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1、DNA重组技术要有四个必要条件：工具酶、基因、载体、受体细胞第1页/共85页DNA限制性内切酶可分为三类：、类限制性内切酶是基因工程中所用的主要工具酶、限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖于ATP的限制性内切酶活性。类酶在识别位点上切割DNA，然后从底物上解离下来。类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的、特异性切割末端。、酶在基因工程中基本不用 第一节限制性内切酶第2页/共85页一、II类限制性内切酶的特点识别特定的核苷酸序列，其长度一般为识别特定的核苷酸序列，其长度一般为4 4、5 5或或6 6个核苷酸且呈二重对称，但有少数酶
2、识别更长个核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序列或兼并序列的序列或兼并序列；具有特定的酶切位点具有特定的酶切位点 ，产生出特定的酶切末端产生出特定的酶切末端55突出粘末端、突出粘末端、33突出粘末端、平末端；突出粘末端、平末端；类限制修饰系统是由两种酶分子组成的二类限制修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统；限制性内切酶、独立的甲基化酶。元系统；限制性内切酶、独立的甲基化酶。第3页/共85页5突出粘性末端EcoRI的识别序列为3突出粘性末端Pst识别位点平端 SmaSma识别位点5G AATTC33CTTAA G5切割5-G -CTTAAAATTC-3 G-5+5CTGCA G33G AC
3、GTC55-CTGCA 3-G G-3ACGTC-5+5CCC GGG3 GGG CCC5CCC GGGGGG3CCC+第4页/共85页二、使用限制性内切酶时应注意的问题1、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限制性内切酶。限制性内切酶。同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，但切割后列，但切割后DNADNA分子所产生的粘性末端却相同，这类分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不同酶切位点的酶为具不同酶切位点的DNADNA片段重组提供了方便片段
4、重组提供了方便，但要但要注意，往往相容的粘性末端再用注意，往往相容的粘性末端再用DNADNA连接酶连接后，都连接酶连接后，都不能再被其切割了。不能再被其切割了。第5页/共85页2、注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶解DNA样品。3、注意说明书中所列出的comments的内容，会提供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基化的信息以及引起酶产生staractivity的原因。star activitystar activity：指当酶的反应条件改变时，其在识别：指当酶的反应条件改变时，其在识别序列中的酶切位点发生改变。序列中的酶切位点发生改变。产生的原因：反应体系中甘油的浓度产生的原因：
5、反应体系中甘油的浓度1212；酶：；酶：DNADNA比率比率25u/g25u/g；缺少；缺少NaclNacl和存在和存在MnMn2 2。第6页/共85页4、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。一般以在一般以在20l20l反应体积中，反应体积中，3737，每小时水解，每小时水解1 1微克微克DNADNA的酶量定为一个酶单位。的酶量定为一个酶单位。5、注意酶在保温过程中的活性变化。ACCACC在在5 5 小时内具有全部活力小时内具有全部活力BamHBamH在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部分活力，而在有部分活力，而在2 2小时以后就无活力了。小
6、时以后就无活力了。CfoCfo仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没有活力了。就没有活力了。第7页/共85页三、连接酶定义：用于将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。用途：（1）、连接带匹配粘末端的DNA分子；（2）、使平末端的双链DNA分子相互连接或与合成的寡核苷酸接头相连接。这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子（子（150-200mmol/LNacl150-200mmol/LNacl）或低浓度的聚乙二醇）或低浓度的聚乙二醇（PEGPEG）可提高连接效率。）可提高连接效率。第8页/共85页
7、四、修饰酶1、DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（klenowfragment）、T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬菌体DNA聚合酶、耐高温DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）、反转录酶、末端脱氧核苷酸转移酶等2、依赖于DNA的RNA聚合酶：SP6噬菌体及T7和T3噬菌体RNA聚合酶用途:在invitro条件，合成单链RNA作为杂交探针。第9页/共85页3、T4噬菌体多核苷酸激酶：催化ATP的磷酸基转移至DNA或RNA片段的5末端。用途：标记DNA片段的5端，制备杂交探针；基因化学合成中，寡核苷酸片段5磷酸化；用于测序引物的5标记。5 HOOH 3HOOH355突出
8、末端5隐蔽末端532 POH 3HO32P3532P ATP第10页/共85页4、碱性磷酸酶：用途：去除DNA片段5末端的磷酸，以防止在重组中自身环化，从而提高重组效率；在用32pATP标记DNA或RNA的5末端前，去除DNA或RNA片段的非标记的5磷酸。5 POH 3HOP355突出末端5隐蔽末端OHHO5HOOH 335第11页/共85页第二节克隆载体基因工程载体应具备的条件：能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制；具有合适的限制性内切酶位点：在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后的外源同限制性内切酶切割后
9、的外源DNADNA片段方便的插入载体片段方便的插入载体；在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增；载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源DNA插入片段：在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失；应该有一个或多个选择标记。第12页/共85页大肠杆菌表达载体应具备：强的启动子，一个强的可诱导的启动子可使外源基因有效的转录；在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD）；在外源基因插入序列的下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。第13页/共85页一、质粒定义：质粒是能自主复制的双链环状定义：质粒是能自主复制的双链环
10、状DNADNA分子，分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。ABOCSCL第14页/共85页F F质粒质粒：有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另：有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息的质粒。一个细胞的信息的质粒。R R质粒质粒：表达对一种抗生素的抗性的质粒。：表达对一种抗生素的抗性的质粒。降解质粒降解质粒：携带参与或控制一些不同寻常的代谢：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因的质粒。途径的基因的质粒。穿梭载体穿梭载体：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复
11、起始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制制。第15页/共85页1、质粒载体pBR322大小为大小为4363bp4363bp；含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；素）；有单一的有单一的BamHBamH、HindHind和和SalSal的识别位点的识别位点（在四环素抗性基因内）、（在四环素抗性基因内）、PstPst识别位点（在识别位点（在氨苄青霉素抗性基因内）；氨苄青霉素抗性基因内）；外源片段在外源片段在BamHBamH、HindHind、PstPst位点插入时，位点插入时，可引起抗生素失活来筛选重组体可引起抗生素失活来筛选重组体。带有一个复制
12、起始点，可以保证这个质粒只在带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复制功能，在大肠杆菌里大肠杆菌里行使复制功能，在大肠杆菌里pBR322pBR322以高拷贝数存在。以高拷贝数存在。第16页/共85页第17页/共85页2 2、质粒载体、质粒载体pUC19pUC19大小为大小为2686bp2686bp；带有带有pBR322pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因；抗性基因；一个大肠杆菌乳糖操纵子一个大肠杆菌乳糖操纵子半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的调节片段（调节片段（lacZlacZ）,一个调节一个调节lacZlacZ基因表达基因表达的阻遏蛋
13、白的基因的阻遏蛋白的基因lacIlacI；含有多个单克隆位点。含有多个单克隆位点。第18页/共85页第19页/共85页第20页/共85页pUC19pUC19的筛选：的筛选：培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTGIPTG，laclac操操纵子的一个诱导物）时，纵子的一个诱导物）时，lacIlacI的产物就不能与的产物就不能与lacZlacZ的启动子区域结合，质粒的启动子区域结合，质粒pUC19pUC19的的lacZlacZ就可以转录，进而翻译，就可以转录，进而翻译，lacZlacZ蛋白会与染色体蛋白会与染色体DNADNA编码的一个蛋白形成具有活性的杂合编码的一个
14、蛋白形成具有活性的杂合半乳糖半乳糖苷酶。苷酶。在底物在底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（X-X-galgal）存在下，）存在下，X-galX-gal会被杂合会被杂合半乳糖苷酶水半乳糖苷酶水解成蓝色的产物，没有插入外源解成蓝色的产物，没有插入外源DNADNA序列的序列的pUC19pUC19质粒克隆就呈蓝色。质粒克隆就呈蓝色。由于由于pUC19pUC19的单克隆位点的序列是整合在的单克隆位点的序列是整合在lacZlacZ之中的，若之中的，若pUC19pUC19质粒中插入有目的质粒中插入有目的DNADNA片段，就片段，就会破环会破环lacZlacZ的结构，导致细胞无法产生
15、功能性的结构，导致细胞无法产生功能性的的lacZlacZ蛋白，也就无法形成杂合的蛋白，也就无法形成杂合的半乳糖苷半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。酶，因而菌落是白色的。第21页/共85页穿梭质粒:人工人工构建的具有两种构建的具有两种不同复制起点和不同复制起点和选择记号，可在选择记号，可在两种不同的寄主两种不同的寄主细胞中存活和复细胞中存活和复制的质粒载体制的质粒载体。第22页/共85页二、噬菌体噬菌体可以进入裂解循环，噬菌体可以进入裂解循环，2020分钟后就可使宿分钟后就可使宿主细胞发生裂解，同时释放出大约主细胞发生裂解，同时释放出大约100100个噬菌个噬菌体颗粒。体颗粒。噬菌体也可以进入溶源循
16、环，即注入的噬菌体也可以进入溶源循环，即注入的DNADNA整整合到大肠杆菌的染色体中，以前噬菌体的形式合到大肠杆菌的染色体中，以前噬菌体的形式潜伏起来，永久保留；但在某种营养条件或是潜伏起来，永久保留；但在某种营养条件或是环境胁迫条件下，整合的环境胁迫条件下，整合的噬菌体噬菌体DNADNA可以切可以切割出来进入溶源循环。割出来进入溶源循环。第23页/共85页第24页/共85页噬菌体噬菌体DNADNA大约长大约长50kb50kb，其中大约，其中大约20kb20kb对于整合切割过程极为关键，称为整合切对于整合切割过程极为关键，称为整合切割（割（I/EI/E）区域。）区域。对于构建文库，可将这对于构
17、建文库，可将这20kbDNA20kbDNA片段去掉，强迫重组的片段去掉，强迫重组的噬菌体进入裂解循噬菌体进入裂解循环。环。整合切割区域尾部基因头部基因粘性末端粘性末端负责DNA复制的基因细胞裂解基因噬菌体的DNA示意图左臂右臂第25页/共85页噬菌体头的大小足以装下噬菌体头的大小足以装下50kb50kb单元的线性单元的线性DNADNA，DNA38kb DNA52kb,DNA52kb,则无法包装进头部。则无法包装进头部。coscos位点（位点（cos sitecos site）就是保证在超长线性就是保证在超长线性DNADNA分子分子上每两个上每两个coscos位点之间为位点之间为50kb,50k
18、b,使使DNADNA分子能正确分子能正确的装配进噬菌体。的装配进噬菌体。在头的入口处有一种酶，在头的入口处有一种酶，它能识别双链线性它能识别双链线性DNADNA分子上的分子上的coscos序列，并在序列，并在coscos序列处切断序列处切断DNADNA分子，使适当大小的分子，使适当大小的DNADNA进入进入噬菌体的头部。噬菌体的头部。第26页/共85页噬菌体DNA分子示意图第27页/共85页第28页/共85页三、柯斯质粒（三、柯斯质粒（cosmidcosmid）可携带可携带40kb40kb大小的大小的DNADNA片段，并在大肠杆菌中片段，并在大肠杆菌中复制保存，复制保存，综合了质粒载体和噬菌体
19、载体二综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优势。者的优势。柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个coscos位位点、点、DNADNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个两个coscos位点之间含有一个限制性内切酶位点位点之间含有一个限制性内切酶位点（RERE）。）。第29页/共85页四、四、YACYAC载体载体目前能容纳最大外源目前能容纳最大外源DNADNA片段的载体是片段的载体是YACYAC（酵（酵母人工染色体，母人工染色体，yeast artificial yeast artificial chromosomechromosome）
20、。）。真核生物染色体三个关键部分：真核生物染色体三个关键部分：着丝粒（着丝粒（centromere,CENcentromere,CEN）,它主管染色体在它主管染色体在细胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中；细胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中；端粒（端粒（telomere,TELtelomere,TEL）,位于染色体的末端，位于染色体的末端，对染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外对染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶切断具有重要的意义；切酶切断具有重要的意义；自主复制序列自主复制序列（autonomously replicating autonomously replicating se
21、quence,ARSsequence,ARS）,即在染色体上的多处即在染色体上的多处DNADNA复复制起始位点。制起始位点。第30页/共85页作为真核基因表达载体应具备如下条件：作为真核基因表达载体应具备如下条件：含有原核基因的复制起始序列（如含有原核基因的复制起始序列（如ColE1ColE1起始序起始序列列oriori）筛选标记；）筛选标记；含有真核基因的复制起始序列（如含有真核基因的复制起始序列（如SV40SV40病毒的病毒的复制序列、酵母的复制序列、酵母的22质粒的复制起始序列质粒的复制起始序列ARSARS、以及真核细胞筛选标记（如氨基糖苷以及真核细胞筛选标记（如氨基糖苷G148G148
22、抗性基抗性基因、在酵母细胞中与自养有关的基因）；因、在酵母细胞中与自养有关的基因）；含有有效地启动子序列（可包含增强子序列等含有有效地启动子序列（可包含增强子序列等各种顺式作用元件）；各种顺式作用元件）；RNARNA聚合酶所需的转录终止和聚合酶所需的转录终止和poly(A)poly(A)加入的信加入的信号序列；号序列；合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点。合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点。第31页/共85页第32页/共85页应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序第33页/共85页利用柯斯质粒克隆大片段DNA第34页/共85页pYAC4结构图第35页/共85页YAC的构建示意图第36页/
23、共85页第三节重组基因的导入和筛选氯化钙法氯化钙法电穿孔：电穿孔：将宿主细胞置于一个高强电场中，通过电将宿主细胞置于一个高强电场中，通过电场脉冲在细胞壁上打孔，场脉冲在细胞壁上打孔，DNADNA分子随即进入细分子随即进入细胞。胞。聚乙二醇介导的原生质体转化法：聚乙二醇介导的原生质体转化法：常用于转化酵母以及其他真菌细胞常用于转化酵母以及其他真菌细胞活活跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理变成球形后，在适当浓度的聚乙二醇变成球形后，在适当浓度的聚乙二醇60006000（PEG-6000PEG-6000）的介导下将外源）的介导下将外源DNADNA转化入转
24、化入受体细胞中。受体细胞中。第37页/共85页磷酸钙或磷酸钙或DEAEDEAE葡聚糖介导的转染：葡聚糖介导的转染：将外源基因导入哺乳类细胞中瞬时表达的常将外源基因导入哺乳类细胞中瞬时表达的常规方法。规方法。磷酸钙和磷酸钙和DNADNA共沉淀：将被转染的共沉淀：将被转染的DNADNA同正在同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后可能通过内溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后可能通过内吞作用进入受体细胞。吞作用进入受体细胞。DEAEDEAE葡聚糖作用：可能是其与葡聚糖作用：可能是其与DNADNA结合从结合从而抑制核酸酶的作用或与细胞结合从而促进而抑制核酸酶的作用或与细胞结合从而促进DNADNA的内吞作用。的
25、内吞作用。第38页/共85页原生质体融合：原生质体融合：通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合。同培养的哺乳细胞直接融合。脂质体法：脂质体法：将将DNADNA或或RNARNA包裹于脂质体内，然后进行包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜融合将基因导入。脂质体与细胞膜融合将基因导入。细胞核的显微注射法：细胞核的显微注射法：即将目的基因重组体通过显微注射装置即将目的基因重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中。直接注入细胞核中。第39页/共85页基因重组的方法：基因重组的方法：根据外源根据外源DNADNA片段末端的性质同载体上适当的片段末端的
26、性质同载体上适当的酶切位点相连实现基因的体外重组。酶切位点相连实现基因的体外重组。当在载体的以及外源当在载体的以及外源DNADNA片段两端的限制酶切片段两端的限制酶切位点之间，不可能找到恰当的匹配时，可采用位点之间，不可能找到恰当的匹配时，可采用下述方法解决：下述方法解决：在线状质粒的末端或外源在线状质粒的末端或外源DNADNA片段的末片段的末端用端用DNADNA连接酶接上接头或衔接头，这种接头连接酶接上接头或衔接头，这种接头可以是含单一的或多个限制性酶切位点，然后可以是含单一的或多个限制性酶切位点，然后通过适当的限制酶解后进行重组。通过适当的限制酶解后进行重组。第40页/共85页使用大肠杆菌
27、使用大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I KlenowI Klenow片段部分补平片段部分补平33凹端。凹端。33凹端转变成粘端。凹端转变成粘端。使用使用KlenowKlenow酶在酶在4 4种种dNTPdNTP存在下，将存在下，将33凹端完全凹端完全补平或用补平或用S1S1核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶、绿豆核酸酶、KlenowKlenow酶、酶、T4DNAT4DNA聚合酶去除聚合酶去除33突出端产生平端突出端产生平端DNADNA分子，分子，可与任何其他平端可与任何其他平端DNADNA分子相连。分子相连。可以利用末端转移酶分别在载体酶切位点处和外可以利用末端转移酶分别在载体酶切位点处和外源源DNA
28、DNA片段的片段的33端加上相互补的同聚尾端加上相互补的同聚尾同聚物同聚物加尾法，常用于双链加尾法，常用于双链cDNAcDNA的分子克隆的分子克隆。第41页/共85页Pst1质粒pGCTGCAACGTCGpCTGCAGGGGGGpGGpGGGGGGACGTCAAAAAAAmRNAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAACCCCCCTTTTTTTCCCCCC用末端转移酶加（dG）残基用末端转移酶加（dC）残基以oligo(dT)作引物合成cDNA第一链合成cDNA第二链退火第42页/共85页CTGCAGGGGGAAAAAAACCCCCC G G CCCCCCTTTT
29、TTTGGGGGGACGTC转化适当的大肠杆菌菌株选择抗生素抗性转化过程中，DNA上的缺口为宿主酶所修复，从而在cDNA两端恢复Pst1位点Pst1Pst1cDNA第43页/共85页多聚酶链反应（多聚酶链反应（PCRPCR）为基因定向重组和构建外源）为基因定向重组和构建外源基因高效表达治理提供了一个通用方法。基因高效表达治理提供了一个通用方法。根据载体上的克隆位点设计根据载体上的克隆位点设计PCRPCR引物，使引物引物，使引物上带有与载体克隆位点相匹配的限制性内切酶识上带有与载体克隆位点相匹配的限制性内切酶识别序列。别序列。第44页/共85页筛选1 1、重组质粒的快速鉴定：根据有外源基因插入的
30、、重组质粒的快速鉴定：根据有外源基因插入的重组质粒同载体重组质粒同载体DNADNA之间大小的差异区分。之间大小的差异区分。2 2、重组质粒的限制酶解分析。、重组质粒的限制酶解分析。3 3、通过、通过互补使菌落产生的颜色反应来筛选重组互补使菌落产生的颜色反应来筛选重组体。体。4 4、外源、外源DNADNA片段插入失活。片段插入失活。如果载体带有两个或多个抗生素抗性基因并在如果载体带有两个或多个抗生素抗性基因并在其上分布适宜的可供外源其上分布适宜的可供外源DNADNA插入的限制性内插入的限制性内切酶位点时，当外源切酶位点时，当外源DNADNA片段插入到一个抗性片段插入到一个抗性基因中去时可导致此抗
31、性基因失活。基因中去时可导致此抗性基因失活。第45页/共85页5 5、分子杂交筛选法：、分子杂交筛选法：原位杂交原位杂交点杂交和点杂交和southernsouthern杂交杂交5353变性、转膜5335加入经标记、变性的探针进行分子杂交53353355*含有杂交信号的DNA分子第46页/共85页6 6、表达文库的免疫学筛选：、表达文库的免疫学筛选：绝大多数构建绝大多数构建噬菌体的噬菌体的cDNAcDNA文库选用文库选用gt11gt11、ZAPZAP或或ORF8ORF8作为表达载体。作为表达载体。这些噬菌体带有一拷贝的大肠杆菌这些噬菌体带有一拷贝的大肠杆菌LacZLacZ基因，克基因，克隆位点位
32、于翻译终止密码子上游隆位点位于翻译终止密码子上游53bp53bp处。处。cDNAcDNA插入方向和阅读框正确时，可以表达氨基端插入方向和阅读框正确时，可以表达氨基端为为半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融合蛋白，其中一些外源序列将暴露出可用特异抗合蛋白，其中一些外源序列将暴露出可用特异抗体检测的抗原表位。体检测的抗原表位。第47页/共85页在培养基上培养菌落转膜菌落的蛋白质裸露出来一抗与裸露的蛋白质结合二抗与一抗结合显色找出阳性克隆裂解加一抗洗去游离的一抗，加二抗洗去游离的二抗，加显色剂第48页/共85页7 7、利用、利用PCRPCR方法来确定基因的重组体。
33、方法来确定基因的重组体。克隆PCR产物；通用引物：pUC/M13 primer第49页/共85页8、DNA的序列分析：这是最后确定分离的基因是否具有与天然基因相同序列的唯一方法，也是最确定的方法。第50页/共85页第四节获得真核生物目的基因的方法一、一、cDNAcDNA的方法的方法分离表达目的基因的组织或细胞：所用材料要分离表达目的基因的组织或细胞：所用材料要尽量新鲜尽量新鲜mRNAmRNA的分离的分离第一链第一链cDNAcDNA链的合成链的合成第二条第二条cDNAcDNA链的合成链的合成cDNAcDNA的甲基化和接头的加入的甲基化和接头的加入双链双链cDNAcDNA与载体相连：与载体相连：插
34、入片段：载体1：13：1基因文库的建立基因文库的建立 第51页/共85页mRNAmRNA的分离的分离 poly(A)poly(A)尾巴可以用来把尾巴可以用来把mRNAmRNA同同rRNArRNA和和tRNAtRNA分离开来：分离开来：1 1、先提取真核细胞的总、先提取真核细胞的总RNARNA；2 2、把总、把总RNARNA通过一个用纤维素填充的柱子；通过一个用纤维素填充的柱子；在纤维素上结合有许多长度大约为在纤维素上结合有许多长度大约为1515个核苷酸的个核苷酸的短链寡聚短链寡聚dToligo(dT)dToligo(dT)或或dTdT1515，真核基因，真核基因mRNAmRNA分子的分子的po
35、ly(A)poly(A)尾巴通过碱基配对作用与尾巴通过碱基配对作用与oligo(dT)oligo(dT)结合，而结合，而其它的其它的RNARNA成分因为没有成分因为没有poly(A)poly(A)尾巴而不能结合尾巴而不能结合 3 3、真核生物、真核生物mRNAmRNA可以用能打断可以用能打断A-TA-T氢键的缓冲氢键的缓冲液洗脱下来。液洗脱下来。第52页/共85页第一链第一链cDNAcDNA链的合成链的合成mRNAmRNA纯化以后，样品中加入短的纯化以后，样品中加入短的oligo(dT)oligo(dT)或或随机引物分子作为引物，同时加入逆转录酶、随机引物分子作为引物，同时加入逆转录酶、缓冲液
36、和缓冲液和4 4种脱氧核糖核苷三磷酸（种脱氧核糖核苷三磷酸（dATPdATP、dTTPdTTP、dGTPdGTP、dCTPdCTP）。）。优点优点：可以最大限度的减少：可以最大限度的减少poly(A)poly(A)模板合成模板合成 cDNA cDNA的可能性；的可能性；缺点缺点：cDNAcDNA合成总是从合成总是从mRNA3mRNA3端开始，在最后端开始，在最后 的的cDNAcDNA文库中，代表文库中，代表mRNA3mRNA3区域的组分所占的比例会区域的组分所占的比例会高，而且对于一些较长的高，而且对于一些较长的mRNAmRNA分子来说，由于反转录分子来说，由于反转录酶在酶在cDNAcDNA合
37、成过程中易从合成过程中易从mRNAmRNA分子上脱开，从而造成分子上脱开，从而造成第一条链合成不完整。第一条链合成不完整。oligo(dT)作为引物第53页/共85页 优点优点：合成的：合成的cDNAcDNA文库可能更好地代表最初文库可能更好地代表最初RNARNA模板模板 所代表的组份；所代表的组份；缺点缺点：由于：由于cDNAcDNA在在RNARNA链上的合成是随机的，易链上的合成是随机的，易产生较大量的非全长的产生较大量的非全长的RNARNA模板转录物，从而影响到全长模板转录物，从而影响到全长的的cDNAcDNA分子的获得率。分子的获得率。因此用总体RNA和oligo(dT)引物是最有效的
38、组合。用逆转录酶在体外合成的用逆转录酶在体外合成的DNADNA链往往不完整，但有链往往不完整，但有一个特点：在合成停止前，一个特点：在合成停止前，DNADNA链会自己折转回来链会自己折转回来几个核苷酸形成一个发夹结构。几个核苷酸形成一个发夹结构。随机引物第54页/共85页第二条第二条cDNAcDNA链的合成链的合成自身引导法自身引导法：利用经一条链上的利用经一条链上的33端序列的折回端序列的折回或发卡自引导法来合成或发卡自引导法来合成效率低，目前已不多用。效率低，目前已不多用。cDNAcDNA第二条链的置换合成法第二条链的置换合成法：作为第一条链合作为第一条链合成反应产物的成反应产物的cDNA
39、cDNA：mRNAmRNA杂交分子充当切口平移的模杂交分子充当切口平移的模板。板。RNaseHRNaseH在杂交分子上的在杂交分子上的mRNAmRNA链上造成切口，产生链上造成切口，产生一系列的一系列的RNARNA引物，它们被的引物，它们被的DNADNA聚合酶聚合酶I I用以合成第二用以合成第二链链效率高，直接利用第一链反应产物，无须进一步效率高，直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化；省去处理和纯化；省去S1S1酶的处理，改善了酶的处理，改善了cDNAcDNA的质量，的质量，使产生全长的使产生全长的cDNAcDNA的机率大大提高。的机率大大提高。引物衔接头法合成双链引物衔接头法合成双链
40、cDNAcDNA：通过将通过将cDNAcDNA两两端加上限制性内切酶位点，使其较方便的克隆入相应端加上限制性内切酶位点，使其较方便的克隆入相应的载体。的载体。第55页/共85页自身引导法第56页/共85页反转录酶RNaseH（部分降解）DNA聚合酶DNA聚合酶DNA连接酶RNA55cDNA第一链33RNA55555555cDNA第一链3cDNA第二链置换合成法第57页/共85页基因文库的建立基因文库的建立基因文库：指将基因组基因文库：指将基因组DNADNA通过限制性内切酶通过限制性内切酶部部分酶解分酶解后（必要时对这些后（必要时对这些DNADNA片段进行密度梯度片段进行密度梯度离心或经制备型凝
41、胶电泳进行分级分离，以选离心或经制备型凝胶电泳进行分级分离，以选择长度适合于插入载体的片段）所产生的基因择长度适合于插入载体的片段）所产生的基因组组DNADNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组产生的克隆群体代表了基因组DNADNA的所有序列。的所有序列。第58页/共85页二、DNA的化学合成1 1、基因片段的全化学合成、基因片段的全化学合成特点：首先合成组成一个基因的所有片段，相特点：首先合成组成一个基因的所有片段，相邻的片段间有邻的片段间有4 46 6碱基的重叠互补，在适当的碱基的重叠互补，在适当的条件下经退火后，用条件下经退
42、火后，用T4DNAT4DNA连接酶将各片段以连接酶将各片段以磷酸二酯键的共价键形式连接成一个完整的基磷酸二酯键的共价键形式连接成一个完整的基因。因。化学合成的化学合成的DNADNA片段纯化后其片段纯化后其55和和33端都为端都为羟基，在组建基因前要将羟基，在组建基因前要将DNADNA片段的片段的55端磷酸端磷酸化（处于基因化（处于基因55端的两个寡核苷酸片段不进端的两个寡核苷酸片段不进行磷酸化，以防止基因本身在行磷酸化，以防止基因本身在DNADNA重组时自身重组时自身环化）。环化）。第59页/共85页基因的化学合成及克隆图解535353退火DNA连接酶退火DNA连接酶退火DNA连接酶退火T4D
43、NA连接酶EcoRBamH合成的DNA全基因AmpTetEcoRBamH合成的基因转化EcoRBamHAmpr TettAmpEcoRBamHAmpr Tett合成的基因第60页/共85页2 2、基因的化学酶促合成、基因的化学酶促合成特点：不需要合成组成完整基因的所有寡核苷特点：不需要合成组成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片断，相邻的酸片段，而是合成其中一些片断，相邻的33末末端有一短的序列互补，在适当的条件下通过退端有一短的序列互补，在适当的条件下通过退火形成模板引物的复合体，然后在存在四种火形成模板引物的复合体，然后在存在四种dNTPdNTP的条件下，用的的条件下，用的DNA
44、DNA聚合酶大片段聚合酶大片段（klenowklenow大片段）去填补互补片段之间的缺口，大片段）去填补互补片段之间的缺口，最后用最后用T4DNAT4DNA连接酶连接及适当的限制性内切酶连接酶连接及适当的限制性内切酶切割后重组入载体。切割后重组入载体。第61页/共85页基因的化学酶促合成图解磷酸化退火DNA多聚酶Iklenow片段dNTP限制性内切酶分子克隆5555第62页/共85页三、利用PCR或RT-PCR分离基因1 1、反应体系具备的条件：反应体系具备的条件：要有与被分离的目的基因要有与被分离的目的基因55和和33端序列互补的端序列互补的DNADNA引引物（约物（约2020个碱基左右）；
45、个碱基左右）；具有热稳定性的酶，如具有热稳定性的酶，如Taq DNATaq DNA聚合酶；聚合酶；dNTPdNTP；作为模板的作为模板的DNADNA分子。分子。第63页/共85页2 2、过程：、过程：变性：模板变性：模板DNADNA置于置于9595的高温下，使双链的高温下，使双链DNADNA的的双链解开变成单链；双链解开变成单链；退火：将反应体系的温度降至退火：将反应体系的温度降至5555左右，使得一左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对；对引物能分别与变性后的两条模板链相配对；延伸：将反应体系温度调整到延伸：将反应体系温度调整到Taq DNATaq DNA聚合酶作聚合酶作用的最适
46、温度用的最适温度7272，然后以目的基因为模板，合，然后以目的基因为模板，合成新的成新的DNADNA链。链。第64页/共85页3 3、引物设计原则：、引物设计原则：33末端序列不能有明显的互补性末端序列不能有明显的互补性易造成引物易造成引物间二聚体，导致非特异间二聚体，导致非特异DNADNA片段的合成；片段的合成；避免引物分子内序列互补避免引物分子内序列互补导致引物分子内双链导致引物分子内双链区或发夹环结构的形成，引物区或发夹环结构的形成，引物33端形成的发夹环端形成的发夹环会引起引物内延伸，而发生在近会引起引物内延伸，而发生在近55端对端对PCRPCR的影的影响不大；响不大；注意熔点温度。注
47、意熔点温度。注意引物内稳定性：注意引物内稳定性：55末端稳定而其末端稳定而其33末端末端不稳定的引物是进行不稳定的引物是进行PCRPCR合成的好引物。合成的好引物。当利用哺乳动物类基因组序列作为当利用哺乳动物类基因组序列作为PCRPCR模板时，模板时，对所用的引物要检查其同对所用的引物要检查其同AluAlu序列或其它短的重复序列或其它短的重复序列的互补性。序列的互补性。第65页/共85页逆转录逆转录PCRPCR（retrotranscription PCR,RT-retrotranscription PCR,RT-PCRPCR）:以以RNARNA为模板，经逆转录获得与为模板，经逆转录获得与RN
48、ARNA互补的互补的DNADNA链即链即cDNA,cDNA,然后以然后以cDNAcDNA链为模板进行的链为模板进行的PCRPCR反应。反应。帽子AAAAA mRNA35TTTTT以其为模板进行PCR扩增逆转录合成cDNA互补链并退火寡聚dT引物第66页/共85页是检测是检测RNARNA分子的良好方法，也是获取测序用模分子的良好方法，也是获取测序用模板板DNADNA的有效手段，同时还是克隆的有效手段，同时还是克隆mRNAmRNA之之cDNAcDNA的的重要步骤。重要步骤。RT-PCRRT-PCR具有很高的敏感性具有很高的敏感性,可以用来分析不同组可以用来分析不同组织或是相同组织不同发育阶段中织或
49、是相同组织不同发育阶段中mRNAmRNA表达状况表达状况的相关性；的相关性；可以用来研究低表达活性基因的可以用来研究低表达活性基因的mRNAmRNA生理变化生理变化动态。动态。第67页/共85页判断根据琼脂糖凝胶电泳中样品条带的强度比较，便能确定两种PCR反应产物之间的数量关系。前提条件所测定的mRNA分子必须来自由一个或数个间隔子的基因。第68页/共85页锚定锚定PCRPCR：特别适合预扩增那些只知道一段序列的目的特别适合预扩增那些只知道一段序列的目的DNADNA。对于一端序列已知，一端序列未知的对于一端序列已知，一端序列未知的DNADNA片段，片段，可以通过可以通过DNADNA末端转移酶给
50、未知序列的那一端加末端转移酶给未知序列的那一端加上一段多聚上一段多聚dGdG的尾巴，然后用多聚的尾巴，然后用多聚dCdC和已知序和已知序列作为引物进行列作为引物进行PCRPCR扩增。扩增。第69页/共85页53DNA序列GGGGG 353GGGGG5GGGGG 353GGGGG5锚定引物CCCCC（多聚dC引物）进行PCR扩增5GGGGG 3CCCCC加多聚dG尾巴加入引物已知序列扩出的未知序列第70页/共85页反向反向PCRPCR特别适合用于扩增已知序列两端的未知序列特别适合用于扩增已知序列两端的未知序列方法：选择一个在已知序列中没有，而在其两方法：选择一个在已知序列中没有，而在其两侧都存在