《重组技术与基因操作.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《重组技术与基因操作.pptx（135页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、DNADNA重组技术要有四重组技术要有四个必要条件：个必要条件：工具酶、工具酶、基因、基因、载体、载体、受体细胞受体细胞第1页/共135页DNA限制性内切酶可分为三类：、酶在基因工程中基本不用酶在基因工程中基本不用,why?,why?第一节限制性内切酶限限制制性性内内切切酶酶是是从从细细菌菌中中分分离离提提纯纯的的核核酸酸内内切切酶酶，可可以以识别并切开核酸序列特定位点识别并切开核酸序列特定位点分子手术刀分子手术刀ArberArber、SmithSmith和和NathansNathans因因为为在在发发现现限限制制性性内内切切酶酶方方面面开开创性工作而共同获得了创性工作而共同获得了197819
2、78年的诺贝尔奖。年的诺贝尔奖。第2页/共135页、限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖于化作用及依赖于ATPATP的限制性内切酶活性。的限制性内切酶活性。类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的、特异性切割末端。形成稳定的、特异性切割末端。类酶在识别位点上切割类酶在识别位点上切割DNADNA，然后从底物上解，然后从底物上解离下来。离下来。第3页/共135页核酸内切限制酶的类型及其主要特性核酸内切限制酶的类型及其主
3、要特性特性特性特性特性I I型型型型IIII型型型型IIIIII型型型型限制和修饰活性限制和修饰活性限制和修饰活性限制和修饰活性单一多功能的酶单一多功能的酶单一多功能的酶单一多功能的酶分开的核酸内切酶分开的核酸内切酶分开的核酸内切酶分开的核酸内切酶和甲基化酶和甲基化酶和甲基化酶和甲基化酶 具有一种共同亚基具有一种共同亚基具有一种共同亚基具有一种共同亚基的双功能的酶的双功能的酶的双功能的酶的双功能的酶核酸内切限制酶的核酸内切限制酶的核酸内切限制酶的核酸内切限制酶的蛋白质结构蛋白质结构蛋白质结构蛋白质结构3 3种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基单一的成份单一的成份单一的成份单一的成份
4、 2 2种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基 切割位点切割位点切割位点切割位点在距寄主特异性位在距寄主特异性位在距寄主特异性位在距寄主特异性位点至少点至少点至少点至少1000bp1000bp的地的地的地的地方可能随机地切割方可能随机地切割方可能随机地切割方可能随机地切割位于寄主特异性位位于寄主特异性位位于寄主特异性位位于寄主特异性位点或其附近点或其附近点或其附近点或其附近 距寄主特异性位点距寄主特异性位点距寄主特异性位点距寄主特异性位点3 3，端端端端2426bp2426bp处处处处甲基化作用的位点甲基化作用的位点甲基化作用的位点甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主
5、特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别未甲基化的序识别未甲基化的序识别未甲基化的序识别未甲基化的序列进行核酸内切酶列进行核酸内切酶列进行核酸内切酶列进行核酸内切酶切割切割切割切割 能能能能 能能能能能能能能序列特异的切割序列特异的切割序列特异的切割序列特异的切割不是不是不是不是是是是是是是是是DNADNADNADNA克隆中的用处克隆中的用处克隆中的用处克隆中的用处无用无用无用无用十分有用十分有用十分有用十分有用用处不大用处不大用处不大用处不大第4页/共135页一、II类限制
6、性内切酶的特点识别特定的核苷酸序列识别特定的核苷酸序列，其长度一般为，其长度一般为4 4、5 5或或6 6个核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长个核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序列或兼并序列的序列或兼并序列；具有特定的酶切位点具有特定的酶切位点 ，产生出特定的酶切末端产生出特定的酶切末端55突出粘末端、突出粘末端、3 3突出粘末端、平末端；突出粘末端、平末端；类限制修饰系统是由两种酶分子组成的二类限制修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统；元系统；限制性内切酶、独立的甲基化酶。限制性内切酶、独立的甲基化酶。被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对
7、，这样的切口叫做 粘性末端。第5页/共135页EcoEcoRIRI特特异异识识别别GAATTCGAATTC及及其其互互补补碱碱基组成的双链片段基组成的双链片段SmaSma特异识别特异识别CCCGGG,CCCGGG,形成平形成平末端末端5CCCGGG3GGGCCC5CCCGGGGGG3CCC第6页/共135页二、使用限制性内切酶时应注意的问题1、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限制性内切酶。限制性内切酶。同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列
8、，但切割后列，但切割后DNADNA分子所产生的粘性末端却相同，这类分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不同酶切位点的酶为具不同酶切位点的DNADNA片段重组提供了方便片段重组提供了方便，但要但要注意，往往相容的粘性末端再用注意，往往相容的粘性末端再用DNADNA连接酶连接后，都连接酶连接后，都不能再被其切割了。不能再被其切割了。第7页/共135页2、注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶解DNA样品。3、注意说明书中所列出的comments的内容，会提供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基化的信息以及引起酶产生star activity的原因。staractivity：指当酶的反应条
9、件改变时，其在识别序列中的酶切位点发生改变。产生的原因：反应体系中甘油的浓度12；酶：DNA比率25u/g；缺少Nacl和存在Mn2。第8页/共135页4、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。一般以在一般以在20l20l反应体积中，反应体积中，3737，每小时水解，每小时水解1 1微克微克DNADNA的酶量定为一个酶单位。的酶量定为一个酶单位。5、注意酶在保温过程中的活性变化。ACCACC在在5 5 小时内具有全部活力小时内具有全部活力BamHBamH在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部分活力，而在有部分活力，而在2 2小时以后就无活力了。小
10、时以后就无活力了。CfoCfo仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没有活力了。就没有活力了。第9页/共135页三、连接酶定义：用于将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。用途：（1）、连接带匹配粘末端的DNA分子；（2）、使平末端的双链DNA分子相互连接或与合成的寡核苷酸接头相连接。这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子（子（150-200mmol/LNacl150-200mmol/LNacl）或低浓度的聚乙二醇）或低浓度的聚乙二醇（PEGPEG）可提高连接效率。）可提高连接效率。第10页/共1
11、35页DNA连接酶连接的部位连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。第11页/共135页第12页/共135页四、修饰酶四、修饰酶1、DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（klenow fragment）、T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬菌体DNA聚合酶、耐高温DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）、反转录酶、末端脱氧核苷酸转移酶等2、依赖于DNA的RNA聚合酶：SP6噬菌体及T7和T3噬菌体RNA聚合酶用途:在in vitro条件，合成单链RNA作为杂交探针。第13页/共135页3、T4噬菌体多核苷酸激酶：催化ATP的磷酸基转移至DNA或RNA片
12、段的5末端。用途：标记DNA片段的5端，制备杂交探针；基因化学合成中，寡核苷酸片段5磷酸化；用于测序引物的5标记。5HOOH3HOOH355突出末端5隐蔽末端532POH3HO32P3532PATP第14页/共135页4、碱性磷酸酶：用途：去除DNA片段5末端的磷酸，以防止在重组中自身环化，从而提高重组效率；在用32pATP标记DNA或RNA的5末端前，去除DNA或RNA片段的非标记的5磷酸。5POH3HOP355突出末端5隐蔽末端OHHO5HOOH335第15页/共135页第16页/共135页第二节克隆载体基因工程载体应具备的条件：能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制；具有合适的限制性内
13、切酶位点：在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后的外源同限制性内切酶切割后的外源DNADNA片段方便的插入载体片段方便的插入载体；在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增；载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源DNA插入片段：在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失；应该有一个或多个选择标记。第17页/共135页大肠杆菌表达载体应具备：强的启动子，一个强的可诱导的启动子可使外源基因有效的转录；在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD）；在外源基因插入序列的
14、下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。第18页/共135页一、质粒一、质粒(plasmid)(plasmid)定义：质粒是能自主复制的双链环状定义：质粒是能自主复制的双链环状DNADNA分子，分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。AOCSCL第19页/共135页F F质粒：质粒：有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息的质粒。一个细胞的信息的质粒。R R质粒质粒：表达对一种抗生素的抗性的质粒。：表达对一种抗生素的抗性的质粒。降解质粒降解质粒：携带参与或控制一些不同寻
15、常的代谢：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因的质粒。途径的基因的质粒。穿梭载体穿梭载体：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复起始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制制。第20页/共135页1、质粒载体pBR322特点特点1 1）大小为）大小为4363bp4363bp；2 2）含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；）含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；3 3）有单一的）有单一的BamHBamH、HindHind和和SalSal的识别位点（在的识别位点（在四环素抗性基因内）、四环素抗性基因内）、P
16、stPst识别位点（在氨苄青识别位点（在氨苄青霉素抗性基因内）；霉素抗性基因内）；外源片段在外源片段在BamHBamH、HindHind、PstPst位点插入时，可位点插入时，可引起抗生素失活来筛选重组体引起抗生素失活来筛选重组体。4 4）带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠）带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复制功能，在大肠杆菌里杆菌里行使复制功能，在大肠杆菌里pBR322pBR322以高拷以高拷贝数存在。贝数存在。第21页/共135页第22页/共135页2 2、质粒载体、质粒载体pUC19pUC191 1）特征）特征大小为大小为2686bp2686bp；带有带有
17、pBR322pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因；抗性基因；一个大肠杆菌乳糖操纵子一个大肠杆菌乳糖操纵子半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的调节片段（调节片段（lacZlacZ）,一个调节一个调节lacZlacZ基因表达基因表达的阻遏蛋白的基因的阻遏蛋白的基因lacIlacI；含有多个单克隆位点。含有多个单克隆位点。第23页/共135页第24页/共135页第25页/共135页2 2）pUC19pUC19的筛选：的筛选：培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTGIPTG，laclac操操纵子的一个诱导物）时，纵子的一个诱导物）
18、时，lacIlacI的产物就不能与的产物就不能与lacZlacZ的启动子区域结合，质粒的启动子区域结合，质粒pUC19pUC19的的lacZlacZ就可以转录，进而翻译，就可以转录，进而翻译，lacZlacZ蛋白会与染色体蛋白会与染色体DNADNA编码的一个蛋白形成具有活性的杂合编码的一个蛋白形成具有活性的杂合半乳糖半乳糖苷酶。苷酶。在底物在底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（X-X-galgal）存在下，）存在下，X-galX-gal会被杂合会被杂合半乳糖苷酶水半乳糖苷酶水解成蓝色的产物，没有插入外源解成蓝色的产物，没有插入外源DNADNA序列的序列的pUC19pU
19、C19质粒克隆就呈蓝色。质粒克隆就呈蓝色。由于由于pUC19pUC19的单克隆位点的序列是整合在的单克隆位点的序列是整合在lacZlacZ之中的，若之中的，若pUC19pUC19质粒中插入有目的质粒中插入有目的DNADNA片段，就片段，就会破环会破环lacZlacZ的结构，导致细胞无法产生功能性的结构，导致细胞无法产生功能性的的lacZlacZ蛋白，也就无法形成杂合的蛋白，也就无法形成杂合的半乳糖苷半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。酶，因而菌落是白色的。第26页/共135页第27页/共135页穿梭质粒:人工人工构建的具有两种构建的具有两种不同复制起点和不同复制起点和选择记号，可在选择记号，可在两种
20、不同的寄主两种不同的寄主细胞中存活和复细胞中存活和复制的质粒载体制的质粒载体。第28页/共135页二、二、噬菌体噬菌体噬菌体可以进入裂解循环，噬菌体可以进入裂解循环，2020分钟后就可使宿分钟后就可使宿主主细胞发生裂解，同时释放出大约细胞发生裂解，同时释放出大约100100个噬菌体颗粒。个噬菌体颗粒。噬菌体也可以进入溶源循噬菌体也可以进入溶源循环，即注入的环，即注入的DNADNA整合到大整合到大肠杆菌的染色体中，以前噬肠杆菌的染色体中，以前噬菌体的形式潜伏起来，永久菌体的形式潜伏起来，永久保留。保留。第29页/共135页第30页/共135页第31页/共135页第32页/共135页噬菌体噬菌体D
21、NADNA大约长大约长50kb50kb，其中大约，其中大约20kb20kb对于整合切割过程极为关键，称为整合切对于整合切割过程极为关键，称为整合切割（割（I/EI/E）区域。）区域。对于构建文库，可将这对于构建文库，可将这20kbDNA20kbDNA片段去掉，强迫重组的片段去掉，强迫重组的噬菌体进入裂解循噬菌体进入裂解循环。环。整合切割区域尾部基因头部基因粘性末端粘性末端负责DNA复制的基因细胞裂解基因噬菌体的DNA示意图左臂右臂第33页/共135页噬菌体头的大小足以装下噬菌体头的大小足以装下50kb50kb单元的线性单元的线性DNADNA，DNA38kb DNA52kb,DNA52kb,则无
22、法包装进头部。则无法包装进头部。coscos位点（位点（cos sitecos site）就是保证在超长线性就是保证在超长线性DNADNA分子分子上每两个上每两个coscos位点之间为位点之间为50kb,50kb,使使DNADNA分子能正确分子能正确的装配进噬菌体的装配进噬菌体。在头的入口处有一种酶，在头的入口处有一种酶，它能识别双链线性它能识别双链线性DNADNA分子上的分子上的coscos序列，并在序列，并在coscos序列处切断序列处切断DNADNA分子，使适当大小的分子，使适当大小的DNADNA进入进入噬菌体的头部。噬菌体的头部。第34页/共135页噬菌体DNA分子示意图第35页/共1
23、35页第36页/共135页三、柯斯质粒（三、柯斯质粒（cosmidcosmid）可携带可携带40kb40kb大小的大小的DNADNA片段，并在大肠杆菌中片段，并在大肠杆菌中复制保存，复制保存，综合了质粒载体和噬菌体载体二综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优势。者的优势。柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个coscos位位点、点、DNADNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个两个coscos位点之间含有一个限制性内切酶位点位点之间含有一个限制性内切酶位点（RERE）。）。第37页/共135页第38页/共135页应用柯斯质粒载体进行基
24、因克隆的一般程序第39页/共135页利用柯斯质粒克隆大片段DNA第40页/共135页四、四、YACYAC载体载体1 1、目前能容纳最大外源、目前能容纳最大外源DNADNA片段的载体是片段的载体是YACYAC（酵（酵母母 人工染色体，人工染色体，yeast artificial yeast artificial chromosomechromosome）。）。2 2、真核生物染色体三个关键部分：、真核生物染色体三个关键部分：着丝粒着丝粒（centromere,centromere,CENCEN）,它主管染色体在它主管染色体在细胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中；细胞分裂过程中正确的分配到各子细胞
25、中；端粒端粒（telomere,telomere,TELTEL）,位于染色体的末端，位于染色体的末端，对染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外对染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶切断具有重要的意义；切酶切断具有重要的意义；自主复制序列自主复制序列（autonomously replicating autonomously replicating sequence,sequence,ARSARS）,即在染色体上的多处即在染色体上的多处DNADNA复复制起始位点。制起始位点。第41页/共135页3 3、作为真核基因表达载体应具备如下条件：、作为真核基因表达载体应具备如下条件：含有原核基因的
26、含有原核基因的复制起始序列复制起始序列（如（如ColE1ColE1起始序起始序列列oriori）筛选标记；）筛选标记；含有真核基因的含有真核基因的复制起始序列复制起始序列（如（如SV40SV40病毒的复病毒的复制序列、酵母的制序列、酵母的22质粒的复制起始序列质粒的复制起始序列ARSARS、以、以及真核细胞筛选标记（如氨基糖苷及真核细胞筛选标记（如氨基糖苷G148G148抗性基因、抗性基因、在酵母细胞中与自养有关的基因）；在酵母细胞中与自养有关的基因）；含有有效地含有有效地启动子序列启动子序列（可包含增强子序列等各（可包含增强子序列等各种顺式作用元件）；种顺式作用元件）；RNARNA聚合酶所需
27、的聚合酶所需的转录终止和转录终止和poly(A)poly(A)加入的信号加入的信号序列；序列；合适的供外源基因插入的合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点限制性内切酶位点。第42页/共135页4、YAC 的主要功能成份有三：1 1）着丝粒着丝粒：mitosismitosis姊妹染色单体和减数分姊妹染色单体和减数分裂同源染色体分离之必需。裂同源染色体分离之必需。2 2）端粒：端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。袭。3 3）自主复制序列（自主复制序列（ARSARS）元件）元件：是染色体自：是染色体自主复制的复制起点。主复制的复制起点。4 4）构建）构建YACYAC需要
28、需要4 4个短序列：个短序列：2 2个端粒，着丝个端粒，着丝粒，粒，ARSARS元件，选择标记，与外源元件，选择标记，与外源DNADNA连接连接成线性成线性DNADNA分子，导入酵母细胞克隆。分子，导入酵母细胞克隆。第43页/共135页pYAC4结构图第44页/共135页第45页/共135页第三节 重组基因的导入和筛选第46页/共135页DNA克隆的基本过程1.分：分：分离目的基因分离目的基因2.切：切：对目的基因和载体适当切割对目的基因和载体适当切割3.接：接：目的基因与载体连接目的基因与载体连接4.转：转：重组重组DNA转入受体菌转入受体菌5.筛：筛：筛选出含有重组体的受菌体筛选出含有重组
29、体的受菌体第47页/共135页基因工程技术策略分：基因载体 目的基因 质粒 噬菌体 病毒 直接分离 cDNA 人工合成 基因文库切：限制性内切酶 有缺口的载体 目的基因接：连接酶 粘端连接 平端连接 尾接法 重组体转：转化 转染 体外包装 带重组体的宿主筛：表型筛选 电泳法 核酸杂交第48页/共135页基因操作的基本步骤第49页/共135页1、细胞内总DNA的提取分离l细胞内总DNA的提取分离程序第50页/共135页l紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。第51页/共135页2 2、基因重组的方法、基因重组的方法：1 1）根据外源）根据外源DNADNA片段末片段末端的性质同载体上适当端的性
30、质同载体上适当的酶切位点相连实现基的酶切位点相连实现基因的体外重组因的体外重组。第52页/共135页外源外源外源外源DNADNA片片片片段所具末端段所具末端段所具末端段所具末端克隆所需条件克隆所需条件克隆所需条件克隆所需条件注明注明注明注明平端平端平端平端需高浓度的需高浓度的需高浓度的需高浓度的DNADNA和连接酶和连接酶和连接酶和连接酶1)1)非重组体克隆的背景可能较高非重组体克隆的背景可能较高非重组体克隆的背景可能较高非重组体克隆的背景可能较高2)2)外源外源外源外源DNADNA与载体与载体与载体与载体DNADNA结合处的酶切位点可能结合处的酶切位点可能结合处的酶切位点可能结合处的酶切位点
31、可能消失消失消失消失3)3)重组质粒会带有外源重组质粒会带有外源重组质粒会带有外源重组质粒会带有外源DNADNA的串联拷贝的串联拷贝的串联拷贝的串联拷贝不同的突出端不同的突出端不同的突出端不同的突出端用限制性酶酶用限制性酶酶用限制性酶酶用限制性酶酶解后，需纯化解后，需纯化解后，需纯化解后，需纯化载体去除小片载体去除小片载体去除小片载体去除小片段，以提高有段，以提高有段，以提高有段，以提高有效连接效率效连接效率效连接效率效连接效率1)1)载体与外源载体与外源载体与外源载体与外源DNADNA结合处的酶切位点常可保留结合处的酶切位点常可保留结合处的酶切位点常可保留结合处的酶切位点常可保留2)2)非重
32、组克隆的背景较低非重组克隆的背景较低非重组克隆的背景较低非重组克隆的背景较低3)3)外源外源外源外源DNADNA只以一个方向插入到重组质粒中只以一个方向插入到重组质粒中只以一个方向插入到重组质粒中只以一个方向插入到重组质粒中相同的突出端相同的突出端相同的突出端相同的突出端酶切后的线状酶切后的线状酶切后的线状酶切后的线状载体载体载体载体DNADNA常用常用常用常用磷酸酶处理去磷酸酶处理去磷酸酶处理去磷酸酶处理去磷酸化磷酸化磷酸化磷酸化1)1)载体与外源载体与外源载体与外源载体与外源DNADNA结合处的酶切位点常可保留结合处的酶切位点常可保留结合处的酶切位点常可保留结合处的酶切位点常可保留2)2)
33、外源外源外源外源DNADNA会以两个方向插入会以两个方向插入会以两个方向插入会以两个方向插入3)3)重组质粒会带有外源重组质粒会带有外源重组质粒会带有外源重组质粒会带有外源DNADNA的串联拷贝的串联拷贝的串联拷贝的串联拷贝外源DNA片段与载体的连接第53页/共135页2 2）当在载体的以及外源）当在载体的以及外源DNADNA片段两端的限制酶切位点之间，不可能找到恰当的匹配时，片段两端的限制酶切位点之间，不可能找到恰当的匹配时，可采用下述方法解决：可采用下述方法解决：在线状质粒的末端或外源在线状质粒的末端或外源DNADNA片段的末端用片段的末端用DNADNA连接酶接上接头或衔接头，连接酶接上接
34、头或衔接头，这种接头可以是含单一的或多个限制性酶切位点，然后通过适当的限制酶解后进行这种接头可以是含单一的或多个限制性酶切位点，然后通过适当的限制酶解后进行重组。重组。第54页/共135页第55页/共135页使用大肠杆菌使用大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I KlenowI Klenow片段部分补平片段部分补平33凹端。凹端。33凹端转变成粘端。凹端转变成粘端。5TCGAAGCT5xhoI5GATCCTAG5Sau3AI5TCGAAGCT5CTTC5GATCCTAG5AGGCdCTP、dTTP、dATP、dGTPKlenown酶第56页/共135页使用使用KlenowKlenow酶在酶在4 4
35、种种dNTPdNTP存在下，将存在下，将33凹端凹端完全补平或用完全补平或用S1S1核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶、绿豆核酸酶、KlenowKlenow酶、酶、T4DNAT4DNA聚合酶去除聚合酶去除33突出端产生平端突出端产生平端DNADNA分子，可与任何其他平端分子，可与任何其他平端DNADNA分子相连。分子相连。3 3）可以利用末端转移酶分别在载体酶切位点处可以利用末端转移酶分别在载体酶切位点处和外源和外源DNADNA片段的片段的33端加上相互补的同聚尾端加上相互补的同聚尾同聚物加尾法，常用于双链同聚物加尾法，常用于双链cDNAcDNA的分子克隆。的分子克隆。第57页/共135页Pst1质粒
36、pGCTGCAACGTCGpCTGCAGGGGGGpGGpGGGGGGACGTCAAAAAAAmRNAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAACCCCCCTTTTTTTCCCCCC用末端转移酶加（dG）残基用末端转移酶加（dC）残基以oligo(dT)作引物合成cDNA第一链合成cDNA第二链退火第58页/共135页CTGCAGGGGGAAAAAAACCCCCCGGCCCCCCTTTTTTTGGGGGGACGTC转化适当的大肠杆菌菌株选择抗生素抗性转化过程中，DNA上的缺口为宿主酶所修复，从而在cDNA两端恢复Pst1位点Pst1Pst1cDNA第59页/共135
37、页4 4）多聚酶链反应（）多聚酶链反应（PCRPCR）为基因定向重组和构建外）为基因定向重组和构建外源基因高效表达治理提供了一个通用方法。源基因高效表达治理提供了一个通用方法。根据载体上的克隆位点设计根据载体上的克隆位点设计PCRPCR引物，使引物引物，使引物上带有与载体克隆位点相匹配的限制性内切酶识上带有与载体克隆位点相匹配的限制性内切酶识别序列。别序列。第60页/共135页3 3、重组、重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞1)1)转化：转化：由于外源由于外源DNADNA的进入而使细胞遗传性改变称为的进入而使细胞遗传性改变称为转化。采取一些方法处理细胞经处理后的细胞就容转化。采取
38、一些方法处理细胞经处理后的细胞就容易接受外界易接受外界DNADNA，称为感受态细胞：再与外源，称为感受态细胞：再与外源DNADNA接触，接触，就能提高转化效率。就能提高转化效率。第61页/共135页2)2)转导：转导：通过噬菌体或病毒的感染作用将一个细通过噬菌体或病毒的感染作用将一个细胞的遗传信息传递到另一个细胞的过程用噬胞的遗传信息传递到另一个细胞的过程用噬菌体活病毒作载体，以其菌体活病毒作载体，以其DNADNA与目的序列重组后，与目的序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNADNA包包装成有活力的噬菌体或病毒。就能以感染的方装成有活力的噬菌体
39、或病毒。就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制式进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。繁殖。第62页/共135页3)3)转染：转染：重组的噬菌体重组的噬菌体DNADNA也可像质粒也可像质粒DNADNA的方式的方式进入宿主菌，即宿主菌先经过进入宿主菌，即宿主菌先经过CaClCaCl2 2等处理成感等处理成感受态细菌再接受受态细菌再接受DNADNA，进入感受态细菌的噬菌体，进入感受态细菌的噬菌体DNADNA可以同样复制和繁殖。这种方式称为转染可以同样复制和繁殖。这种方式称为转染用人工脂质膜包裹用人工脂质膜包裹DNADNA，形成的脂质体可以通过，形成的脂质体可以通过与细胞膜融合
40、而将与细胞膜融合而将DNADNA导入细胞。导入细胞。第63页/共135页具体方法：氯化钙法氯化钙法电穿孔：电穿孔：将宿主细胞置于一个高强电场中，通过电将宿主细胞置于一个高强电场中，通过电场脉冲在细胞壁上打孔，场脉冲在细胞壁上打孔，DNADNA分子随即进入细胞。分子随即进入细胞。聚乙二醇介导的原生质体转化法：聚乙二醇介导的原生质体转化法：常用于转化酵母以及其他真菌细胞常用于转化酵母以及其他真菌细胞活活跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理变跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理变成球形后，在适当浓度的聚乙二醇成球形后，在适当浓度的聚乙二醇60006000（PEG-PEG-60006000）的
41、介导下将外源）的介导下将外源DNADNA转化入受体细胞中。转化入受体细胞中。第64页/共135页磷酸钙或磷酸钙或DEAEDEAE葡聚糖介导的转染：葡聚糖介导的转染：将外源基因导入哺乳类细胞中瞬时表达的常将外源基因导入哺乳类细胞中瞬时表达的常规方法。规方法。磷酸钙和磷酸钙和DNADNA共沉淀：将被转染的共沉淀：将被转染的DNADNA同正在同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后可能通过内溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后可能通过内吞作用进入受体细胞。吞作用进入受体细胞。DEAEDEAE葡聚糖作用：可能是其与葡聚糖作用：可能是其与DNADNA结合从结合从而抑制核酸酶的作用或与细胞结合从而促进而抑制核酸酶的
42、作用或与细胞结合从而促进DNADNA的内吞作用。的内吞作用。第65页/共135页原生质体融合：原生质体融合：通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合。同培养的哺乳细胞直接融合。脂质体法：脂质体法：将将DNADNA或或RNARNA包裹于脂质体内，然后进行包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜融合将基因导入。脂质体与细胞膜融合将基因导入。细胞核的显微注射法：细胞核的显微注射法：即将目的基因重组体通过显微注射装置即将目的基因重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中。直接注入细胞核中。第66页/共135页4、一般克隆基因的检查和鉴定方法琼脂糖凝胶电
43、泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力 不同迁移率分子量标准参照物l酶切和电泳方法第67页/共135页1 1）、重组质粒的快速鉴定：根据有外源基因插入的重组质粒同载体）、重组质粒的快速鉴定：根据有外源基因插入的重组质粒同载体DNADNA之间大小的差之间大小的差异区分。异区分。2 2）、重组质粒的限制酶解分析。）、重组质粒的限制酶解分析。3 3）、通过）、通过互补使菌落产生的颜色反应来筛选重组体。互补使菌落产生的颜色反应来筛选重组体。第68页/共135页 标志补救（标志补救（marker rescue）若目的基因能够在宿主菌表达，且表达若目的基因能够
44、在宿主菌表达，且表达若目的基因能够在宿主菌表达，且表达若目的基因能够在宿主菌表达，且表达 产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对 营养素的依赖表型来筛选。营养素的依赖表型来筛选。营养素的依赖表型来筛选。营养素的依赖表型来筛选。宿主生长依赖Leu重组体+目的基因能够合成Leu在没有Leu存在时能生长（已转化）重组体转化的细菌中 在没有Leu存在时不生长（没有转化）第69页/共135页4)4)、外源、外源DNADNA片段插入失活片段插入失活如果载体带有两个或多个抗生素抗性基因并在其上分
45、布适宜的可供外源如果载体带有两个或多个抗生素抗性基因并在其上分布适宜的可供外源DNADNA插入的插入的限制性内切酶位点时，当外源限制性内切酶位点时，当外源DNADNA片段插入到一个抗性基因中去时可导致此抗性基片段插入到一个抗性基因中去时可导致此抗性基因失活。因失活。第70页/共135页第71页/共135页5)5)、分子杂交筛选法：、分子杂交筛选法：原位杂交原位杂交点杂交和点杂交和southernsouthern杂交杂交第72页/共135页A.A.核酸的分子杂交技术核酸的分子杂交技术在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNADNA或RNARNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用
46、按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBMDBM）和二乙氨基乙基）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（纤维素滤膜（DEAEDEAE）第73页/共135页B.B.两个步骤两个步骤将核酸样品转移到固体支持物滤膜上将核酸样品转移到固体支持物滤膜上 核酸印迹核酸印迹(nucleic acid blotting)(nucleic acid blotting)转转移移 主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法线印迹法(dot and slot
47、 blotting)(dot and slot blotting)、菌落和、菌落和噬菌斑印迹法噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)(colony and plaque blotting)将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的它标记的DNADNA或或RNARNA探针进行杂交。探针进行杂交。第74页/共135页（1 1）提取总）提取总DNADNA（2 2）酶解）酶解（3 3）电泳）电泳（4 4）转移到滤膜）转移到滤膜（5 5）变性解链）变性解链（6 6）DNADNA探针及杂交探针及杂交（7 7）洗脱）洗脱（8 8）放
48、射自显影）放射自显影（9 9）比较分析）比较分析SouthernSouthern杂交杂交第75页/共135页A.DNAA.DNA体外重组实验体外重组实验 B.B.抗抗生生素素筛筛选选转转化化子子细细胞胞 C.C.培养突变株细胞培养突变株细胞 D.D.SouthernSouthern杂杂交交实实验验结结果果显显示示，外外源源目目的的基基因因已已经转入突变株细胞中经转入突变株细胞中SouthernSouthern杂交分析示例杂交分析示例第76页/共135页6)6)、表达文库的免疫学筛选：、表达文库的免疫学筛选：绝大多数构建绝大多数构建噬菌体的噬菌体的cDNAcDNA文库选用文库选用gt11gt11
49、、ZAPZAP或或ORF8ORF8作为表达载体。作为表达载体。这些噬菌体带有一拷贝的大肠杆菌这些噬菌体带有一拷贝的大肠杆菌LacZLacZ基因，克基因，克隆位点位于翻译终止密码子上游隆位点位于翻译终止密码子上游53bp53bp处。处。cDNAcDNA插入方向和阅读框正确时，可以表达氨基端插入方向和阅读框正确时，可以表达氨基端为为半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融合蛋白，其中一些外源序列将暴露出可用特异抗合蛋白，其中一些外源序列将暴露出可用特异抗体检测的抗原表位。体检测的抗原表位。第77页/共135页LacZ+EcoRIEcoRIEcoRILacZgt11g
50、t11重组文重组文库库感染第78页/共135页在培养基上培养菌落转膜菌落的蛋白质裸露出来一抗与裸露的蛋白质结合二抗与一抗结合显色找出阳性克隆裂解加一抗洗去游离的一抗，加二抗洗去游离的二抗，加显色剂第79页/共135页第80页/共135页7)7)、利用、利用PCRPCR方法来确定基因的重组体。方法来确定基因的重组体。克隆PCR产物；通用引物：pUC/M13primer第81页/共135页8)、DNA的序列分析：这是最后确定分离的基因是否具有与天然基因相同序列的唯一方法，也是最确定的方法。第82页/共135页第四节第四节 获得真核生物目的基因的方获得真核生物目的基因的方法法鸟枪法cDNA的方法DN