《分子生物学研究方法-PCR5181.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学研究方法-PCR5181.pptx（32页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、 分子生物学分子生物学研究研究方法方法 PCR技术在医学中的应用技术在医学中的应用一.多聚酶链反应多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaciton,PCR)（一）原理（一）原理热变性（94度）引物退火（55度）延伸（72度）DNA聚合酶dNTP变性退火引物经经2530次循环，次循环，目的目的DNA增加增加166-7（二）。（二）。PCR反应的主要成分和作用反应的主要成分和作用1。DNA聚合酶：聚合酶：PCR反应使用的是耐热反应使用的是耐热DNA聚合酶。聚合酶。比如：比如：Taq DNA聚合酶。聚合酶。可分为两大类：可分为两大类：（1）具有校正功能的（有）具有校正功能的（有35核
2、酸酶活性核酸酶活性）比如：比如：Vent,pfu,pwo等等（2）不具有校正功能的）不具有校正功能的（无（无35核酸酶活性核酸酶活性）比如：一般的比如：一般的Taq DNA聚合酶聚合酶2。引物。引物（1）引物长度以）引物长度以1530个个bp为宜。引物过短会使特异性降低，为宜。引物过短会使特异性降低，过长时则成本增加，且也会降低特异性。过长时则成本增加，且也会降低特异性。（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶堆积现象，）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶堆积现象，引物引物G+C含量宜在含量宜在4555%左右。左右。（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在）引物内部不
3、应形成二级结构，两个引物之间尤其在3末端不应末端不应 有互补链存在。有互补链存在。（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时 进行辅助检索分析。进行辅助检索分析。（5）引物）引物3末端碱基：原则上要求引物末端碱基：原则上要求引物3末端与模板末端与模板DNA一定要配对。一定要配对。另外引物另外引物3末端的末位碱基在很大程度上影响着末端的末位碱基在很大程度上影响着Taq DNA聚合酶聚合酶 的延伸效率。研究表明，引物的延伸效率。研究表明，引物3末端碱基在错误配对时，不同碱基末端碱基在错误配对时，不同碱基 的引发效率存在很
4、大差异。当末位碱基为的引发效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情时，即使在错配的情 况下，也能引发链的合成。而末位碱基为况下，也能引发链的合成。而末位碱基为T时，错配时引发效率时，错配时引发效率 大大降低。大大降低。G,C居于中间，所以居于中间，所以3末端的末位碱基最好选末端的末位碱基最好选T,G,C而而 不选不选A.(6)引物引物5末端碱基：末端碱基：PCR反应物反应物5末端碱基并没有严格限制，末端碱基并没有严格限制，只要与只要与 模板模板DNA结合的引物程度足够，其结合的引物程度足够，其5末端碱基可以不末端碱基可以不 与模板与模板DNA匹匹 配，而呈游离状态。这样引物设计时可以
5、在配，而呈游离状态。这样引物设计时可以在5末端加上限制性内切酶末端加上限制性内切酶 位点或其他短的序列。可以加位点或其他短的序列。可以加ATG起始密码，可以加错配碱基造起始密码，可以加错配碱基造 成突变。成突变。3。PCR反应缓冲液：反应缓冲液：组成组成50mM KCl10mM Tris.Cl(pH 8.4)1.5mM MgCl2Mg+是是Taq酶活性所必需的金属离子。酶活性所必需的金属离子。Mg+浓度的高低能影响反应浓度的高低能影响反应的特异性和扩增片断的产率。的特异性和扩增片断的产率。1.52.0mM Mg+是比较合适的。是比较合适的。Mg+过量能增加非特异性扩增并影响产率。过量能增加非特
6、异性扩增并影响产率。4。底物。底物dNTP浓度浓度在在PCR反应中，反应中，dNTP浓度应在浓度应在20200uM,dNTP浓度过高可加快反应浓度过高可加快反应速度。同时，还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度速度。同时，还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。此外，由于会导致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。此外，由于dNTP可能与可能与Mg+结合，因此应注意结合，因此应注意Mg+浓度和浓度和dNTP浓度之间的关系。浓度之间的关系。（三）怎样提高（三）怎样提高PCR的特异性的特异性1热启动（热启动（hot-star
7、t)比如（1）将Taq酶与其它反应体系通过石蜡分隔开 （2）利用Taq酶的单克隆抗体抑制其活性。2.Touchdown 先在高于退火温度下进行几轮PCR循环，然后再在 退火温度下进行大量扩增。3.Nested PCR 先在要扩增片断的外侧设计一对引物，进行PCR，然后以此PCR产物为模板，再在内侧设计一对引物扩增出我们所要的目的片断。二二 PCRPCR的应用的应用（一）未知一）未知DNA片断的克隆片断的克隆 1，基因组基因组DNA步移法步移法 1 2 3 4 5已知已知DNA序列序列接头接头接头接头PCR2，Inverse PCR限制酶切点（限制酶切点（X）限制酶切点（限制酶切点（X）已知序列
8、已知序列限制酶限制酶X酶切酶切连接连接引物引物2引物引物1PCR(二）利用PCR对基因功能进行 分析和改造 (三）基因拼接基因拼接（四）（四）In vitro evolution of gene-coding proteinDNA Shuffle基本过程基本过程1Preparation of genes to be shuffled2Fragmentation with DNase I3Reassembly by thermocycling in the presence of a DNA polymerase4Amplification of reassembled products by
9、a conventional PCR怎样提高高保真的重组体怎样提高高保真的重组体1在步骤在步骤2）使用）使用Mn2+而不是而不是Mg2+2在在PCR步骤使用高保真的耐热步骤使用高保真的耐热DNA聚合酶聚合酶PCR Random Mutagenesis1提高PCR反应体系中Mn2+的浓度（可到640uM）2在保持Mn2+浓度的基础上，升高dGTP浓度可进一步提高突变率怎样获得理想的突变率 每每1000bp含含2-6个突变碱基是理想的突变率个突变碱基是理想的突变率1选择缓冲液选择缓冲液2突变偏向（mutational bias)评估方法：1）transition/transversion Tran
10、sition：嘌呤突变为嘌呤，嘧啶突变为嘧啶 Transversion:嘌呤突变为嘧啶 2）A或T转变为G或C的程度，或者是反过来 AT GC/GC AT （五）基因表达及其调控的分析五）基因表达及其调控的分析1.RT-PCR方法方法基本步骤：基本步骤：AAAAmRNA分离分离mRNA反转录酶和反转录酶和基因特异引物基因特异引物AAAAmRNAcDNA反转录合成反转录合成cDNAPCR第一轮第一轮PCR合合成双链成双链cDNAPCR经多轮经多轮PCR合成合成大量产物大量产物电泳，鉴定电泳，鉴定2,Chromatin immunoprecipitation(ChIP)主要应用:研究转录因子在体内与其顺式作用元件的结合原理：3.DNA甲基化的分析谢谢观看/欢迎下载BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH