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1、基因重组与基因工程技术课件 基因工程亦称遗传工程，即利用基因工程亦称遗传工程，即利用DNADNA重组技重组技术的方法，把术的方法，把DNADNA作为组件，在细胞外将一种作为组件，在细胞外将一种外源外源DNADNA（目的基因）和载体（目的基因）和载体DNADNA重新组合连接重新组合连接（重组），最后将重组体转入（重组），最后将重组体转入宿主宿主细胞，使外细胞，使外源基因源基因DNADNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（殖（cloningcloning，克隆），或最后得到表达，最，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性终获得基因表达产物或
2、改变生物原有的遗传性状。状。基因重组技术作为分子生物学最重要、最基因重组技术作为分子生物学最重要、最基本的技术之一，是许多分子生物基本的技术之一，是许多分子生物,生物化学生物化学和细胞生物学实验实施的基础。和细胞生物学实验实施的基础。现代基因工程的创始人现代基因工程的创始人现代基因工程的创始人现代基因工程的创始人PPPP伯格伯格伯格伯格（美国（美国（美国（美国,1926,1926,1926,1926）在）在）在）在1960196019601960年以年以年以年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人敏锐的科学预见力提出一
3、个大胆的设想：是否可以创造出一种人敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？和治疗某些疾病的需要呢？和治疗某些疾病的需要呢？和治疗某些疾病的需要呢？1972197219721972年，伯格把两种病毒的年，伯格把两种病毒的年，伯格把两种病毒的年，伯格把两种病毒的DNADNADNADNA用同用同用同用同一种限制性内切酶切割后，再用一种限制性
4、内切酶切割后，再用一种限制性内切酶切割后，再用一种限制性内切酶切割后，再用DNADNADNADNA连接酶把这两种连接酶把这两种连接酶把这两种连接酶把这两种DNADNADNADNA分子连接分子连接分子连接分子连接起来，于是产生了一种新的重组起来，于是产生了一种新的重组起来，于是产生了一种新的重组起来，于是产生了一种新的重组DNADNADNADNA分子，首次实现两种不同生分子，首次实现两种不同生分子，首次实现两种不同生分子，首次实现两种不同生物的物的物的物的DNADNADNADNA体外连接，获得了第一批重组体外连接，获得了第一批重组体外连接，获得了第一批重组体外连接，获得了第一批重组DNADNAD
5、NADNA分子，这标志着基因工分子，这标志着基因工分子，这标志着基因工分子，这标志着基因工程程程程技术的诞生。伯格因此获得了技术的诞生。伯格因此获得了1980198019801980年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖。1973197319731973年，美国斯坦福大学教授年，美国斯坦福大学教授年，美国斯坦福大学教授年，美国斯坦福大学教授SSSS科恩科恩科恩科恩和加州大学旧金山分和加州大学旧金山分和加州大学旧金山分和加州大学旧金山分校教授校教授校教授校教授HWHWHWHW博耶博耶博耶博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另将两个不
6、同的质粒（一个是抗四环素质粒，另将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这抵抗两种药物，而且这种大
7、肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明表明表明表明“杂合质粒杂合质粒杂合质粒杂合质粒”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。科恩随后以科恩随后以DNADNA重组技术发明人的身份向美重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破
8、了，人类可以根据自己形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。新的生命类型。19771977年，吉尔伯特（年，吉尔伯特（WGilbertWGilbert）分别将编）分别将编码胰岛素和干扰素的码胰岛素和干扰素的DNADNA经过体外重新拼接后，经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。素和干扰素。DNA重组的基本模式重组的基本模式 分（离目的基因）分（离目的基因）切（割目的基因和载体）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）接（连目的
9、基因和载体）转（化宿主细胞）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）表（达目的基因）“纵向”体系 目的基因目的基因基因载体基因载体重组体重组体分切接转筛表总体技术路线总体技术路线(分分)-目的基因及载体的分离目的基因及载体的分离需要克隆的需要克隆的DNADNA片段：片段：化学合成法化学合成法 cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库文库聚合酶链式反应聚合酶链式反应目的基因的获取目的基因的获取从基因所在生物直接取得从基因所在生物直接取得-用限制酶剪切供体用限制酶剪切供体DNADNA-用机械的方法用机械的方法eg eg 超声波超声波化学合成法化学合成法人工合成：
10、人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。较短的核酸片段编码小分子多肽的基因。较短的核酸片段（60-80bp60-80bp）多肽链的氨基酸顺序多肽链的氨基酸顺序mRNA的碱基排列顺序的碱基排列顺序相应的基因结构相应的基因结构化学合成目的基因化学合成目的基因化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。基因。化学合成的不足之处在于：化学合成的不足之处在于：-要已知基因的核苷酸顺序；要已知基因的核苷酸顺
11、序；-基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百的短片段，短片段越多，要连接成正确的几百的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；基因顺序就越困难，得率越低；-价格昂贵。价格昂贵。用途：用途：PCRPCR引物引物,测序引物测序引物,定点突变定点突变,核酸杂交探针核酸杂交探针从基因文库中筛选从基因文库中筛选将某一种基因将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与用适当的限制酶切断后，与载体载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含重组，再全部转
12、化宿主细胞，得到含全部基因组全部基因组DNA的种群，称为的种群，称为G文库文库(genomic DNA library)。将某种细胞的全部将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为种群，称为C-文库文库(cDNA library)。C-文库具文库具有组织细胞特异性。有组织细胞特异性。从从mRNA反转录合成反转录合成cDNA构建基因文库获取目的构建基因文库获取目的基因存在的问题基因存在的问题费时费事费时费事内含子序列内含子序列反转录人工合成互补反转录人工合成互补DNA方法的优势方法的优势 获取
13、的获取的DNA片段往往是片段往往是 具有特定功能的目的基因具有特定功能的目的基因聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）如已知目的基因两如已知目的基因两端的序列，则可采端的序列，则可采用聚合酶链反应技用聚合酶链反应技术，在体外合成目术，在体外合成目的基因。但此法可的基因。但此法可能会造成克隆的目能会造成克隆的目的基因碱基序列的的基因碱基序列的改变。改变。载体载体DNA的选择的选择理想载体的基本条件：理想载体的基本条件：可转移性可转移性,为目的基因提供进入受体细胞的为目的基因提供进入受体细胞的转转移移能力。能力。合适的复制位点合适的复制位点,为目
14、的基因提供在受体细胞为目的基因提供在受体细胞中的中的复制能力或整合能力复制能力或整合能力。多克隆位点：广泛、特异多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源分子较小，可容纳较大的外源DNA质粒质粒噬菌体噬菌体腺病毒载体腺病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体种类：种类：质粒载体的一般结构质粒载体的一般结构存在于细菌存在于细菌染色体外的染色体外的小型环状小型环状DNADNA分子。分子。具有具有自我复自我复制制功能。功能。带有抗性基带有抗性基因及表型识因及表型识别等别等遗传性遗传性标记物标记物。经改造后具经改造后具有有多克隆位多克隆位点。点。DNA
15、重组的基本模式重组的基本模式 分（离目的基因）分（离目的基因）切（割目的基因和载体）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）表（达目的基因）“纵向”体系切切-限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切酶切载体和目的基因的切断载体和目的基因的切断通常采用限制性核酸内切酶通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。和目的基因进行切断，以便于重组。限制酶目前
16、已经发现限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序多种，所识别的顺序往往为往往为4-8个碱基对，且有回文结构。个碱基对，且有回文结构。由限制酶切断后的末端可形成平端、由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出突出粘性末端和粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。形成突出粘性末端三种情况。形成粘性末端粘性末端(cohesive end)者较有利于载体者较有利于载体DNA和目的基因的重组。和目的基因的重组。酶切酶切 -双酶切：双酶切：体系体系：选择合适的缓冲体系，尤其是双酶切反应中。：选择合适的缓冲体系，尤其是双酶切反应中。DNA：经过纯化的，尽量不含有蛋白质，酒精等杂：经过纯化的，尽量不含有蛋白质，酒
17、精等杂质。质。时间时间：一般为：一般为5-7h，载体，载体overnight以保证酶切完全。以保证酶切完全。不能时间过长，以防止内切酶的不能时间过长，以防止内切酶的star活性，降低特活性，降低特异性。异性。酶切之后立即回收，小片段用酶切之后立即回收，小片段用PCR-purification Kit 除去，除去，大的片段要用切胶回收去除。大的片段要用切胶回收去除。T-vectorT-vector两条链的两条链的5端含有一个游离的端含有一个游离的TPCR过程中，普通的过程中，普通的Taq酶可在产物的酶可在产物的3端多加一个端多加一个ADNA重组的基本模式重组的基本模式 分（离目的基因）分（离目的
18、基因）切（割目的基因和载体）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）表（达目的基因）“纵向”体系接接-载体和目的基因的连接载体和目的基因的连接（一）粘性末端连接法：（一）粘性末端连接法：当载体当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即连
19、接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。可封闭其缺口，得到重组体。较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。接。即将带有切口的载体与所获得的目的基因即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的连接起来，得到重新组合后的DNADNA分子。分子。载体载体DNA与目的基因的连接与目的基因的连接（二）人工接尾法：（二）人工接尾法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。粘性末端时，可采用此方法。此法首先使
20、用单链核酸酶将粘性末端切平，再此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上端，如载体上添加一段添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由再由DNA连接酶连接。连接酶连接。末端转移酶（末端转移酶（terminal transferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidy
21、l transferase），它所催化的反应与），它所催化的反应与DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有以含有的片段为引物，在的片段为引物，在端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性平头上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。末端。（三）人工接头连接法：（三）人工接头连接法：将人工连接器（将人工连接器（linker，即一段人工合成的含有，即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子多种限制酶切点的小分子DNA片段，约片段，约1020个个核苷酸）连接到平末端核苷酸）
22、连接到平末端DNA分子分子(载体和目的基载体和目的基因因)上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。点。连接体系的建立：连接体系的建立：温度：粘末端连接：温度：粘末端连接：12-18(16-20 hours)平末端连接：室温（低于平末端连接：室温（低于30)DNA量：载体分子数量：载体分子数/目的基因分子数目的基因分子数=1：3-5酶量：平端连接时需加大酶量酶量：平端连接时需加大酶量 连接反应体
23、系越小越好，相对而言，酶切体系稍大连接反应体系越小越好，相对而言，酶切体系稍大较好较好连接失败后连接失败后-一步一步向上游检测问题所在，所以分子一步一步向上游检测问题所在，所以分子 克隆部分克隆部分“留一半留一半”的原则有时候是很有用的。的原则有时候是很有用的。酶切是否完全，所以要做载体的自连对照。酶切是否完全，所以要做载体的自连对照。载体酶切回收是否考虑到切除片段的大小，载体酶切回收是否考虑到切除片段的大小，是否要用切胶回收更保险。是否要用切胶回收更保险。DNA重组的基本模式重组的基本模式 分（离目的基因）分（离目的基因）切（割目的基因和载体）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）接（
24、连目的基因和载体）转（化宿主细胞）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）表（达目的基因）“纵向”体系转转-重组体的转化重组体的转化受体细胞重组体的转化重组体的转化宿主菌或受体细胞宿主菌或受体细胞原核系统原核系统 -大肠杆菌大肠杆菌 -枯草杆菌枯草杆菌真核系统真核系统 -酵母菌酵母酵母菌酵母 -昆虫细胞昆虫细胞 -哺乳动物细胞哺乳动物细胞原核细胞的转化（细菌转化）原核细胞的转化（细菌转化）受体细胞的选择：受体细胞的选择：限制缺陷型限制缺陷型:避免修饰和降解避免修饰和降解重组缺陷型：重组缺陷型：避免重组整合避免重组整合转化亲和型：转化亲和型：较高的可转化性较高的可转化性遗
25、传互补型：遗传互补型：利于筛选利于筛选感染缺陷型：感染缺陷型：防止感染防止感染感受态细胞感受态细胞（competent cell）所谓感受态，所谓感受态，就是细菌吸收转化因子的生理状就是细菌吸收转化因子的生理状态。态。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后等化学试剂法）的处理后,细胞膜的通透性细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源发生了暂时性的改变，成为能允许外源D
26、NA分分子进入的感受态细胞（子进入的感受态细胞（Competent cells）。）。大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备(化学方法化学方法)大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞CaClCaCl2 2处理处理 目前常用的感受态细胞制备方法是目前常用的感受态细胞制备方法是CaCl2法法,CaCl2 法简便易行法简便易行,且其转化效率完全可以满足且其转化效率完全可以满足一般实验的要求一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用制备出的感受态细胞暂时不用时时,可加入占总体积可加入占总体积15的无菌甘油于的无菌甘油于-70保存保存(半年半年),因此因此CaCl2法为使
27、用更广泛。法为使用更广泛。一、一、受体菌的培养受体菌的培养 从从LB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E.coli DH5单菌落单菌落,接种于接种于3-5ml LB液体培养基中，液体培养基中，37下振荡培养下振荡培养12小时左右小时左右,直至对数生直至对数生长后期。将该菌悬液以长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于的比例接种于100ml LB液液体培养基中，体培养基中，37振荡培养振荡培养2-3小时至小时至OD600 0.5左右。左右。二、二、感受态细胞的制备感受态细胞的制备(CaCl2 法法)将培养液转入离心管中将培养液转入离心管中,冰上放置冰上放置10分钟，然后于分钟，然后
28、于4下下3000g离心离心10分钟。分钟。弃去上清弃去上清,用预冷的用预冷的0.05 mol/L的的CaCl2 溶液溶液10ml轻轻悬浮细轻轻悬浮细胞胞,冰上放置冰上放置15-30分钟后，分钟后，4下下3000 g离心离心10分钟。分钟。弃去上清弃去上清,加入加入4ml预冷含预冷含15%甘油的甘油的0.05 mol/L的的CaCl2 溶溶液液,轻轻悬浮细胞轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成感受态细胞分装成200l的小份的小份,贮存于贮存于-70可保存半年。可保存半年。感受态细胞的制备的操作步骤感受态细胞的制备的操作步骤 为了提高
29、转化效率为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要实验中要考虑以下几个重要因素：因素：细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于不要用经过多次转接或储于的的培养菌，最好从培养菌，最好从70或或-20甘油保存的菌种中直接转甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。来控制。DH5菌株的菌株的OD600 为为0.5时时,细胞密度在细胞密度在5107 个个/ml左右左右(不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同)
30、,这时比较合适。密度过高或这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。不足均会影响转化效率。试剂的质量试剂的质量:所用的试剂所用的试剂,如如CaCl2 等均需是最高纯度的等均需是最高纯度的(GR.或或AR.),并用超纯水配制并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗最好分装保存于干燥的冷暗处。处。防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行件下进行,所用器皿所用器皿,如离心管如离心管,tip头等经高压灭菌处理头等经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、且注意防止被其它试剂、DNA酶或酶或杂杂DNA所污
31、染所污染,否则均会影响转化效率或杂否则均会影响转化效率或杂DNA的转入的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞得到噬菌斑或单菌落得到噬菌斑或单菌落与重组与重组DNADNA共同冰浴共同冰浴而后而后4242短暂热刺激短暂热刺激CaClCaCl2 2处理处理受体细菌受体细菌50-100mmol/LCaCl2 感受态感受态细菌细菌重组体转重组体转入细菌入细菌转转 化化从从-70冰箱中取冰箱中取200l感受态细胞悬液感受态细胞悬液,室温下使其解冻，解室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。冻后立即置冰上。加入加
32、入pBS质粒质粒DNA溶液溶液(含量不超过含量不超过50 ng,体积不超过体积不超过10l)，轻轻摇匀，冰上放置轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。分钟后。42水浴中热击水浴中热击90秒或秒或37水浴水浴5分钟，热击后迅速置于冰上分钟，热击后迅速置于冰上冷却冷却3-5分钟。分钟。向管中加入向管中加入1ml LB液体培养基液体培养基(不含不含Amp)，混匀后，混匀后37振荡振荡培养培养1小时，使细菌恢复正常生长状态小时，使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗并表达质粒编码的抗生素抗性基因生素抗性基因(Ampr)。将上述菌液摇匀后取将上述菌液摇匀后取100l 涂布于含涂布于含Amp的筛选平板上，正的
33、筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37培养培养16-24小时。小时。计算转化率。计算转化率。转化的操作步骤转化的操作步骤 为了提高转化效率为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因实验中要考虑以下几个重要因素：素：用于转化的质粒用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源入的外源DNA的量过多或体积过大时的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。转化效率就会降低。1 ng的
34、的cccDNA即可使即可使50l 的感受态细胞达到饱和。当所的感受态细胞达到饱和。当所转化的很难得时（如用从相对难得的样品中提取转化的很难得时（如用从相对难得的样品中提取mRNA而合成的而合成的cDNA),这就显得格外重要。这就显得格外重要。一般情况下一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。对照实验对照实验E.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源DNA进入受进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法
35、高体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高23个数量级。个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。这种方法也可用于真核生物的转染。转化方法转化方法真核细胞的转染真核细胞的转染受体细胞系统受体细胞系统 永生细胞系永生细胞系 细胞特异性的选择标记细胞特异性的选择标记对抗某种药物对抗某种药物电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加溶液加入到入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸
36、钙沉淀并将组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将胞饮作用将DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的核酸酶水解。被细胞内的核酸酶水解。磷酸钙介导的转染重组体重组体 +磷酸钙微粒磷酸钙微粒内吞作用内吞作用重组体进入细胞重组体进入细胞大颗粒大颗粒转染方法转染方法基因枪转染法：基因枪转染法：利用被电场或机械加速的金属微粒能够进利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先
37、将入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属微溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。属微粒直接进入细胞内。激光微束穿孔法：激光微束穿孔法：利用直径很小、能量很高的激光束在细利用直径很小、能量很高的激光束在细胞表面引起可逆性的穿孔，使胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA进入细胞。进入细胞。显微注射法：显微注射法：利用毛细管直接将利用毛细管直接将DNA注入细胞内。注入细胞内。脂质体（脂质体（liposome）介导法：）介导法：将将DNA包裹在人工制备的磷包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过
38、脂质体与细胞膜的融合而脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将将DNA导入细胞内。导入细胞内。多聚物介导法：多聚物介导法：利用多聚物如利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、离子、DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。进入细胞内。DNA重组的基本模式重组的基本模式 分（离目的基因）分（离目的基因）切（割目的基因和载体）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）转（化宿主细胞）
39、筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）表（达目的基因）“纵向”体系重组体克隆的筛选与鉴定重组体克隆的筛选与鉴定转化后的克隆群体：阳性重组子的阳性重组子的筛选与筛选与鉴定鉴定遗传检测法遗传检测法(根据重组载体的标志作筛选根据重组载体的标志作筛选)-插入失活法插入失活法 -互补法互补法限制性酶切法限制性酶切法PCR法法杂交筛选法杂交筛选法免疫学方免疫学方 法法核苷酸序列测定法核苷酸序列测定法 遗传检测法遗传检测法菌株为某种抗菌株为某种抗生缺陷型，生缺陷型，而而质粒上带有该质粒上带有该抗性基因（如抗性基因（如氨苄青霉素，氨苄青霉素，卡拉霉素等）卡拉霉素等）这样只有转化这样只有转化子才能在含
40、该子才能在含该抗生素的培养抗生素的培养基上长出。基上长出。对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭插入灭活法活法进行筛选。如进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。的细菌即为带
41、重组体的细菌。如果外源如果外源DNA插入，氨卞青霉插入，氨卞青霉素抗性基因失活素抗性基因失活如果外源如果外源DNA插插入，四环素抗性入，四环素抗性基因失活基因失活pBR322pBR322质粒结构质粒结构pBR322AmpTet插入片段插入片段插入片段插入片段AmpAmpAmpAmp平板平板平板平板TetTetTetTet平板平板平板平板-互补法互补法蓝白筛选蓝白筛选现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大肠杆菌现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有的短区段，其中含有半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）的）的调控序列和调控序列和N端个氨基酸偏码区（全长端个氨基酸偏
42、码区（全长1201氨基酸）氨基酸）。这个编码区中插入一个多克隆位点。这个编码区中插入一个多克隆位点。受体菌是受体菌是Z基因突变型，只含编码基因突变型，只含编码半乳糖苷酶端半乳糖苷酶端aa的的序列。当外源基因插入时，在序列。当外源基因插入时，在IPTG（异丙基硫代（异丙基硫代-D-半乳半乳糖苷）诱导下合成糖苷）诱导下合成半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端片断，和受体菌的端片断，和受体菌的C端端片断溶为一体后，可产生蛋白质间的互补，形成有活性的片断溶为一体后，可产生蛋白质间的互补，形成有活性的半乳糖苷酶，称半乳糖苷酶，称互补。互补。具有具有互补的细菌培养在含互补的细菌培养在含IPTG及及X-gal（5-溴溴
43、-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷）的培养基上。半乳糖苷）的培养基上。X-gal本身是无色的，在半乳本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的深兰色的5-溴溴-4-氯靛兰），因此会形成蓝色菌落。氯靛兰），因此会形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入突变失活，而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入突变失活，则不能产生则不能产生互补，因此菌落是白色的。通过颜色不同而区互补，因此菌落是白色的。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。分重组子和非重组子。IPTG起诱导表达的作用，相当于乳
44、糖，但它的诱导效率远起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。高于乳糖。-互补互补法法限制性酶切法限制性酶切法 经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。目的基因。凝胶
45、电泳检测凝胶电泳检测加加样样孔孔DNA MarkerDNA MarkerDNA MarkerDNA Marker空质粒空质粒空质粒空质粒重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒 重组质粒酶切重组质粒酶切重组质粒酶切重组质粒酶切重组质粒的重组质粒的重组质粒的重组质粒的PCRPCRPCRPCR扩增片段扩增片段扩增片段扩增片段PCR法法利用的目标引物利用的目标引物(例如分离目的基因所使用的引物例如分离目的基因所使用的引物)，抽提需要筛选的克隆的重组，抽提需要筛选的克隆的重组DNA作为模板作为模板,进行进行PCR扩增扩增,根据是否扩增出目的片段来确定阳根据是否扩增出目的片段来确定阳性克隆。性克隆。杂交筛选法杂
46、交筛选法为了进一步鉴定重组基因体为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的的基因部分互补的DNA片段片段作为探针，与含有重组体的作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。可确定重组体中带目的基因。32P标记的标记的DNA分子探针分子探针杂交杂交放射自显影法放射自显影法依据：碱基互补配对原则依据：碱基互补配对原则步骤：步骤：合成核酸探针（与所需基因互补的核苷酸短链，合成核酸探针（与所需基因互补的核苷酸短链，并用同位素标记）并用同位素标记）升高温度或
47、改变升高温度或改变pH使使DNA变性变性 分子杂交（常用原位分子杂交）如果基因文库分子杂交（常用原位分子杂交）如果基因文库中的一个中的一个DNA片段能和探针结合形成双链，这一片段能和探针结合形成双链，这一片段即含有所需基因。片段即含有所需基因。分子杂交分子杂交免疫化学检测法免疫化学检测法滤膜（固定抗体）滤膜（固定抗体）+DNA序列分析法序列分析法该方法通常是用在目的基该方法通常是用在目的基因筛选后最终的鉴定。因筛选后最终的鉴定。ACTGAAGGCT真核细胞的筛选真核细胞的筛选新霉素抗性选择系统：新霉素抗性选择系统：新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有抑制新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物
48、没有抑制作用，但新霉素的类似物作用，但新霉素的类似物G418对真核细胞及原核细对真核细胞及原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真）能在真核细胞中表达并能使核细胞中表达并能使G418失活（失活（neo基因编码一个基因编码一个磷酸转移酶），细胞可以生长。磷酸转移酶），细胞可以生长。真核细胞的筛选标记真核细胞的筛选标记新霉素类药物 G418筛选AmNeoNeoPoriG418灭活灭活（-）蛋白质蛋白质合成合成tk-细胞突变株筛选转染细胞细胞突变株筛选转染细胞选择原理：选择原理：tk(胸苷激酶胸苷激酶)基因的筛选：受体细胞必须是相基因的筛选：受体细胞必
49、须是相应的应的tk-，将细胞培养在含，将细胞培养在含HAT（H：黄嘌呤，：黄嘌呤，A：氨甲喋呤，：氨甲喋呤，T：胸苷）的培养基中。在：胸苷）的培养基中。在A存存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成成AMP、TMP及及GMP。这三种核苷酸的合成。这三种核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有只能有补偿途径合成，必须具有tk基因的存在基因的存在细胞才可生长。细胞才可生长。氨基喋呤筛选法氨基喋呤(HAT选择)核酸从头合成（-）核酸补救合成（TK酶）TK-TKTK+DNA重组的基本模式重组的基本模式 分（离目的基因）分（离目的基因）切（割目的基因和载体）切
50、（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）表（达目的基因）“纵向”体系外源基因在宿主细胞中的表达外源基因在宿主细胞中的表达重组子重组子目的基因目的基因的的mRNAmRNA表达蛋白质表达蛋白质大肠杆菌（E.coliE.coli）受体细胞外源基因在宿主细胞中的表达外源基因在宿主细胞中的表达原核生物基因结构和表达特点原核生物基因结构和表达特点原核生物染色体原核生物染色体DNA是裸露的环形是裸露的环形DNA，其转，其转录和翻译是偶联的连续进行。录和翻译是偶联的连续进行。原核生物形成多顺反子原核生物形成