《分子生物学研究方法.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学研究方法.pptx（114页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、2023/3/2115.1 重组重组DNA发展史发展史-三大三大成就成就：1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；1928 FrederickGriffith&1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae(肺炎链球菌)1957年，Heinz Fraenkel-Conrat和B.Singre的杂合病毒实验1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验第1页/共
2、114页2023/3/2122.50年代揭示了年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半分子的双螺旋结构模型和半保留复保留复制机制制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；解决了基因的自我复制和世代交替问题；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&Wilkins第2页/共114页2023/3/2131920年年7月月25日，罗莎琳生于伦敦的一个犹太家庭。日，罗莎琳生于伦敦的一个犹太家庭。1942年，她又到英国煤炭年，她又到英国煤炭应用研究协会从事碳纤维研究。应用研
3、究协会从事碳纤维研究。1951年，伦敦大学国王学院（年，伦敦大学国王学院（KingsCollege）的约翰）的约翰伯纳尔（伯纳尔（JohnRandall）邀请罗莎琳到他那里工作。他的一位研究生对）邀请罗莎琳到他那里工作。他的一位研究生对DNA分子作了初步的分子作了初步的X衍射试验，伯纳尔希望她对实验结果进行深入分析。衍射试验，伯纳尔希望她对实验结果进行深入分析。1952年，罗莎琳得到了年，罗莎琳得到了B型型DNA分子清晰的分子清晰的X衍射图像（衍射图像（DNAPhotograph51），这是一张具有里程碑意义的图像。），这是一张具有里程碑意义的图像。1953年年1月，威尔金斯把这张图片展示月，
4、威尔金斯把这张图片展示给了沃森和克里克。给了沃森和克里克。1962年，沃森、克里克和威尔金斯分享了诺贝尔生理学奖，然而他们在获奖年，沃森、克里克和威尔金斯分享了诺贝尔生理学奖，然而他们在获奖后的演讲中也没有提到罗莎琳。后的演讲中也没有提到罗莎琳。1958年年4月，罗莎琳被病魔夺去了年仅月，罗莎琳被病魔夺去了年仅38岁的生命。岁的生命。第3页/共114页2023/3/2143.50年代末至年代末至60年代，相继提出了年代，相继提出了中心法则中心法则和操纵子学说和操纵子学说,成成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。Jacob an
5、d Monod第4页/共114页2023/3/215两大两大技术保证：技术保证：1.DNA的体外切割和连接的体外切割和连接1962年年Arber发现限制性核酸内切酶，发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了发现了DNA连接酶连接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3535但是，如但是，如果没有分果没有分离和富集离和富集单一单一DNA分分子的技术，子的技术，科学家就科学家就无法对这无法对这类物质进类物质进行直接的行直接的生化分析。生化分析。第5页/共114
6、页2023/3/2161972-Paul Berg,Produced first recombinant DNA using EcoRIEcoRI recognition sites phage DNAEcoRI cuts DNA into fragmentsSticky endSV40 DNAThe two fragments stick together by base pairingDNA ligaseRecombinant DNA第6页/共114页2023/3/217几百碱基对长短的几百碱基对长短的DNADNA片段适于进行精细的物理图谱以及片段适于进行精细的物理图谱以及DNADNA序列
7、分析等；因此序列分析等；因此常选用切点较多的识别位点为常选用切点较多的识别位点为4 4个核苷酸序列的酶。这在建立基因组文库常用的个核苷酸序列的酶。这在建立基因组文库常用的方法方法识别位点为识别位点为6 6个核苷酸序列的限制性内切酶通常产生个核苷酸序列的限制性内切酶通常产生1 1一一10kB10kB长短的限制性寸段，长短的限制性寸段，适于进行较长的适于进行较长的DNADNA分子的物理图谱和包括内含子结构基因以及调控序列在内分子的物理图谱和包括内含子结构基因以及调控序列在内的完整基因的克隆；的完整基因的克隆；第7页/共114页2023/3/218重组DNADNA实验中常见的主要工具酶酶酶 类类功功
8、 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片段连接成一个片段连接成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大肠杆菌）（大肠杆菌）按按55到到33方向加入新的核苷酸，补平方向加入新的核苷酸，补平DNADNA双链中的缺口双链中的缺口反转录酶反转录酶按照按照RNARNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH5-
9、OH末端（进行末端标记实末端（进行末端标记实验或用来进行验或用来进行DNADNA的连接的连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的33末端加上多聚单核苷酸末端加上多聚单核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII从从DNADNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA链链55或或33末端的磷酸基团末端的磷酸基团 到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不分
10、子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。一步研究。第8页/共114页2023/3/219DNADNA片段在体外片段在体外不不具备自我复制具备自我复制能力，能力，要想得到足够量和要想得到足够量和足够纯度的足够纯度的DNADNA，必须将它们连接到必须将它们连接到具备自主复制能力具备自主复制能力的的DNADNA分子上（载分子上（载体上），并转入寄体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。主细胞中进行繁殖。这就是基因克隆，这就是基因克隆，或分子克隆或分子克隆 。第9页/共114页202
11、3/3/2110从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。19701970年年MandelMandel和和HigaHiga发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收有效地吸收噬菌体噬菌体DNADNA。19721972年，年，CohenCohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒能够摄取质粒DNADNA。第10页/共114页2023/3/21111973-Boyer,Cohen&ChangTransform E.coli with r
12、ecombinant plasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycin resistance genePlasmid pSC101Tetracycline resistance geneE.coli transformed with recombinant plasmidTransformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracyclineOnly cells with recombinant plasmid survive to produce coloniesBoyer-C
13、ohen实验：1973年斯坦福大学的S.Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。第11页/共114页2023/3/2112General process of gene engineering(1).(1).从生物有机体基因组中，从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的分离出带有目的基因的DNADNA片段。片段。(2).(2).将带有目的基因的外源将带有目的基
14、因的外源DNADNA片段连片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组载体分子上，形成重组DNADNA分子。分子。(3).(3).将重组将重组DNADNA分子转移到适当的受分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。增殖。(4).(4).从大量的细胞繁殖群体中，筛选出从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组获得了重组DNADNA分子的受体细胞，并筛选分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。出已经得到扩增的目的基因。第12页/共114页2023/3/2113(5).(5).将目的基因克隆到将目的
15、基因克隆到表达载体表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。生长分化刺激因子基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。第13页/共114页2023/3/21142.2.DNADNA的核苷酸序列分析技术的核苷酸序列分析技术 DNADNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的站起来的一
16、门重要的DNADNA技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆的结构与功能的关系，以及克隆DNADNA片断的操作方面，都有着十分广泛的片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。使用价值。19681968年年 华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略SangerSanger在它的基础之上发展了快数测定在它的基础之上发展了快数测定DNADNA的末端终止法的末端终止法第14页/共114页2023/3/2115SangerSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法(dideoxy-termination
17、sequencing)原理原理：双脱氧（：双脱氧（22，33）-核苷酸可以象核苷酸可以象2-2-脱氧核苷酸那样直接掺脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的入新合成的DNADNA链中，但因链中，但因3 3 端不具端不具OHOH基，基，DNADNA链合成至此中断。由于链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个双脱氧核苷酸在每个DNADNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNADNA片段测定出核苷酸序列。片段测定出核苷酸序列。不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来第15页/共114页2023/3/2116AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53添加
18、DNApolymerase所有4dNTPs其中一种标记的ddNTPddTTPddCTPddGTPddATP在四个不同的反应管中各只包含一种ddNTP.第16页/共114页2023/3/2117AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGATreactionCreactionGreactionAreaction每一管中的复制的序列都停留在ddNTPs处5第17页/共114页2023/3/2118反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别
19、进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离.这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基.电泳结构通过显色指示电泳结构通过显色指示.TCGA3CCTTTAGCT5第18页/共114页2023/3/2119过程过程：制备制备ss-DNAss-DNA与引物退火与引物退火分为分为4 4个反应系统个反应系统每个系统中每个系统中加入加入dNTPdNTP（其中其中dATPdATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸DNADNA聚合酶定序反应聚合酶定序反应反应产物变性后电泳反应产物变性后电泳凝胶干燥凝胶干燥放射放射自显影。自显影。该法亦适合该法亦适合m
20、RNAmRNA的序列分析。的序列分析。GCGC富集区常出现富集区常出现“隐影隐影”或或“停止停止”现象，如在反应中加现象，如在反应中加入入dITPdITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-7-脱氧鸟苷可解脱氧鸟苷可解决决GCGC富集区的测序。富集区的测序。第19页/共114页2023/3/2120bMaxam-Gilbert化学修饰法化学修饰法(哈佛大学哈佛大学)该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的基的特异性切割并产生一组
21、具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。片段的核苷酸序列。该反应的关键在于使该反应的关键在于使DNA的的4种核苷酸中，只有种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应：种发生特异性的化学切割反应：碱基的特异性修饰；碱基的特异性修饰；被修饰的碱基从核糖环上转移；被修饰的碱基从核糖环上转移；失去碱基的糖环部位发生失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。链断裂。第20页/共114页2023/3/2121第21页/共114页2023/3/2123第23页/共114页2023/3/21
22、24DNA序列测定的自动化1.DNA测序步骤与自动化1）模板制备可自动化2）定序反应可自动化3）凝胶电泳自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。4）核苷酸序列阅读与计算机输入可自动化2.自动测序仪 Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP）绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP）兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）第24页/共114页2023/3/2125优点优点：i.四
23、个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；ii.可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。缺点缺点：无法保留原始记录：无法保留原始记录,四个反应产物点在一条道上四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰相互间会发生干扰,导致读序时分辨率下降。导致读序时分辨率下降。DNA序列分析自动化包括两个方序列分析自动化包括两个方面的内容，面的内容，一是指一是指“分析反应分析反应”的自动化，的自动化，另一方面
24、则是指另一方面则是指“读片过程读片过程”的的自动化。自动化。第25页/共114页2023/3/2126第26页/共114页2023/3/2127杂交测序自从自从7070年代末期年代末期DNADNA测序技术问世以来，人们已经做了大量重要测序技术问世以来，人们已经做了大量重要的改进，但从根本原理上创新的则只有杂交测序法（的改进，但从根本原理上创新的则只有杂交测序法（s sequencing equencing by hybridizationby hybridization，SBHSBH）一种。它利用一组已知序列的寡核苷一种。它利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶酸短序列作
25、探针，同某一特定的较长的靶DNADNA分子进行杂交，从分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。而测定其核苷酸的序列。DNADNA杂交测序实质上包括两个主要的步骤杂交测序实质上包括两个主要的步骤首先是将待测定的靶首先是将待测定的靶DNADNA分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交，然后与那些能够同靶探针进行杂交，然后与那些能够同靶DNADNA形成完全的双链杂合分子形成完全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶DNADNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。第27页/共114页2023/3/2128如果将一
26、种核苷酸顺序为如果将一种核苷酸顺序为5-5-AGCCTAGCTGAA-3AGCCTAGCTGAA-3的的12-12-mermer的靶的靶DNADNA，与一组完全随机的与一组完全随机的8-8-mermer寡核苷酸探针混合杂交，在总数为寡核苷酸探针混合杂交，在总数为4 48 8=65=65 536536种的种的8-8-mermer探针群体中，仅有探针群体中，仅有5 5种会与靶种会与靶DNADNA形成完全互补的双链形成完全互补的双链体分子。根据这体分子。根据这5 5种发生了完全杂交作用的种发生了完全杂交作用的8-8-mermer寡核苷酸探针之间寡核苷酸探针之间的重叠序列的线性关系，便可推算出这段的重
27、叠序列的线性关系，便可推算出这段12-12-mermer的靶的靶DNADNA分子的核分子的核苷酸顺序。苷酸顺序。当然，这只是一种理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂当然，这只是一种理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂得多，因为那些没有同靶得多，因为那些没有同靶DNADNA片段完全互补的寡核苷酸探针，也仍片段完全互补的寡核苷酸探针，也仍然会与之形成不稳定的双链分子。然会与之形成不稳定的双链分子。第28页/共114页2023/3/2129（基因芯片测序)第29页/共114页2023/3/2130上图是两条长度均为上图是两条长度均为17-17-mermer的靶的靶DNADNA片段片段I I和和III
28、I的杂交测序结果，两者仅在第的杂交测序结果，两者仅在第8 8位碱基有不同，分位碱基有不同，分别为别为C C和和T T。靶靶DNADNA片段片段I I可与可与1818共共8 8段彼此相互重叠的段彼此相互重叠的8-8-mermer寡核苷酸形成完全的双链分子，但不寡核苷酸形成完全的双链分子，但不能与第能与第9 9段段8-8-mermer寡核苷酸形成完全的双链分子。根据相邻的两段寡核苷酸形成完全的双链分子。根据相邻的两段8-8-mermer寡核苷酸之间各自具有寡核苷酸之间各自具有7 7个碱基的重叠情况，可以构建出互补的个碱基的重叠情况，可以构建出互补的DNADNA序列。靶序列。靶DNADNA片段片段I
29、III的杂交结果表明，横跨其第的杂交结果表明，横跨其第8 8位碱位碱基基T T的的6 6段段8-8-mermer寡核苷酸的双链体，由于含有内部的碱基错配，因此其杂交效率明显下降；寡核苷酸的双链体，由于含有内部的碱基错配，因此其杂交效率明显下降；但与但与第第1 1和第和第8 8两段两段8-8-mermer寡聚体形成的具有末端寡聚体形成的具有末端G-TG-T错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。与第错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。与第9 9段段8-8-mermer寡核苷酸能杂交形成完全的双链体分子，寡核苷酸能杂交形成完全的双链体分子，证实与片段证实与片段I I相比，它在第相比，它在第8 8位
30、发生了由位发生了由C C碱基碱基到到T T碱基的变化。碱基的变化。第30页/共114页第31页/共114页2023/3/21325.2.1.15.2.1.1 基本原理基本原理长度不同的核酸分子长度不同的核酸分子也具有几乎一致的电荷也具有几乎一致的电荷-质量比。在一定的电场强度下，质量比。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。如果只在溶液中则不能分离，如果改在凝胶中，则分离得以实现。构型。如果只在溶液中则不能分离，如果改在凝胶中，则分离得以实现。由于在电泳中往往使用无反应活性
31、的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。胺凝胶等，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数，因此，根据分子大小的不已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数，因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。第32页/共114页2023/3/2134
32、第34页/共114页2023/3/2135琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间第35页/共114页2023/3/2136聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间第36页/共114页2023/3/2138在凝胶电泳中，加入适量在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（溴化乙锭（ethidium ethidium bromidebromide，简称简称EtBrEtBr）染料染料对核酸分子进行染色，然对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中快捷地检测出凝
33、胶介质中DNADNA的谱带部位，即使每条的谱带部位，即使每条DNADNA带中仅含有带中仅含有0.050.05g g的的微量微量DNADNA，也可以被清晰地也可以被清晰地检测出来。检测出来。在紫外线的照射下结合溴化乙锭的在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光分子发出荧光第38页/共114页2023/3/2139称样溶解加热制板倒胶电泳操作基本程序第39页/共114页2023/3/2140取样点样电泳检测第40页/共114页2023/3/21411.1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞
34、膨胀（形成原生质球）。便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。处于能够接受外源DNADNA状态的细胞称为感受态细胞。5.2.5.2.2 2 细菌转化步骤：步骤：第41页/共114页2023/3/21422.2.与转化混合物中的外源与转化混合物中的外源DNADNA形成粘附在形成粘附在细胞表面的复合物。细胞表面的复合物。3.3.立即将该体系转移到立即将该体系转移到4242下做短暂的下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。热刺
35、激，复合物便会被细胞所吸收。4.4.在全培养基中生长一段时间使转化基在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复因实现表达、细胞活性恢复5.5.涂布于选择性培养基中分离转化子。涂布于选择性培养基中分离转化子。第42页/共114页2023/3/2143其原理是细菌处于其原理是细菌处于0，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的化混合物中的DNA形成抗形成抗DNase的羟基的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经经42短时间热冲击处理，促使细胞吸收短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基复合物，
36、在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到处理的感受态细胞，其转化率一般能达到51062107转化子转化子/ug质粒质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合的基础上，联合其它的二价金属离子（如其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、）、DMSO或还原剂等物质处或还原剂等物质处理细菌
37、，则可使转化率提高理细菌，则可使转化率提高1001000倍。倍。第43页/共114页2023/3/21445.2.3基因扩增基因扩增聚合酶链式反应，即聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速技术，是一种在体外快速扩增特定基因或扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。外扩增法。DNA DNA 聚合酶聚合酶具有在核苷酸底物的存在下，以一条DNA链为模板催化新链的合成需要具有 3-OH 的引物具有 5 到3 方向聚合的能力通常具有 3到 5 外切酶活性第44页/共114页2023/3/2145PCRCycle-Step1-DenaturationT
38、emplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图模板模板DNA的变性：模板的变性：模板DNA经加热至经加热至93左右一定时间后，使左右一定时间后，使模板模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；以便它与引物结合，为下轮反应作准备；第45页/共114页2023/3/2146PCRCycle-Step2Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSeq
39、uenceTargetSequencePrimer1Primer253553533模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板DNA经加热变性成单链后，温经加热变性成单链后，温度降至度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；第46页/共114页2023/3/2147PCRCycle-Step3-At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequenceP
40、rimer1Primer253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物结引物结合物在合物在TaqDNA聚聚合酶的作用下，以合酶的作用下，以dNTP为反应原料，为反应原料，靶序列为模板，按靶序列为模板，按碱基配对与半保留碱基配对与半保留复制原理，合成一复制原理，合成一条新的与模板条新的与模板DNA链。链。第47页/共114页2023/3/2148Endofthe1stPCRCycleResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个每完成一个循环需循环需24分钟，
41、分钟，23小时就能将小时就能将待扩目的基待扩目的基因扩增放大因扩增放大几百万倍。几百万倍。第48页/共114页2023/3/2149TargetAmplificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon第49页/共114页2023/3/2150
42、PCR仪第50页/共114页2023/3/21515.2.4实时定量实时定量PCRSYBR Green I SYBR Green I 与与dsDNA dsDNA 结合荧光信号会结合荧光信号会增强增强800-1000800-1000倍，用倍，用SYBR Green ISYBR Green I染色的凝染色的凝胶样品荧光信号强，背胶样品荧光信号强，背景信号低。可适用于多景信号低。可适用于多种电泳分析。种电泳分析。第51页/共114页2023/3/2152反向反向PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常
43、规扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCRPCR扩增的是已知序列的两引物之间扩增的是已知序列的两引物之间DNADNA片段片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段切酶对该段DNADNA进行酶切，然后用连接酶使带进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行的引物进行PCRPCR，其扩增产物将含有两引物外其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究未知序列，从而对未知序进行分析研究.反向反向PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)第
44、52页/共114页2023/3/2153(1)、任一、任一DNA序列在文库中出现的概率：序列在文库中出现的概率：N:该序列需要克隆的总数；该序列需要克隆的总数；p:待克隆待克隆DNA序列在文库中设定的出现概率，一般为序列在文库中设定的出现概率，一般为99；I：待克隆待克隆DNA片段的长度，假定为片段的长度，假定为17kb;G:基因组基因组DNA的总长度，如人类为的总长度，如人类为3109bp5.2.5 基因组文库5.2.5.15.2.5.1文库大小文库大小第53页/共114页2023/3/2154将数据代入上式将数据代入上式=8.1105N的含义是克隆大小为的含义是克隆大小为17kb的人类的人
45、类DNA时，所构建的基因文库数必须在时，所构建的基因文库数必须在8.1105以上时，才能以以上时，才能以99的概率得到此克隆的概率得到此克隆。第54页/共114页2023/3/2155(2)、建库的、建库的目的目的：1）.从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；2）.是从来源复杂的总是从来源复杂的总mRNA的的cDNA文库中分离稀有的文库中分离稀有的cDNA克隆。克隆。(3)、建库的、建库的关键关键：如何产生足够数量的重组如何产生足够数量的重组DNA(4)、建库应、建库应注意注意：1）.保证载体保证载体DNA和靶和靶DNA均不被外源均不被外源DNA序列污染；序列污染
46、；2）.尽可能用尽可能用“电话克隆电话克隆”。第55页/共114页2023/3/2156第56页/共114页2023/3/21575.2.5.2DNA克隆片段的产生与分离克隆片段的产生与分离（一）、基因组（一）、基因组DNA的片段化的片段化(1).用限制酶片段化用限制酶片段化:用限制酶消化用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离不经凝胶电泳分部离,直接和载体连接的克直接和载体连接的克隆方法叫鸟枪法隆方法叫鸟枪法(shot-ganapproach)存在的问题：存在的问题：所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段的混合群体。以每个载体可所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段的混合群体。以每
47、个载体可插入插入13kbDNA计算，基因库至少含计算，基因库至少含1030万个重组质粒。从中筛出目的基因万个重组质粒。从中筛出目的基因工作量是很大的。工作量是很大的。目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个基因分载在目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个基因分载在几个重组质粒上，几个重组质粒上，完整筛出更不容易。完整筛出更不容易。第57页/共114页2023/3/2158(2).随机片段化：随机片段化：超声波：可产生超声波：可产生300bp的短片段。的短片段。高速搅拌：高速搅拌：1500转转/分分30分分可切可切平均长度平均长度8kb的分子群体。的分子群体。(3).双酶消化双酶消化双
48、酶切产生的双酶切产生的DNA片段平均大小不超过片段平均大小不超过1kb,但如采用双酶但如采用双酶部分消化，产物的分子量可达部分消化，产物的分子量可达1030kb,它们存在着随机序重它们存在着随机序重叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片段群体按大小分叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片段群体按大小分开，可得到的分子量大小约为开，可得到的分子量大小约为20kb的随机的随机DNA片段群体。片段群体。第58页/共114页2023/3/21595.3RNA基本操作技术基本操作技术由于由于mRNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增。分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增。一般将其反转录成稳定的一般将其
49、反转录成稳定的DNA双螺旋，再插入到可双螺旋，再插入到可以自我复制的载体中。以自我复制的载体中。cDNA来自反转录的来自反转录的mRNA，不含冗余序列，通过特，不含冗余序列，通过特异性探针筛选异性探针筛选cDNA文库，可以较快地分离到相关基文库，可以较快地分离到相关基因，因，第59页/共114页2023/3/21605.3.1总总RNA的提取的提取要获得均一的要获得均一的RNA取决于能否有效去除取决于能否有效去除RNA提取中提取中DNA和蛋白质。采用高活性和蛋白质。采用高活性RNA酶抑制剂，可以防酶抑制剂，可以防止止RNA的降解，采用酚的降解，采用酚-氯仿抽提可以方便地去除氯仿抽提可以方便地去
50、除RNA提取物中蛋白质。常用的异硫氰酸胍提取物中蛋白质。常用的异硫氰酸胍（Trizol Trizol 试剂异硫氰酸胍和苯酚）试剂异硫氰酸胍和苯酚）和盐酸胍是和盐酸胍是RNA抑制剂之抑制剂之一，它能在裂解细胞的同时使一，它能在裂解细胞的同时使RNA酶失活，而且还能酶失活，而且还能使使RNA提取过程中的蛋白质变性。提取过程中的蛋白质变性。第60页/共114页2023/3/2161第61页/共114页2023/3/2162第62页/共114页2023/3/21635.3.2.mRNA的纯化的纯化可应用可应用PromegaPolyATtractmRNA分离系统分离多聚分离系统分离多聚(A)mRNA。将