匀浆器、低速离心机、高
6、速冷冻离心机、玻璃匀浆器、低速离心机、高速冷冻离心机、天平、普通光学显微镜、天平、普通光学显微镜、天平、普通光学显微镜、天平、普通光学显微镜、1.5 ml Ep1.5 ml Ep1.5 ml Ep1.5 ml Ep管、载玻片、管、载玻片、管、载玻片、管、载玻片、10 10 10 10 mlmlmlml滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、20 ml20 ml20 ml20 ml烧杯。烧杯。烧杯。烧杯。2 2 2 2材料：材料：材料：材料：大白鼠。大白鼠。大白鼠。大白鼠。3 3 3 3试剂：试剂：试剂：试剂：生理盐
7、水、生理盐水、生理盐水、生理盐水、PBSPBSPBSPBS、0.25 mol/L0.25 mol/L0.25 mol/L0.25 mol/L的蔗糖溶液、的蔗糖溶液、的蔗糖溶液、的蔗糖溶液、0.34 mol/L0.34 mol/L0.34 mol/L0.34 mol/L蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖-0.5 mmol/L Mg(Ac)-0.5 mmol/L Mg(Ac)-0.5 mmol/L Mg(Ac)-0.5 mmol/L Mg(Ac)2 2 2 2溶液、溶液、溶液、溶液、0.88 0.88 0.88 0.88 mol/Lmol/Lmol/Lmol/L蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖-0.5 mmol/L Mg(Ac)-
8、0.5 mmol/L Mg(Ac)-0.5 mmol/L Mg(Ac)-0.5 mmol/L Mg(Ac)2 2 2 2溶液、溶液、溶液、溶液、95959595乙醇、甲乙醇、甲乙醇、甲乙醇、甲基绿基绿基绿基绿-派洛宁染液、丙酮、派洛宁染液、丙酮、派洛宁染液、丙酮、派洛宁染液、丙酮、0.20.20.20.2的詹纳斯绿的詹纳斯绿的詹纳斯绿的詹纳斯绿B B B B。第4页/共13页 实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤 1 1组织匀浆制备组织匀浆制备（1 1）取材）取材 将空腹将空腹121224 h24 h的大鼠处死。剖开腹部，的大鼠处死。剖开腹部，迅速取出肝脏，用预冷的生理盐水洗净血污，用迅速取出肝脏
9、，用预冷的生理盐水洗净血污，用 滤纸吸干。滤纸吸干。（2 2）制备匀浆）制备匀浆 称取约称取约1 12 g2 g左右的肝组织，用预冷左右的肝组织，用预冷 的的0.25 mol/L0.25 mol/L的蔗糖溶液冲洗数次，剪碎。以预的蔗糖溶液冲洗数次，剪碎。以预 冷的冷的0.25 mol/L0.25 mol/L的蔗糖溶液悬浮剪碎的组织，移的蔗糖溶液悬浮剪碎的组织，移 入匀浆器内，在冰浴条件下匀浆。匀浆完成后，入匀浆器内，在冰浴条件下匀浆。匀浆完成后，用滤网过滤，即制得肝细胞匀浆，备用。用滤网过滤，即制得肝细胞匀浆，备用。第5页/共13页2.2.细胞器的分级分离细胞器的分级分离(1)(1)细胞核的分
10、离：细胞核的分离：第一次第一次:1000rpm,8min:1000rpm,8min。(2)(2)细胞核的纯化细胞核的纯化 在沉淀中加入在沉淀中加入0.34mo1/L0.34mo1/L蔗糖蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)-0.5mmol/L Mg(Ac)2 2至至2ml2ml，混悬。用长针头注射器在混悬液下轻轻加入，混悬。用长针头注射器在混悬液下轻轻加入2ml 2ml 的的0.88mo1/L0.88mo1/L蔗糖蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)-0.5mmol/L Mg(Ac)2 2溶液。溶液。尽量使两尽量使两种溶液明显分层种溶液明显分层。2000rpm2000rpm离心离心8min
11、8min。加加0.25M0.25M蔗糖至蔗糖至4ml4ml，混匀，混匀第二次第二次:1300rpm,8min:1300rpm,8min。弃上清。弃上清上清保留于上清保留于EpEp管管1.01.0处处第6页/共13页显微镜下观察结果显微镜下观察结果显微镜下观察结果显微镜下观察结果(3)(3)(3)(3)细胞核鉴定：细胞核鉴定：细胞核鉴定：细胞核鉴定：。分色分色:快速放入丙酮中，蒸馏水漂洗，擦干水分快速放入丙酮中，蒸馏水漂洗，擦干水分固定：浸入固定：浸入9595的乙醇溶液的乙醇溶液5min5min，晾干，晾干染色：滴加甲基绿染色：滴加甲基绿-派洛宁染液染色派洛宁染液染色15min15min涂片：在
12、离心后的沉淀中加入几滴涂片：在离心后的沉淀中加入几滴PBSPBS，混，混匀后涂片，空气干燥匀后涂片，空气干燥第7页/共13页(4)(4)线粒体的分离线粒体的分离 将分离细胞核时收集的上清以将分离细胞核时收集的上清以10000 g 10000 g 离心离心10 10 minmin，将上清移入，将上清移入1.5 ml Ep1.5 ml Ep管内并置冰上或管内并置冰上或44冰箱待冰箱待用。沉淀用用。沉淀用0.25 mol/L0.25 mol/L的蔗糖溶液重悬后，的蔗糖溶液重悬后，10000 g10000 g离心离心10 min10 min，重复，重复1 1次，取沉淀。次，取沉淀。第8页/共13页(2
13、)(2)线粒体的鉴定线粒体的鉴定 于洁净载玻片上滴于洁净载玻片上滴1 1滴滴0.020.021 1的詹纳斯的詹纳斯绿绿B B染液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中，染液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中，染色染色5 510 min10 min，盖上盖玻片，镜检。，盖上盖玻片，镜检。第9页/共13页 结果与分析结果与分析结果与分析结果与分析 光学显微镜下观察，细胞核经甲基绿光学显微镜下观察，细胞核经甲基绿光学显微镜下观察，细胞核经甲基绿光学显微镜下观察，细胞核经甲基绿-派洛派洛派洛派洛宁染色，宁染色，宁染色，宁染色，DNADNADNADNA呈蓝绿色，核仁和胞质呈蓝绿色，核仁和胞质呈蓝绿色，核
14、仁和胞质呈蓝绿色，核仁和胞质RNARNARNARNA呈红色。呈红色。呈红色。呈红色。观察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经观察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经观察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经观察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经詹纳斯绿詹纳斯绿詹纳斯绿詹纳斯绿B B B B染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸酶显示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征，酶显示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征，酶显示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征，酶显示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征
15、，但可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果但可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果但可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果但可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果分离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征，而分离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征，而分离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征，而分离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征，而且没有其他组分的污染，则证明分离操作成功，且没有其他组分的污染，则证明分离操作成功，且没有其他组分的污染，则证明分离操作成功，且没有其他组分的污染，则证明分离操作成功，反之则为失败。反之则为失败。反之则为失败。反之则为失败。第10页/共13页 注意事项注意事项注
16、意事项注意事项 n n1 1 1 1组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破 碎，又要尽量快速。碎，又要尽量快速。碎，又要尽量快速。碎，又要尽量快速。n n2 2 2 2在细胞器分离过程中，所有操作应尽可在细胞器分离过程中，所有操作应尽可在细胞器分离过程中，所有操作应尽可在细胞器分离过程中，所有操作应尽可 能在能在能在能在1 1 1 14444下进行。下进行。下进行。下进行。n n3 3 3 3实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操实验过程应注意保持细胞器的
17、完整性，避免操实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操 作过于剧烈。另线粒体进行的是活体染色，要作过于剧烈。另线粒体进行的是活体染色，要作过于剧烈。另线粒体进行的是活体染色，要作过于剧烈。另线粒体进行的是活体染色，要 求样品制备好后尽快染色。求样品制备好后尽快染色。求样品制备好后尽快染色。求样品制备好后尽快染色。第11页/共13页 作业与思考题作业与思考题作业与思考题作业与思考题 n n1 1 1 1分别在高倍镜和油镜下观察细胞核和线粒分别在高倍镜和油镜下观察细胞核和线粒分别在高倍镜和油镜下观察细胞核和线粒分别在高倍镜和油镜下观察细胞核和线粒 体，并绘制其结构图。体，并绘制其结构图。体，并绘制其结构图。体，并绘制其结构图。n n2 2 2 2简述细胞器分级分离的实验原理和主要步简述细胞器分级分离的实验原理和主要步简述细胞器分级分离的实验原理和主要步简述细胞器分级分离的实验原理和主要步 骤？骤？骤？骤？n n3 3 3 3实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得 细胞器的含量和纯度？细胞器的含量和纯度？细胞器的含量和纯度？细胞器的含量和纯度？第12页/共13页