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1、细胞器的分离、纯化细胞器的分离、纯化 细胞分级分离法细胞分级分离法实验目的实验目的实验原理实验原理实验用品实验用品实验方法实验方法应用范围：应用范围：1.病毒及病毒及亚细胞胞 组份分离份分离 2.蛋白梯度分离蛋白梯度分离 3.脂蛋白分离脂蛋白分离 4.RNA梯度沉淀梯度沉淀 5.质粒粒DNA提提纯 Back认识离心机及学习离心机的使用方法学习细胞器的分离及纯化的一般原理和方法实验实验目的目的Back实验实验原理原理 离心技离心技术术是借助于离心机旋是借助于离心机旋转转所所产产生的离心生的离心力，根据物力，根据物质颖质颖粒的沉降系数、粒的沉降系数、质质量、密度及浮量、密度及浮力等因子的不同，而使
2、物力等因子的不同，而使物质质分离的分离分析技分离的分离分析技术术。细细胞分胞分级级分离式一种通分离式一种通过过离心从而分离离心从而分离细细胞胞内不同内不同结结构成分的构成分的细细胞器。不同的胞器。不同的细细胞器的大小胞器的大小和密度不同，在同一离心和密度不同，在同一离心场场内的沉降速度不同，内的沉降速度不同，用差速离心法、密度梯度离心法、密度梯度平衡用差速离心法、密度梯度离心法、密度梯度平衡离心法分离离心法分离细细胞器。胞器。差速离心法是从低到高不同的差速离心法是从低到高不同的转转速离心，使速离心，使较较大的大的颗颗粒先在低粒先在低转转速中沉淀，再用速中沉淀，再用较较高高转转速将速将原来原来悬
3、悬浮的小浮的小颗颗粒物粒物质质沉淀下来，从而达到逐沉淀下来，从而达到逐级级分离。分离。相对离心力（RCF）v由由于于转转头头有有不不同同的的制制造造商商制制造造，半半径径不不同同，故故用用相相对对离离心心力来表示离心力的大小。力来表示离心力的大小。vRCF(g)=Fc/F重力重力=mG/mg=r2/g=1.11910-5N2r=11.2r(N/1000)2也有：也有：根根据据这这个个公公式式，相相对对离离心心力力（RCF）和和每每分分钟钟转转数数（N）之之间便可以互换，这种互换关系是很有实用价值的。间便可以互换，这种互换关系是很有实用价值的。Back为了简便为了简便实验实验用品用品1.1.材料
4、：新材料：新鲜鲜菠菜菠菜2.2.器材：器材：显显微微镜镜、高速低温离心机、普通离心机、离心、高速低温离心机、普通离心机、离心管、管、200200目的尼目的尼龙龙网、漏斗、网、漏斗、烧烧杯、杯、组织组织研磨器。研磨器。3.3.试剂试剂：线线粒体离心匀粒体离心匀浆浆介介质质。1%1%詹詹纳纳斯斯绿绿B B的的0.25M0.25M蔗糖溶液。蔗糖溶液。0.05M Tris-HCl0.05M Tris-HCl液体液体 Ph=8.0Ph=8.0 0.35mol/L NaCl 0.35mol/L NaCl Back匀匀浆介介质，一般，一般为一定一定浓度的蔗糖溶液加入其它度的蔗糖溶液加入其它离子成分，可以离子
5、成分，可以维持持亚细胞胞组分的渗透分的渗透压。台式高、超台式高、超速离心机速离心机0.6-10万万rpm离心机离心机制制备性性分析性分析性分析性超速离心机分析性超速离心机普通离心机普通离心机冰冰冻离心机离心机台式（或台式（或地面式）地面式）普通离心普通离心机机大容量冰大容量冰冻离心机离心机小于小于0.6万万rpm高速冰高速冰冻离心机离心机万万超速冰超速冰冻离心机离心机2.5-8万或万或更高更高(分析性超速离心主要用于分析性超速离心主要用于检测大大分子物分子物质的沉降特征和的沉降特征和结构等构等)概述概述Back ！离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。离心机一般由离心机主机，离心机一
6、般由离心机主机，转头，离心管三部分，离心管三部分组成成。Back一般制一般制备离心离心一一般般制制备离离心心是是指指在在分分离离、浓缩、提提纯样品品中中，不不必必制制备密密度度梯梯度度的的一一次次完完成成的的离离心心操操作作，实验室室用用低、高速离心机可低、高速离心机可应用于此用于此项技技术。台式或地面式普通离心机台式或地面式普通离心机Back高速冰高速冰冻离心机离心机Back 从从低低速速到到高高速速逐逐级级沉沉淀淀分分离离，使使较较大大的的颗颗粒粒先先在在较较低低转转速速中中沉沉淀淀，再再用用较较高高转转速速将将原原先先悬悬浮浮在在上上清清液液中中的的较较小小颗颗粒粒分分离离沉沉淀淀下下来
7、来，从从而而使使各各种种亚细亚细胞胞组组分得以分离。分得以分离。差速离心法主要用于分离差速离心法主要用于分离细细胞器和病毒。胞器和病毒。其其优优点点是是：操操作作简简单单，离离心心后后用用倾倾倒倒法法即即可可将将上上清夜与沉淀分开，并可使用容量清夜与沉淀分开，并可使用容量较较大的角式大的角式转转子。子。缺缺点点是是：分分离离效效果果差差，不不能能一一次次得得到到纯纯颗颗粒粒；壁壁效效应应严严重重，特特别别是是当当颗颗粒粒很很大大或或浓浓度度很很高高时时，在在离离心心管管一一侧侧会会出出现现沉沉淀淀；颗颗粒粒被被挤挤压压，离离心心力力过过大大、离离心心时时间间过过长长会会使使颗颗粒粒变变形形、聚
8、聚集集而而失失活。活。细胞器沉降顺序依次为：核、线粒体、溶酶体核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体。差速离心法：差速离心法：Low speedHigh speed差数离心法差数离心法Back密度梯度离心法：密度梯度离心法：用具有梯度的介用具有梯度的介质来替来替换离心管中密度均一离心管中密度均一的介的介质，使介，使介质分分为不同的不同的层次，次，浓度低的在上度低的在上层，高的在底高的在底层。细胞匀胞匀浆加在最上加在最上层，随后离心。，随后离心。这样，不同大小、形，不同大小、形态、密度的、密度的颗粒，就会以不同的粒，就会以不同的速度向下
9、移速度向下移动，击中到不同的区域，可以分中到不同的区域，可以分别收集收集。该法的法的优点是：点是：分离效果好，可一次分离效果好，可一次获得得较纯颗粒；粒；适适应范范围广，既能分离具有沉淀系数差的广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；粒；颗粒不会粒不会积压变形，能保持形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区粒活性，并防止已形成的区带由于由于对流而引起混合。流而引起混合。缺点：缺点：离心离心时间较长；需要制需要制备梯度；梯度；操操作作严格，不宜掌握。格，不宜掌握。Back 将将离离心心机机转数数换算算为相相对离心力离心力时，首首先先，在在 r标尺尺
10、上上取取已已知知的的半半径径和和在在 N 标尺尺上上取已知的离心机取已知的离心机转数。数。然然后后，将将这两两点点间划划一一条条直直线，在在图中中间 RCF标尺尺上上的的交交叉叉点点即即为相相应的相的相对离心力数离心力数值。注注意意，若若已已知知的的转数数值处于于 N 标尺尺的的右右边，则应读取取 RCF 标尺尺右右边的的数数值；同同样，转数数值处于于 N 标尺尺左左边，则读取取 RCF标尺左尺左边的数的数值。半径半径相对离心力相对离心力转速转速方法：方法：两点一两点一线法法Back应应急急处处理：理：如果离心如果离心时发现时发现离心管破裂，必离心管破裂，必须须先停止先停止实验实验，将破裂管，
11、将破裂管密封放入生物垃圾桶，再用密封放入生物垃圾桶，再用75%75%酒精酒精进进行擦拭消毒，如必要需行擦拭消毒，如必要需用移用移动动紫外灯照射紫外灯照射30306060分分钟钟后才能开始后才能开始实验实验。注意事注意事项项：a a）离心机）离心机应应始始终处终处于水平位置，与外接于水平位置，与外接电电源源电压电压匹配，并要求匹配，并要求有良好的接地有良好的接地线线。b b）开机前）开机前应检查应检查机腔有无异物掉入。注意事机腔有无异物掉入。注意事项项：c c）样样品品应预应预先平衡，使用离心机微量离心先平衡，使用离心机微量离心时时离心套管与离心套管与样样品品应应同同时时平衡。平衡。d d）挥发
12、挥发性或腐性或腐蚀蚀性液体离心性液体离心时时，应应使用使用带带盖的离心管，并确保盖的离心管，并确保液体不外漏以免侵液体不外漏以免侵蚀蚀机腔或造成事故。机腔或造成事故。e e）每次操作完）每次操作完毕毕，应应做好使用情况做好使用情况记录记录，应应定期定期对对机器各机器各项项性性能能进进行行检检修。修。f f）离心）离心过过程中若程中若发现发现异常异常现现象，象，应应立即关立即关闭电闭电源，源，报请报请有关技有关技术术人人员检员检修。修。Back玉米黄化幼苗玉米黄化幼苗线线粒体的分离（整个粒体的分离（整个过过程保持在程保持在0-0-4 4）1.1.将玉米黄化幼苗剪下，称重每小将玉米黄化幼苗剪下，称
13、重每小组约组约5g5g，在冰箱中放置，在冰箱中放置1 1小小时时2.2.将幼苗剪碎直接倒入研将幼苗剪碎直接倒入研钵钵中以中以1:3(1:3(重量体重量体积积比比g:ml)g:ml)比例加比例加入离心匀入离心匀浆浆介介质质，快速研磨，注意先加入少，快速研磨，注意先加入少许许介介质质液，研液，研碎后将余液加入碎后将余液加入3.3.用双用双层层尼尼龙龙网网过滤过滤，除去残渣。，除去残渣。4.4.取取滤滤液在低温高速离心机液在低温高速离心机伤伤2300rpm2300rpm离心离心10min10min弃沉淀弃沉淀5.5.取上清液在低温高速离心机上取上清液在低温高速离心机上9950rpm9950rpm离心
14、离心10min10min弃上清弃上清液液6.6.所留沉淀用匀所留沉淀用匀浆浆介介质质液洗液洗涤涤，以，以9950rpm9950rpm离心离心10min10min弃上弃上清清7.7.将所得沉淀将所得沉淀悬悬浮于浮于0.5M0.5M，ph=7.2ph=7.2甘露醇中，至于冰箱甘露醇中，至于冰箱备备用。用。8.8.将制将制备备的的线线粒体粒体悬悬液滴于干液滴于干净净的的载载玻片上用玻片上用1%1%詹詹纳纳斯斯绿绿B B的的0.25M0.25M蔗糖液（蔗糖液（ph=7.4ph=7.4）染色）染色20min20min9.9.加干加干净净的盖玻片。的盖玻片。镜检镜检最好用相差最好用相差显显微微镜镜，所有的
15、，所有的线线粒体粒体都被染成都被染成蓝绿蓝绿色色颗颗粒，粒，检验检验制制备备的的线线粒体的粒体的纯纯度度实验实验方法方法菠菜叶叶菠菜叶叶绿绿体的分离（整个体的分离（整个过过程保持程保持0 0 ）1 1取去叶脉的的新取去叶脉的的新鲜鲜菠菜叶菠菜叶5g5g于研于研钵钵中，加入中，加入0.35mol/L NaCl0.35mol/L NaCl溶液溶液15ml15ml研磨。注意开始研磨研磨。注意开始研磨时时也是先加入少也是先加入少许许介介质质，研磨后加入余液，研磨后加入余液2 2绿绿色的匀色的匀浆浆液用尼液用尼龙龙网网过滤过滤，滤滤液分液分别转别转入两支干入两支干净净的离心管中，以的离心管中，以1000rpm1000rpm离心离心4min4min，除去沉淀。，除去沉淀。3 3上清液在高速低温离心机上以上清液在高速低温离心机上以3000rpm3000rpm离心离心5min5min，所得的沉淀是叶，所得的沉淀是叶绿绿体体4 4用用0.35mol/L NaCl 0.35mol/L NaCl 溶液稀溶液稀释释，放置于冰箱中保存。，放置于冰箱中保存。在干在干净净的的载载玻片上滴加叶玻片上滴加叶绿绿体体悬悬液，加盖玻片在液，加盖玻片在显显微微镜镜下光差叶下光差叶绿绿体的形体的形态态Back