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1、 第五章第五章 分子生物学研究方法（上）分子生物学研究方法（上）本章主要内容本章主要内容l 常见的常见的DNADNA操作技术操作技术l 基因克隆技术简介基因克隆技术简介l 蛋白质组学及研究技术蛋白质组学及研究技术引言引言重组重组重组重组DNADNADNADNA技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件(1)(1)40 40 40 40年代，年代，年代，年代，解决了遗传的物质基础问题。解决了遗传的物质基础问题。解决了遗传的物质基础问题。解决了遗传的物质基础问题。确定了遗确定了遗确定了遗确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是传信息的携带者，即基因的
2、分子载体是传信息的携带者，即基因的分子载体是传信息的携带者，即基因的分子载体是DNADNADNADNA而不是蛋白质。而不是蛋白质。而不是蛋白质。而不是蛋白质。(2)(2)50505050年代，年代，年代，年代，解决了基因的自我复制和世代交替问题。解决了基因的自我复制和世代交替问题。解决了基因的自我复制和世代交替问题。解决了基因的自我复制和世代交替问题。建立了建立了建立了建立了DNADNADNADNA分子的双螺旋结构模型，提出了半保留复制机分子的双螺旋结构模型，提出了半保留复制机分子的双螺旋结构模型，提出了半保留复制机分子的双螺旋结构模型，提出了半保留复制机制。制。制。制。(3)(3)50505
3、050年代末至年代末至年代末至年代末至60606060年代，相继提出了年代，相继提出了年代，相继提出了年代，相继提出了“中心法则中心法则中心法则中心法则”和和和和操纵子学说操纵子学说操纵子学说操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识成功地破译了遗传密码，充分认识成功地破译了遗传密码，充分认识成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达途径。了遗传信息的流动和表达途径。了遗传信息的流动和表达途径。了遗传信息的流动和表达途径。从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。1970年年Mandel和和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处
4、发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收理后，能有效地吸收噬菌体噬菌体DNA。1972年，年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒胞同样能够摄取质粒DNA。基因工程的主要内容或步骤基因工程的主要内容或步骤基因工程的主要内容或步骤基因工程的主要内容或步骤 “分分分分-切切切切-连连连连-转转转转-筛筛筛筛”（1 1 1 1）从基因组中）从基因组中）从基因组中）从基因组中分离分离分离分离、或、或、或、或PCRPCRPCRPCR扩增、或人工合成带有目的扩增、或人工合成带有目的扩增、或人工合成带有目的扩增、或人工合成带有目的基因
5、的基因的基因的基因的DNADNADNADNA片段。片段。片段。片段。（2 2 2 2）用适当的限制酶分别）用适当的限制酶分别）用适当的限制酶分别）用适当的限制酶分别切割切割切割切割适当的适当的适当的适当的载体分子和载体分子和载体分子和载体分子和含有目的含有目的含有目的含有目的基因的基因的基因的基因的DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。（3 3 3 3）将目的基因）将目的基因）将目的基因）将目的基因连接连接连接连接到载体分子上，形成重组到载体分子上，形成重组到载体分子上，形成重组到载体分子上，形成重组DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。（4 4 4 4）将重组）将重组）将
6、重组）将重组DNADNADNADNA分子分子分子分子转移转移转移转移到适当的受体细胞中并增殖。到适当的受体细胞中并增殖。到适当的受体细胞中并增殖。到适当的受体细胞中并增殖。（5 5 5 5）筛选筛选筛选筛选重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克隆重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克隆重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克隆重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。基因工程技术区别于其它技术的基因工程技术区别于其它
7、技术的根本特征根本特征：具：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。能力。19621962年年Arber Arber 发现限制性核酸内切酶，发现限制性核酸内切酶，19671967年年GellertGellert发现了发现了 DNA DNA 连接酶。连接酶。重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶 酶酶 类类 功功能能限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶识别识别并在特定位点切开并在特定位点切开DNADNADNADNA连连接接酶酶通通过过磷酸二磷酸二酯
8、键酯键把两个或多个把两个或多个DNADNA片段片段连连接成一个接成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合聚合酶酶I I（大（大肠肠杆菌）杆菌）按按55到到33方向加入新的核苷酸，方向加入新的核苷酸，补补平平DNADNA双双链链中的缺口中的缺口反反转录转录酶酶按照按照RNARNA分子中的碱基序列，根据碱基互分子中的碱基序列，根据碱基互补补原原则则合成合成DNADNA链链多核苷酸激多核苷酸激酶酶把磷酸基把磷酸基团团加到多聚核苷酸加到多聚核苷酸链链的的5-OH5-OH末端（末端（进进行末端行末端标记标记实验实验或用来或用来进进行行DNADNA的的连连接接末端末端转转移移酶酶在双在双链链核酸的核酸的
9、33末端加上多聚末端加上多聚单单核苷酸核苷酸DNADNA外切外切酶酶IIIIII从从DNADNA链链的的33末端逐个切除末端逐个切除单单核苷酸核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切外切酶酶从从DNADNA链链的的55末端逐个切除末端逐个切除单单核苷酸核苷酸碱性磷酸碱性磷酸酯酯酶酶切除位于切除位于DNADNA链链55或或33末端的磷酸基末端的磷酸基团团 科学家已几乎能随心所欲地把任何科学家已几乎能随心所欲地把任何DNADNA分子切割成一系列不连续的片段，分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开
10、，以供下一步研究。1 DNA1 DNA操作技术操作技术 DNADNA分子的切割与连接分子的切割与连接 核酸分子杂交核酸分子杂交 凝胶电泳凝胶电泳 细胞转化细胞转化 核酸序列分析核酸序列分析 基因的人工合成基因的人工合成 基因的定点突变基因的定点突变 PCR PCR扩增扩增 基因敲除基因敲除1.1 1.1 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳原理：原理：种类：种类：琼脂糖琼脂糖（agaroseagarose）凝胶电泳；凝胶电泳；聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺（polyacrylamidepolyacrylamide）凝胶电泳凝胶电泳用途：用途：鉴定重组鉴定重组DNADNA分子分子 蛋白质与核酸相互作用蛋白质与核酸
11、相互作用 DNA DNA分型分型 DNA DNA核苷酸序列分析核苷酸序列分析 限制酶酶切片段分析限制酶酶切片段分析 限制酶酶切作图限制酶酶切作图 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范围为片段的范围为0.2-50kb0.2-50kb之间之间 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为分辨范围为1-10001-1000个碱基对个碱基对凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度分离分离DNA片段的大小范围（片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖6 00
12、0300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺501 凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。1.2 1.2 转基因方法转基因方法1.2.1 1.2.1 细菌转基因的方法细菌转基因的方法 (1)(1)结合（结合（conjugati
13、onconjugation）(2)(2)转化（转化（transformationtransformation）(常规转化、电转化等常规转化、电转化等)(3)(3)转染（转染（transfectiontransfection）(4)(4)转导（转导（transductiontransduction）1.2.2 1.2.2 动物转基因的方法动物转基因的方法 (1)(1)显微注射法：包括细胞核内和细胞质内注射。显微注射法：包括细胞核内和细胞质内注射。(2)(2)电导转基因法电导转基因法 (3)(3)逆转录病毒介导法逆转录病毒介导法 (4)(4)胚胎干细胞介导法胚胎干细胞介导法 (5)(5)精子载体法
14、精子载体法1.2.3 1.2.3 植物转基因的方法植物转基因的方法 (1)Ti (1)Ti质粒介导质粒介导 (2)(2)电转化法电转化法 (3)(3)基因枪法基因枪法1.3.1 1.3.1 放射性同位素技术放射性同位素技术同位素：同位素：原子序数相同而质量不同的元素。原子序数相同而质量不同的元素。放射性同位素放射性同位素 同位素可分为稳定同位素和不稳同位素可分为稳定同位素和不稳定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生-射线、射线、-射线和射线和-射线等，同时从不稳定同
15、位素射线等，同时从不稳定同位素变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用的是放射性同位素。的是放射性同位素。1.3 1.3 核酸的分子杂交核酸的分子杂交 放射性的衰变类型放射性的衰变类型-射线：带正电荷的高速粒子流射线：带正电荷的高速粒子流-射线：带负电荷的射线：带负电荷的粒子流粒子流-射线：光子流射线：光子流 分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质元素名称元素名称 半衰期半衰期 12.1 12.1年年 5700 5700年年 14.3 14.3天天 87.1 87.1天天 5.8 5.8年年14147
16、 7N +N +1 10 0n n 14146 6C +C +1 11 1H H14146 6C C 14147 7N +N +0 0-1-1e e 2382389292U U 2062068282Pb +8Pb +84 42 2He+6He+60 0-1-1e (te (t1/2 1/2=4.510=4.5109 9a)a)放射性强度的探测放射性强度的探测（1 1）盖革计数器（）盖革计数器（Geiger counter tuberGeiger counter tuber），），闪烁计数器。闪烁计数器。（2 2）放射自显影：）放射自显影：X-X-光乳胶片覆盖于样品，在光乳胶片覆盖于样品，在黑暗
17、中，黑暗中，-70-70，曝光。，曝光。放射性分子的制备放射性分子的制备：核物理，化学，生化反应，：核物理，化学，生化反应，生化分离技术生化分离技术 核酸分子的放射性同位素标记应用举例核酸分子的放射性同位素标记应用举例 利用切口平移技术制备利用切口平移技术制备DNADNA放射性探针放射性探针1.3.2 1.3.2 分子杂交类型分子杂交类型 根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为3 3种类型：种类型：Southern杂交由E.M.Southern于1975年创立。SouthernSouthern杂交：杂交：将将将将DNADNADNADNA分子从电泳凝胶转移至杂交
18、滤膜上，分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，然后与核酸探针进行杂交。然后与核酸探针进行杂交。然后与核酸探针进行杂交。然后与核酸探针进行杂交。NorthernNorthernNorthernNorthern杂交杂交：将将将将RNARNARNARNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，然后与核酸探针进行杂交。然后与核酸探针进行杂交。然后与核酸探针进行杂交。然后与核酸探针进行杂交。WesternWesternWesternWestern杂交杂交：将蛋
19、白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上，将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上，将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上，将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上，然后同放射性同位素然后同放射性同位素然后同放射性同位素然后同放射性同位素125125125125I I I I标记的特定蛋白质进行反应。标记的特定蛋白质进行反应。标记的特定蛋白质进行反应。标记的特定蛋白质进行反应。1.3.3 1.3.3 核酸分子杂交核酸分子杂交复性（退火）：复性（退火）：在一定条件在一定条件下变性的两条单链重新结合下变性的两条单链重新结合为双链的过程为双链的过程杂交：杂交：来源不同的两条单链来源不同的两条单链结合为双链分子的过程。
20、结合为双链分子的过程。核酸探针：核酸探针：指序列或功能特指序列或功能特性已知的标记分子，为双链性已知的标记分子，为双链或单链，长度通常为几十至或单链，长度通常为几十至几百几百bp,bp,包括包括DNADNA探针、探针、RNARNA探探针和针和cDNAcDNA探针。探针。若退火的核酸来自若退火的核酸来自不同的生物有机体，则不同的生物有机体，则所形成的双链分子就被所形成的双链分子就被称为称为杂种核酸分子杂种核酸分子。（1 1）SouthernSouthern杂交（杂交（SouthernSouthern印迹）：印迹）：用适当用适当的限制酶消化待测的限制酶消化待测DNADNA，电泳后，将凝胶浸于碱，电
21、泳后，将凝胶浸于碱性溶液中以变性性溶液中以变性DNADNA，再经毛细作用将变性的，再经毛细作用将变性的DNADNA从凝胶中转移至杂交膜上并固定，然后与放从凝胶中转移至杂交膜上并固定，然后与放射性同位素标记的核酸探针杂交，再经放射自射性同位素标记的核酸探针杂交，再经放射自显影显示杂交结果。该技术可有效地分析基因显影显示杂交结果。该技术可有效地分析基因结构或检测待测结构或检测待测DNADNA样本中是否含有特定的序列。样本中是否含有特定的序列。1)1)电泳电泳:将已酶切的待检将已酶切的待检DNADNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。样品进行琼脂糖凝胶电泳。2)2)转膜转膜:将分离的核酸样品转移到滤膜上（将分
22、离的核酸样品转移到滤膜上（印迹印迹转转移）。移）。3)3)杂交杂交:将滤膜与标记的将滤膜与标记的DNADNA或或RNARNA探针进行杂交。探针进行杂交。印迹法：印迹法：凝胶印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和凝胶印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法。噬菌斑印迹法。杂交膜：杂交膜：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。放射自显影DNA印迹转移探针杂交杂交模式图杂交模式图 某作者用人的一放射性某作者用人的一放射性DNADNA探针与鼠基因组探针与鼠基因组DNADNA进行杂交，在所得到的杂交图谱中，第进行杂交，在所得到的杂交图谱中，第1 1泳道的点泳道的点样处有一略呈拖尾状的放射
23、性杂交斑点；第样处有一略呈拖尾状的放射性杂交斑点；第2 2泳道泳道呈较长的弥散形杂交带；第呈较长的弥散形杂交带；第3 3泳道有泳道有3 3条较清晰的杂条较清晰的杂交条带，上下两条带的显色程度相当，中间的条带交条带，上下两条带的显色程度相当，中间的条带显色最深，约分别为其上下两侧条带的两倍。试分显色最深，约分别为其上下两侧条带的两倍。试分析上述实验结果。析上述实验结果。例题：例题：Southern Southern杂交应用举例杂交应用举例环状芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定环状芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定环状芽孢杆菌环状芽孢杆菌C-2C-2基因启动子探针与重组基因启动子探针与重组DNADNA分子
24、的斑点杂交分子的斑点杂交（2 2）斑点杂交）斑点杂交（Dot blotDot blot）：直接将）：直接将DNADNA样品点在滤样品点在滤膜上使之成为斑点，变性并固定，与探针杂交，放射膜上使之成为斑点，变性并固定，与探针杂交，放射自显影。自显影。检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术（3 3）菌落原位杂交）菌落原位杂交（Hybridization in situ)Hybridization in situ)：又分又分为菌落杂交和空斑杂交。在杂交膜上接种转化子细胞，裂为菌落杂交和空斑杂交。在杂交膜上接种转化子细胞，裂解以释
25、放待检解以释放待检DNADNA，变性并固定，变性并固定DNADNA，与探针杂交，放射自，与探针杂交，放射自显影。显影。用于鉴定阳性重组体。用于鉴定阳性重组体。（4 4）组织原位杂交）组织原位杂交（Tissue in situ hybridizationTissue in situ hybridization）：）：指组织或细胞的原位杂交。经适当处理后，使细胞通透指组织或细胞的原位杂交。经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与性增加，让探针进入细胞内与DNADNA或或RNARNA杂交，以确定探针互杂交，以确定探针互补序列在胞内的空间位置。补序列在胞内的空间位置。Localization
26、 of RNA1.4 1.4 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction(Polymerase Chain Reaction，PCRPCR）PCR PCR技术简史技术简史1.4.1 PCR1.4.1 PCR原理原理 PCR PCR是一种体外无性扩增是一种体外无性扩增DNADNA的实验技的实验技术。待扩增术。待扩增DNADNA片段经高温变性成为单链后，在低温片段经高温变性成为单链后，在低温（如（如5252）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下以每一条单链为模板，由多聚酶催化延伸引物链，分以每一条单链为模板，由多聚酶催化延
27、伸引物链，分别合成一条新链。经过解链、退火和链延伸等多个循别合成一条新链。经过解链、退火和链延伸等多个循环反应，原环反应，原DNADNA片段就可得到大量扩增。片段就可得到大量扩增。注注:TaqTaq来自来自Thermus aquaticusThermus aquaticus PCRPCR仪仪1.4.2 PCR1.4.2 PCR反应体系反应体系 Tmplate DNATmplate DNA DNA Primers DNA Primers dNTPs dNTPs Taq DNA Polymerase Taq DNA Polymerase 10 Buffer 10 Buffer1.4.3 1.4.3
28、 基本反应步骤基本反应步骤 1 1个循环包括个循环包括高温变性、低温退火和中温延伸高温变性、低温退火和中温延伸反应反应。经经n n次循环后次循环后,一个一个DNADNA分子可分子可扩增扩增为为2 2n n个分子。个分子。模板模板DNADNA的变性：模板的变性：模板DNADNA经加热至经加热至9494左右左右一定时间后，使模板一定时间后，使模板DNADNA双链解离，使之成为单双链解离，使之成为单链，以便与引物结合。链，以便与引物结合。Primer 1Primer 2535533 模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板DNADNA经加热经加热变性成单链后，温度降至变性
29、成单链后，温度降至5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链上的互补序列配对结合。单链上的互补序列配对结合。335Primer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase 引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqTaq DNA DNA聚聚合酶的作用下，以合酶的作用下，以dNTPdNTP为反应原料，靶序列为模板，为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则，合成一条新的与模板按碱基配对原则，合成一条新的与模板DNADNA互补的链。互补的链。一般每完成一个循环需一般每完成一个循环需2-42-4分钟，分钟，2-32-3小时就能小
30、时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。1 1个个PCRPCR循环产生循环产生2 2条双链分子条双链分子PCR的基本原理模板DNAPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第2轮结束PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824第第1 1
31、轮扩增轮扩增第第2 2轮扩增轮扩增第第3 3轮扩增轮扩增第第4 4轮扩增轮扩增第第5 5轮扩增轮扩增第第6 6轮扩增轮扩增电泳分析电泳分析PCR设备电泳分析电泳分析（3 3）PCRPCR的应用的应用 反向反向PCRPCR：扩增已知序列旁侧的未知扩增已知序列旁侧的未知DNADNA序列序列 锚定锚定PCR:PCR:用于测定基因结构用于测定基因结构 不对称不对称PCR:PCR:用于扩增某一单链模板用于扩增某一单链模板 RT-PCR(RT-PCR(逆转录逆转录-PCR):-PCR):逆转录联合逆转录联合PCRPCR以扩增以扩增cDNAcDNA 复合复合PCR:PCR:用多对引物同时扩增几条用多对引物同
32、时扩增几条DNADNA片段片段 易错易错PCRPCR：引入引入错配错配碱基，导致随机突变碱基，导致随机突变 荧光定量荧光定量PCR:PCR:用于估计模板用于估计模板DNADNA的浓度的浓度 免疫免疫PCRPCR：扩增抗原扩增抗原-抗体复合物上的抗体复合物上的DNADNA分子分子 原位原位PCRPCR：在组织或细胞标本片上直接进行在组织或细胞标本片上直接进行PCRPCR 微生物微生物PCR:PCR:用于微生物的鉴定和分类用于微生物的鉴定和分类 设计引物应遵循以下原则设计引物应遵循以下原则：引物长度：引物长度：15-30bp15-30bp，常为，常为20nt20nt左右。左右。引物扩增跨度：以引物
33、扩增跨度：以200-500bp200-500bp为宜。为宜。引物碱基：引物碱基：G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%为宜。避免为宜。避免5 5个以上个以上相同碱基的成串排列。相同碱基的成串排列。引物内部应避免出现出现二级结构，避免两条引引物内部应避免出现出现二级结构，避免两条引物间互补。物间互补。引物引物33末端碱基，应与模板单链末端碱基，应与模板单链严格严格配对。配对。引物中具有或能够加上合适的酶切位点。引物中具有或能够加上合适的酶切位点。特异性：与数据库中的其它序列无明显同源性。特异性：与数据库中的其它序列无明显同源性。pPICZpPICZ物理图谱物理图谱 定向克隆应用举例定向
34、克隆应用举例Primer F：5-GCT GAA TTCGAA TTC ATG GGC AAC TCA GCG CTC GAC CTT-3Primer R：5-TGT TCT AGATCT AGA TTA GAC GTT ACC GGC GGC GCC AGT-3 上、下游引物的上、下游引物的55端分别设有端分别设有1 1个个EcoEcoR R 和和1 1个个XbaXba 酶切位点（黑酶切位点（黑体字母表示）及体字母表示）及3 3个保护碱基。个保护碱基。定向克隆应用举例定向克隆应用举例-PCR-PCR引物设计引物设计粗毛栓菌热激蛋白粗毛栓菌热激蛋白cDNA PCRcDNA PCR扩增扩增-引物
35、设计引物设计:5CTTCCACGACGCTATC-/-GAGAGATTCGCCTGCA 35CTTCCACGACGCTATC-/-GAGAGATTCGCCTGCA 3 关于关于PCRPCR引物设计引物设计例题例题1 1：根据以下根据以下cDNAcDNA编码区片段的两末端已知序列，编码区片段的两末端已知序列，如何设计下游引物，以扩增该如何设计下游引物，以扩增该cDNAcDNA片段。片段。例题例题2:2:如何利用网络技术和如何利用网络技术和DNADNA分析软件设计简并引分析软件设计简并引物物,以以PCRPCR扩增某蛋白的扩增某蛋白的cDNA?cDNA?演示演示:(1)(1)登录登录NCBINCBI
36、等网站等网站,收集有关收集有关cDNAcDNA序列信息序列信息;(2)(2)利用利用DNADNA分析软件分析软件(如如,DNAman,DNAman等等)对所收集对所收集的的cDNAcDNA序列进行比对分析序列进行比对分析,利用最保守序列设计引物。利用最保守序列设计引物。再论再论cDNAcDNA3838种种MnPMnP同工酶同工酶cDNAcDNA序序列的同源性比较列的同源性比较右侧右侧1 1列符号表示相应的列符号表示相应的cDNAcDNA序列在序列在GenBankGenBank中的中的登录号登录号 核酸序列分析核酸序列分析:即核酸一级结构的测定。即核酸一级结构的测定。Maxam Maxam、Gi
37、lbertGilbert的化学测定法和的化学测定法和SangerSanger的酶法。的酶法。1.5 1.5 核苷酸序列分析核苷酸序列分析酶法测序酶法测序(Sanger)化学测序法化学测序法(Maxam-Gilbert)待测待测DNA片段片段 待测待测DNA片段片段 次克隆次克隆 5-末端标记末端标记 筛选重组子筛选重组子 链分离链分离 限制酶切限制酶切 模板增殖与纯化模板增殖与纯化 纯化标记的纯化标记的ss-DNA 与引物退火与引物退火 定序反应定序反应 定序反应定序反应 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 真空干燥真空干燥 放射自显影放射自显影 阅读序列和计算机录入阅读序列和计算机录入 核
38、苷酸序列的分析与比较核苷酸序列的分析与比较1.5.1 Sanger1.5.1 Sanger双脱氧核苷酸链终止法双脱氧核苷酸链终止法 （1 1）原理：）原理：双脱氧（双脱氧（2，3）-核苷酸可以象核苷酸可以象2-脱氧核苷脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因链中，但因3 端不具端不具OH基，基，DNA链合成至此终止。由于双脱氧核苷酸在每个链合成至此终止。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出片段测定出核苷酸序列。核苷酸序列。dsDNAdsDNA变性变性与与1 1条标记引物退火条标记
39、引物退火在在4 4个反应管中分别加入个反应管中分别加入dNTPdNTP和和1 1种双脱氧核苷酸种双脱氧核苷酸DNADNA聚合反应聚合反应反应产物变性电泳反应产物变性电泳凝胶干燥凝胶干燥放射自显影放射自显影序列读取。序列读取。（2 2）步骤）步骤双脱氧核苷酸链终止法测序示意图双脱氧核苷酸链终止法测序示意图 双脱氧核苷酸链终止法测序双脱氧核苷酸链终止法测序(Sanger(Sanger法法)原理原理DNA sequencing gel showing the separation of fragments in the four sequencing reactions(one per lane).
40、序列读取方法序列读取方法1 1）每一条带都代表一条以双脱氧核苷酸结尾的单每一条带都代表一条以双脱氧核苷酸结尾的单链核苷酸片段。链核苷酸片段。2 2）从凝胶的正极往负极端直接读取的序列，为从从凝胶的正极往负极端直接读取的序列，为从的新合成的单链序列的新合成的单链序列;而从负极往而从负极往正极直接读取的序列，则为上述序列的反向序正极直接读取的序列，则为上述序列的反向序列列(方向为方向为 )。模板序列则为上述。模板序列则为上述序列的互补序列。序列的互补序列。思考题：思考题：假假定定某某一一基基因因克克隆隆的的部部分分序序列列为为5 5TCACGTAAGT3TCACGTAAGT3，试试根根据据Sang
41、erSanger序序列列分分析析方方法法原原理理画画出出测测定定上上述述序序列列的的放放射射自自显显影影示示意意图图，并并对对示意图作必要的标注和解释。示意图作必要的标注和解释。1.5.2 DNA1.5.2 DNA序列测定的自动化序列测定的自动化 使用自动测序仪使用自动测序仪,使得模板制备自动化、定序反应自动化、使得模板制备自动化、定序反应自动化、凝胶电泳自动化、核苷酸序列阅读与计算机输入自动化。凝胶电泳自动化、核苷酸序列阅读与计算机输入自动化。DNA DNA序列分析自动化包括两个方面的内容序列分析自动化包括两个方面的内容:一一是指是指“分析反应分析反应”的自动化的自动化;另一方面则是指另一方
42、面则是指“读读片过程片过程”的自动化。的自动化。优点：优点：i.i.四个反应系统可合并点样，大大节省制四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和胶和 点样时间。点样时间。ii.ii.可同时读出多个样品核苷酸序可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影。列，不需干燥凝胶和放射自显影。iii.iii.可连续电泳，可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。可读出较多的核苷酸序列。缺点：缺点：无法保留原始记录无法保留原始记录,四个反应产物点在一条四个反应产物点在一条道上道上,相互间会发生干扰相互间会发生干扰,导致读序时分辨率下降。导致读序时分辨率下降。DNA DNA序列测定的自动化序列测定的自动化
43、荧光素标记核苷酸荧光素标记核苷酸应用举例应用举例In DNA sequencing using dideoxynucleotides labeled with fluorescent dyes,all four ddNTPs are added to the same tube,and during primer extension,all combinations of chains are produced.Automated DNA sequencing using fluorescent dyes,one for each base1.6 1.6 基因文库的建立基因文库的建立 克隆（克
44、隆（cloneclone）：）：作名词用，是指具有相同作名词用，是指具有相同DNADNA分分子的一个群体或基因型相同的一个生物群体。作动子的一个群体或基因型相同的一个生物群体。作动词用，指词用，指“进行克隆进行克隆”或或“去克隆去克隆”，将一特定，将一特定DNADNA顺序插入一个载体分子。顺序插入一个载体分子。亚克隆（次克隆，二级克隆，亚克隆（次克隆，二级克隆，sub-clonesub-clone）：）：是指是指从已经克隆在载体中的一个大片段中取出较小的从已经克隆在载体中的一个大片段中取出较小的DNADNA片段再进行克隆的方法。片段再进行克隆的方法。基因文库基因文库(gene library)
45、:(gene library):包括基因组文库和包括基因组文库和cDNAcDNA文库。文库。YAC YAC和和BACBAC文库文库 基因工程基本操作步骤：基因工程基本操作步骤：“分、切、连、转、筛分、切、连、转、筛”基因组文库的构建步骤基因组文库的构建步骤1.6.1 1.6.1 基因组文库基因组文库 基因组文库基因组文库:含有某种生物全部遗传信息的重组含有某种生物全部遗传信息的重组DNADNA分子的克隆总体。分子的克隆总体。基因组文库的规模基因组文库的规模：N=lnN=ln（1p1p）/ln/ln（1-f1-f）上式中，上式中，N N：克隆数；：克隆数；p p：某：某DNADNA片段在基因文库
46、中出现片段在基因文库中出现的概率；的概率；f f：插入片段的平均大小与基因组大小的比值。：插入片段的平均大小与基因组大小的比值。1.6.2 cDNA1.6.2 cDNA文库文库 从一定生长阶段的某种细胞或组织分离得到的总从一定生长阶段的某种细胞或组织分离得到的总mRNAmRNA反反转录成总转录成总cDNAcDNA，插入到克隆载体，然后再将，插入到克隆载体，然后再将cDNAcDNA重组子转移重组子转移到宿主细胞中进行增殖。通过上述方法所获得的无性繁殖系到宿主细胞中进行增殖。通过上述方法所获得的无性繁殖系即为即为cDNAcDNA文库。文库。cDNAcDNA文库构建步骤文库构建步骤 与与cDNAcD
47、NA克隆或文库构建有关的几个问题克隆或文库构建有关的几个问题 l cDNA cDNA的概念：的概念：第一链第一链cDNAcDNA；cDNAcDNA基因；基因；cDNAcDNA编编码序列。码序列。l mRNA mRNA质量的检测：质量的检测：根据根据甲醛变性胶电泳甲醛变性胶电泳的的rRNArRNA的带型进行判定。的带型进行判定。l mRNA mRNA的纯化的纯化：0ligo0ligo（dTdT）-纤维素柱层析；抗纤维素柱层析；抗生物素蛋白生物素蛋白磁珠吸附法磁珠吸附法。生物素标记生物素标记0ligo0ligo（dTdT）。l cDNA cDNA重组子的形成重组子的形成：在在cDNAcDNA双链末
48、端或添加同双链末端或添加同聚物单链尾巴，或添加含适当限制酶识别序列的聚物单链尾巴，或添加含适当限制酶识别序列的“接头接头”（linkerlinker），以便与适当载体重组。），以便与适当载体重组。Trametes gallicaTrametes gallica总总RNARNA的甲醛变性电泳的甲醛变性电泳mRNAmRNA质量的检测质量的检测mRNAmRNA的纯化的纯化Promega PolyPromega PolyPromega PolyPromega Poly（ATATATAT）tract mRNA tract mRNA tract mRNA tract mRNA Isolation Syst
49、emIsolation SystemIsolation SystemIsolation System分分分分离离离离Poly(A)RNAPoly(A)RNAPoly(A)RNAPoly(A)RNA：将将将将用用生物素标记的生物素标记的OligoOligoOligoOligo（dT)dT)dT)dT)与总与总与总与总RNARNARNARNA共温育；加入包被有共温育；加入包被有共温育；加入包被有共温育；加入包被有抗生物素蛋白的微磁抗生物素蛋白的微磁抗生物素蛋白的微磁抗生物素蛋白的微磁球；用磁场吸附球；用磁场吸附球；用磁场吸附球；用磁场吸附Oligo(dT)-mRNAOligo(dT)-mRNAOl
50、igo(dT)-mRNAOligo(dT)-mRNA。cDNA文库构建图解1.7 1.7 分子标记技术分子标记技术 遗传标记遗传标记:是基因型的特殊的易于识别的表现形式，是基因型的特殊的易于识别的表现形式，它是生物分类学、遗传学、育种学、物种起源与进化等研究它是生物分类学、遗传学、育种学、物种起源与进化等研究的主要技术指标之一。包括形态标记、细胞学标记、生化标的主要技术指标之一。包括形态标记、细胞学标记、生化标记和分子标记等。记和分子标记等。分子标记分子标记:分子标记指能反映生物个体或种群之间基分子标记指能反映生物个体或种群之间基因组因组DNADNA差异的差异的DNADNA序列序列。分子标记广