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1、1.限制酶的选择原则限制酶的选择原则(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应应选选择择切切点点位位于于目目的的基基因因两两端端的的限限制制酶酶，以以便便将将目目的的基基因因“切切出出”，如如图图甲甲可可选选择择Pst。不不能能选选择择切切点点位位于于目目的的基基因因内内部部的的限限制制酶酶，以以防防破破坏坏目目的的基基因因，如如图图甲甲不不能能选选择择Sma。为为避避免免目目的的基基因因和和质质粒粒的的自自身身环环化化和和随随意意连连接接，也也可可使使用用不不同同的的限限制制酶酶切切割割目目的的基基因因和和质质粒粒，如如图图甲甲也也可可选
2、选择择用用Pst 和和EcoR 两两种种限限制制酶酶(但但要要确确保保质质粒粒上上也也有有这这两种酶的切点，而且这种切点不致于完全破坏两种酶的切点，而且这种切点不致于完全破坏“标记基因标记基因”)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质质粒粒作作为为载载体体必必须须具具备备标标记记基基因因等等，所所以以所所选选择择的的限限制制酶酶尽尽量量不不要要破破坏坏这这些些结结构构，应应至至少少含含有有一一个个完完好好的的标标记记基基因因，如
3、如图图乙乙中中限限制制酶酶pst 因因其其会会破破坏坏标标记记基基因因而而不不宜宜选择。选择。所所选选限限制制酶酶切切点点不不应应位位于于复复制制原原点点处处以以防防破破坏坏复复制制原原点点，如如果果所所选选酶酶的的切切点点不不止止一一个个，则则切切割割重重组组后后可可能能会会丢丢失失某某些些片片段段，若若丢丢失失的的片片段段含含复复制制起起点点区区，则则切切割割重重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制，故不能选择，如组后的片段进入受体细胞后不能自主复制，故不能选择，如Xba。所所选选限限制制酶酶，其其切切点点应应位位于于启启动动子子与与终终止止子子之之间间，如如图图乙乙中中Hind会会破破坏
4、坏启启动动子子，EcoR会会破破坏坏终终止止子子，而而Nde、BamH切切出出的的切切口口可可让让目目的的基基因因嵌嵌入入启启动动子子与与终终止子之间。止子之间。(3)参加参加Ti质粒的质粒的TDNA片段选择限制酶片段选择限制酶若若质质粒粒上上标标出出TDNA片片段段，则则所所选选限限制制酶酶切切点点应应位位于于TDNA片片段段中中，从从而而有有利利于于将将目目的的基基因因嵌嵌入入到到TDNA片片段段上上因因为为Ti质质粒粒的的TDNA片片段段最最易易转转移移至至受受体体细细胞胞并并且且整整合合到到受受体体细细胞胞染染色色体体DNA上上，如如用用两两种种限限制制酶酶Xba 和和Sac(两两种种
5、酶酶切切出出的的黏黏性性末末端端不不同同)切切割割某某DNA，获获得得含含目目的的基基因因的的片片段段。若若利利用用该该片片段段构构建建基基因因表表达达载体，则下图中甲、乙、丁，载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。质粒宜选取。(分析如下分析如下)2.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定(1)界定界定“标记基因标记基因”与与“DNA分子杂交技术分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：在目的基因检测中的作用：载体上标记基因的标记原理载体上标记基因的标记原理载载体体上上的的标标记记基基因因一一般般是是一一些些抗抗生生素素的的抗抗性性基基因因。目目的
6、的基基因因要要转转入入的的受受体体细细胞胞没没有有抵抵抗抗相相关关抗抗生生素素的的能能力力。当当含含有有抗抗生生素素抗抗性性基基因因的的载载体体进进入入受受体体细细胞胞后后，抗抗性性基基因因在在受受体体细细胞胞内内表表达达，使使受受体体细细胞胞能能够够抵抵抗抗相相应应抗抗生生素素，所所以以在在受受体体细细胞胞的的培培养养体体系系中中加加入入该该种种抗抗生生素素就就可可以以只只保保留留转转入入载载体体的的受受体体细细胞胞，倘倘若若在在选选择择培培养养基基中中不不能能存存活活，则则表表明明无无质质粒粒转转入入，当当然然不不会会有有“目目的的基基因因”转转入入，能能存存活活时时必必含含该该载载体体，
7、原原理如下图所示：理如下图所示：“标记基因标记基因”筛选后为何还需应用筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术分子杂交技术”确认目的基因是否转入？确认目的基因是否转入？经经上上述述步步骤骤筛筛选选得得到到的的受受体体细细胞胞，只只是是含含特特定定的的标标记记基基因因的的质质粒粒，然然而而，该该质质粒粒上上是是否否成成功功嵌嵌入入了了目目的的基基因因，还还不不能能确确定定，故故仍仍需需使使用用“目目的的基基因因”作作探探针针，利利用用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。(2)使使用用“目目的的基基因因”作作探探针针，运运用用“分
8、分子子杂杂交交技技术术”检检测测目目的的基基因因是是否否转转录录出出特特定定mRNA。(3)采采用用“抗抗原原抗抗体体杂杂交交技技术术”，从从转转基基因因生生物物中中提提取取蛋蛋白白质质(作作抗抗原原)与与相相应应抗抗体体杂杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导指导”特定蛋白质的合成。特定蛋白质的合成。(4)采采用用抗抗虫虫、抗抗病病毒毒等等“接接种种实实验验”进进行行目目的的基基因因成成功功表表达达的的“个个体体生生物物学学”水水平平的检测。的检测。【例证】【例证】1.(2017北北京京卷卷，5)为为了了增增加加菊菊花花花花色色类类型型，研研究究
9、者者从从其其他他植植物物中中克克隆隆出出花花色色基基因因C(图图1)，拟将其与质粒，拟将其与质粒(图图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是下列操作与实验目的不符的是()A.用限制性核酸内切酶用限制性核酸内切酶EcoR I和和DNA连接酶构建重组质粒连接酶构建重组质粒B.用含用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞基因导入细胞C.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞D.用用DNA分子杂交方法检测分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上基因是否整
10、合到菊花染色体上解解析析图2中中质粒粒中中的的抗抗性性基基因因为潮潮霉霉素素抗抗性性基基因因，应该在在培培养养基基中中添添加加潮潮霉霉素素，筛选被被转化的菊花化的菊花细胞，胞，C错误。答案答案C2.(2016全全国国卷卷，40)图图(a)中中的的三三个个DNA片片段段上上依依次次表表示示出出了了EcoR、BamH和和Sau3A三三种种限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别序序列列与与切切割割位位点点，图图(b)为为某某种种表表达达载载体体的的示示意意图图(载体上的载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：根据基因工程的有关知识，回答下列问题
11、：(1)经经BamH酶酶切切后后得得到到的的目目的的基基因因可可以以与与上上述述表表达达载载体体被被酶酶切切后后的的产产物物连接，理由是连接，理由是_。(2)若若某某人人利利用用图图(b)所所示示的的表表达达载载体体获获得得了了甲甲、乙乙、丙丙三三种种含含有有目目的的基基因因的的重重组组DNA分分子子，如如图图(c)所所示示，这这三三种种重重组组DNA分分子子中中，不不能能在在宿宿主主细细胞胞中中表表达达目目的的基基因因产产物物的有的有，不能表达的原因是，不能表达的原因是_。图(c)(3)DNA连连接接酶酶是是将将两两个个DNA片片段段连连接接起起来来的的酶酶，常常见见的的有有和和，其其中既能
12、连接黏性末端又能连接平末端的是中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。慧眼识图获取信息慧眼识图获取信息(1)三种限制酶切割结果分析三种限制酶切割结果分析(2)表达载体与重组表达载体与重组DNA分子分析分子分析答答案案(1)Sau3A两两种种酶酶切切割割后后产产生生的的片片段段具具有有相相同同的的黏黏性性末末端端(2)甲甲、丙丙甲甲中中目目的的基基因因插插入入在在启启动动子子的的上上游游，丙丙中中目目的的基基因因插插入入在在终终止止子子的的下下游游，二二者者的的目目的的基因均不能被转录基因均不能被转录(3)EcoliDNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶1.(2019山山
13、东名名校校联考考)图图甲甲、乙乙中中的的箭箭头头表表示示三三种种限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶的的酶酶切切位位点点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是()A.图甲中的质粒用图甲中的质粒用BamH切割后，含有切割后，含有4个游离的磷酸基团个游离的磷酸基团B.在构建重组质粒时，可用在构建重组质粒时，可用Pst和和BamH切割质粒和外源切割质粒和外源DNAC.用用Pst和和Hind酶切，可以保证重组酶切，可以保证重组DNA序列的唯一性序列的唯一性D.导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生
14、长导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长解解析析图甲甲中中的的质粒粒只只有有一一个个BamH切切割割位位点点，切切割割后后形形成成一一个个直直链DNA，含含2个个游游离离的的磷磷酸酸基基团，A错误；BamH切切割割位位点点在在目目的的基基因因上上，不不能能用用该酶切切割割外外源源DNA，B错误；用用Pst和和Hind酶切切，能能将将质粒粒切切成成两两个个片片段段，用用Pst和和Hind酶切切，能能将将外外源源DNA切切成成三三段段，只只有有含含目目的的基基因因的的片片段段通通过DNA连接接酶与与质粒粒连接接形形成成的的重重组质粒粒符符合合要要求求，而而另另一一个个重重组质粒粒无无
15、目目的的基基因因，不不符符合合要要求求，从从而而保保证重重组DNA序序列列的的唯唯一一性性，C正正确确；导入入目目的的基基因因的的大大肠杆杆菌菌，其其重重组质粒粒是是用用Pst和和Hind酶切割的，其中的切割的，其中的ampr(氨氨苄青霉素抗性基因青霉素抗性基因)已被破坏，已被破坏，D错误。答案答案C2.(2019山山东菏菏泽调研研)科科技技人人员员通通过过基基因因工工程程、细细胞胞融融合合等等技技术术制制作作工工程程细细胞胞，并并利利用用工工程程细细胞胞生生产产人人们们所所需需要要的的医医用用蛋蛋白白，如如用用于于治治疗疗糖糖尿尿病病的的胰胰岛岛素素。下下面面是是利利用用大肠杆菌培育工程菌时
16、用到的质粒、胰岛素基因及相关的限制酶。请回答：大肠杆菌培育工程菌时用到的质粒、胰岛素基因及相关的限制酶。请回答：表几种限制表几种限制酶识别序列及其切割位点序列及其切割位点限制酶限制酶BglBcl Sau3AHpa识别序列及识别序列及切割位点切割位点 AGATCTTCTAGA TGATCAACTAGT GATCCTAG CCGGGGCC(1)能能识识别别人人胰胰岛岛素素的的mRNA并并催催化化合合成成cDNA的的酶酶是是；利利用用PCR技技术术对对cDNA进进行行扩扩增增所所需需要要的的酶酶是是。在在基基因因工工程程中中，限限制制酶酶不不能能识识别别并并切切割割单单链链核酸，其具体功能是核酸，其
17、具体功能是_。(2)上上表表中中可可切切割割形形成成图图2胰胰岛岛素素基基因因末末端端的的限限制制酶酶为为；不不宜宜选选用用Sau3A 限限制酶切割质粒的原因是制酶切割质粒的原因是_。酶切后的质粒与胰岛素基因通过酶切后的质粒与胰岛素基因通过(填酶填酶)作用后获得基因表达载体。作用后获得基因表达载体。(3)基因表达载体导入大肠杆菌前，常用基因表达载体导入大肠杆菌前，常用Ca2处理菌体，其目的是处理菌体，其目的是_。(4)从从大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞内内获获得得了了胰胰岛岛素素，但但其其没没有有降降血血糖糖的的功功能能，出出现现这这种种现现象象的的原原因因是是_。解解析析(2)根根据据胰胰岛素素基
18、基因因末末端端序序列列可可知知，切切割割胰胰岛素素基基因因的的限限制制酶识别和和切切割割的的序序列列为GATCC，表表中中的的Sau3A可可识别切切割割。分分析析表表格格信信息息可可知知，Sau3A限限制制酶可可识别并切割并切割Bgl或或Bcl限制限制酶的的识别序列，序列，导致致质粒中的粒中的标记基因均被破坏。基因均被破坏。答答案案(1)逆逆转转录录酶酶热热稳稳定定DNA聚聚合合酶酶或或(Taq酶酶)识识别别双双链链DNA的的某某种种特特定定核核苷苷酸酸序列并断裂特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键序列并断裂特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键(2)Sau3ASau3A限限制制酶酶能能识识别别
19、并并切切割割Bgl和和Bcl限限制制酶酶的的识识别别序序列列，导导致致质质粒中的标记基因均被破坏粒中的标记基因均被破坏(其他合理答案也可其他合理答案也可)DNA连接酶连接酶(3)提高受体细胞的转化率提高受体细胞的转化率(其他合理答案也可其他合理答案也可)(4)大大肠肠杆杆菌菌为为原原核核生生物物，细细胞胞中中只只有有核核糖糖体体，没没有有内内质质网网和和高高尔尔基基体体，不不能能对对肽肽链链进行加工，形成有活性的胰岛素进行加工，形成有活性的胰岛素3.(2019海海口口市市质检)胰胰岛岛素素是是治治疗疗糖糖尿尿病病的的重重要要药药物物。现现利利用用基基因因工工程程技技术术让让大大肠肠杆杆菌生产人
20、胰岛素，下图为大肠杆菌质粒，请据图作答。菌生产人胰岛素，下图为大肠杆菌质粒，请据图作答。补补充充说说明明：Hind、BamH、EcoR 是是限限制制酶酶切切位位点点tetR、ampR是是抗抗生生素素抗抗性基因性基因(1)获获取取目目的的基基因因时时，应应从从人人的的文文库库(基基因因组组/cDNA)中中获获取取，这这样样做做的的原原因因为为。获获取取后后不不能能直直接接对对目目的的基基因因酶酶切切，因因为为 ，因因此此需需要要在在目目的的基基因因两两端端添添加加 。(2)天天然然人人胰胰岛岛素素不不耐耐储储存存，可可使使用用蛋蛋白白质质工工程程对对蛋蛋白白质质进进行行改改造造。蛋蛋白白质质工工程程的的基基本本途途径径为为设设计计预预期期蛋蛋白白质质结结构构找找到到相相对对应应的的脱氧核苷酸序列。脱氧核苷酸序列。答答案案(1)cDNAcDNA中中无无内内含含子子序序列列，能能够够在在大大肠肠杆杆菌菌中中表表达达正正确确蛋蛋白白质质cDNA中中只只有有编编码码氨氨基基酸酸的的序序列列，直直接接酶酶切切会会导导致致基基因因结结构构改改变变BamH 和和EcoR I的识别位点的识别位点 (2)预期蛋白质功能推测应有的氨基酸序列预期蛋白质功能推测应有的氨基酸序列