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1、A 用于核酸操作的工具酶2 2 重组重组DNADNA技术所需的基本条件技术所需的基本条件限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶核酸酶核酸酶核酸修饰酶核酸修饰酶第1页/共90页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链识别双链DNADNA分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割DNADNA双链；双链；主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNADNA的入侵。的入侵。细菌的限制与修饰作用细菌的限制与修饰作用：hsd hsd RR：编码限制性核酸内
2、切酶编码限制性核酸内切酶hsd hsd MM：编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶hsd hsd SS：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达编码限制性酶和甲基化酶的协同表达19681968年，年，SmithSmith等人首先从等人首先从流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌dd株中分离出株中分离出HinHind IId II和和HinHind IIId III。第2页/共90页限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型主要特性主要特性 I I 型型 II II 型型 III III 型型限制修饰限制修饰多功能多功能单功能单功能双功能双功能蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二
3、聚体辅助因子辅助因子ATP MgATP Mg2+2+SAM SAMATP MgATP Mg2+2+SAM SAMMgMg2+2+识别序列识别序列TGANTGAN88TGCTTGCT旋转对称序列旋转对称序列GAGCCGAGCCAACNAACN66GTGCGTGCCAGCAGCAGCAG切割位点切割位点距识别序列距识别序列11kbkb处处识别序列内或附近识别序列内或附近距识别序列下游距识别序列下游随机性切割随机性切割特异性切割特异性切割24-2624-26bpbp处处限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第3页/共90页限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名属名属名 种名种名 株名株名H i n
4、H i n d IId II H i n H i n d IIId IIIH Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae d d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d d株株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第4页/共90页II II 型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链识别双链DNADNA分子中分子中4-84-8对碱基的特定序列对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型识
5、别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构5 5 G C T G C T G A A T T CG A A T T C G A G G A G 333 3 C G A C G A C T T A A GC T T A A G C T C C T C 55EcoEcoR I R I 的识别序列的识别序列EcoEcoR I R I 的切割位点的切割位点限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第5页/共90页EcoEcoR I R I 等产生的等产生的 5 5 粘性末端粘性末端55 GG-CC-TT-GG-AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-GG 3 333 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA
6、-AA-GG-CC-TT-CC 5 5EcoEcoRI 37 RI 37 55 GG-CC-TT-GG-OHOH PP-AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA-AA-PP OHOH-GG-CC-TT-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 55 GG-CC-TT-GG AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA-AA GG-CC-TT-C 5C 5HOHOPPOHOHPP第6页/共90页PstPst I I 等产生的等产生的 33 粘性末端粘性末端55 GG-CC-TT-C
7、C-TT-GG-CC-AA-GG-GG-AA-GG 3 333 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-TT-CC-CC-TT-CC 5 5PstPst I 37 I 37 55 GG-CC-TT-CC-TT-GG-CC-AA-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-GG-PP OHOH-AA-CC-GG-TT-CC-CC-TT-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 55 GG-CC-TT-CC-TT-GG-CC-AA GG-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-TT-CC-CC-TT-C 5C 5HOHOPPOHOHPP第
8、7页/共90页Pvu Pvu IIII等产生的平头末端等产生的平头末端55 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-C 5C 5PvuPvu II 37 II 37 55 GG-CC-TT-CC-AA-GG-OHOH PP-CC-TT-GG-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-GG-TT-CC-PP OHOH-GG-AA-CC-CC-TT-C 5 C 5 第8页/共90页II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分大部分II II 型核
9、酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HClTris-HCl50 mM pH 7.550 mM pH 7.5MgClMgCl2210 mM10 mMNaClNaCl0-150 mM0-150 mMDTTDTT1 mM1 mM0-50 mM 0-50 mM 低盐酶低盐酶100 mM 100 mM 中盐酶中盐酶150 mM 150 mM 高盐酶高盐酶VolumeVolume20-100 20-100 mmllT TT T37 37 1-1.5 1-1.5 hrhr1 1 U U 核酸内切酶的酶活性：核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应在最佳反应条件下反应 1 1
10、 小时，完全水解小时，完全水解1 1 mmg g 标准标准DNADNA所需的酶量。所需的酶量。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第9页/共90页II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：55GCTACATGCTACATGGATCCCGGGGGATCCCGGGTTCGCAT3TTCGCAT333CGATGTACGATGTACCTAGGGCCCCCTAGGGCCCAAGCGTA5AAGCGTA555GCTACATGCTACATG GATCCCGGGG GATCCCGGGT
11、TCGCAT3 TTCGCAT3 33CGATGTACGATGTACCTAG GGCCCCCTAG GGCCCAAGCGTA5AAGCGTA555GCTACATGCTACATGGATCCC GGGGGATCCC GGGTTCGCAT3TTCGCAT333CGATGTACGATGTACCTAGGG CCCCCTAGGG CCCAAGCGTA5AAGCGTA5II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶BamBamH I H I SmaSma I I第10页/共90页对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下
12、列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.10.1倍体积的倍体积的 5 5 M NaAc pH 5.4M NaAc pH 5.42.52.5倍体积的冰冷乙醇倍体积的冰冷乙醇冰浴冰浴 5 5 分钟、高速冷冻离心分钟、高速冷冻离心1010分钟、干燥分钟、干燥II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶
13、解反应的操作限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第11页/共90页影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素DNADNA样品的纯度：样品的纯度：存在蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、存在蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTAEDTA、SDSSDS、NaClNaCl等杂质等杂质加大酶的用量，加大酶的用量，1 1 mmg DNA g DNA 用用 10 10U U 酶酶加大反应总体积加大反应总体积延长反应时间延长反应时间限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第12页/共90页DNADNA样品的甲基化程度：样品的甲基化程度：大肠杆菌中的大肠杆菌中的damdam甲基化酶在甲基化酶在55GATC3GATC3
14、序列中的腺序列中的腺嘌呤嘌呤NN66位位 引入甲基，受其影响的酶有引入甲基，受其影响的酶有BclBcl I I、Mbo Mbo I I 等，但等，但BamBamH IH I、BglBgl II II、SauSau3A I 3A I 不受影响。不受影响。大肠杆菌中的大肠杆菌中的dcmdcm甲基化酶在甲基化酶在55CCAGG3CCAGG3或或55CCTGG3CCTGG3序列序列中的中的胞嘧啶胞嘧啶CC55位位上引入甲基，上引入甲基，受其影响的酶有受其影响的酶有EcoEcoR II R II 等。等。哺乳动物中的甲基化酶在哺乳动物中的甲基化酶在55CG3CG3序列中的序列中的CC55位位上引入甲基。
15、上引入甲基。影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第13页/共90页核酸内切酶的缓冲液性质：核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶高浓度的酶、高浓度的甘油高浓度的甘油、低离子强度低离子强度、极端极端pHpH值值等，等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的所谓的Star activityStar activity现象。现象。例如：例如：EcoEcoR IR I在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割55GAATTC3GAATTC3序列，序列，但在甘油浓度超过但在甘油浓度超过
16、5%5%（v/vv/v）时，也可切割时，也可切割55PuPuATPyPy3PuPuATPyPy3或者或者55AATT3AATT3序列。序列。影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第14页/共90页DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质修复双链修复双链DNADNA上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键DNADNA连接酶连接酶55 GG-CC-TT-CC-TT-GG-CC-AA GG-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-TT-CC-CC-TT-C 5C 5HOHOPPOHOHP
17、P55 GG-CC-TT-CC-TT-GG-CC-AA-GG-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-TT-CC-CC-TT-C 5C 5nicknicknicknick第15页/共90页修复与修复与RNARNA链结合的链结合的DNADNA链上缺口处的磷酸二酯键链上缺口处的磷酸二酯键T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶55 GG-CC-UU-CC-UU-GG-CC-CC-GG-GG-AA-GG 3 333 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-GG-CC-CC-TT-C 5C 5OHOHPPnicknick55 GG-CC-UU-CC-UU-GG-CC-CC
18、-GG-GG-AA-GG 3 333 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-GG-CC-CC-TT-C 5C 5DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质第16页/共90页连接多个平头双链连接多个平头双链DNADNA分子分子55 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG 3333 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC 5 555 GG-CC-TT-CC-AA-GG-OHOH PP-CC-TT-GG-GG-AA-GG 3333 CC-GG-AA-GG-TT-CC-PP OHOH-GG-AA-CC-CC-
19、TT-CC 5 5 T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质第17页/共90页DNADNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件Tris-HClTris-HCl50-100 mM pH 7.550-100 mM pH 7.5MgClMgCl2210 mM10 mMATPATP0.5-1 mM0.5-1 mMDTTDTT5 mM5 mMVolumeVolume10-20 10-20 mmllT TT T4-15 4-15 4-16 4-16 hrhr1 1 U DNAU DNA连接酶的酶活性连接酶的酶活性：在最佳反应条件下：在最佳反应条件
20、下15 15 反应反应 1 1 小时，完全小时，完全连接连接 1 1 mmg g ll-DNA-DNA（HinHind IIId III片段）所需的酶量。片段）所需的酶量。DNADNA连接酶连接酶第18页/共90页平头双链平头双链DNADNA片段的连接操作片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效
21、率的方法包括：加大连接酶用量（加大连接酶用量（1010倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入加入10%10%PEG8000PEG8000，促进大分子之间的有效作用促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（加入单价阳离子（NaClNaCl），），最终浓度最终浓度150-200 150-200 mMmMDNADNA连接酶连接酶第19页/共90页DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I（DNA pol I DNA pol I）5533的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性55
22、33的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性3355的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 的基本性质的基本性质33 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-A 5A 555 CC-GG-AA-GG-TT-OHOH55ppp dN Mgppp dN Mg2+2+33 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-A 5A 555 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-OHOHDNA pol IDNA pol I第20页/共90页缺口前移标记法缺口前移标记法大肠杆菌大肠杆菌DNADN
23、A聚合酶聚合酶 I I 的基本用途的基本用途55 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-T 3T 333 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 55MgMg2+2+55dNTP dNTP 55pppppp dA dA（aa-3232P-dATPP-dATP）55 GG-CC-TT-C AC A-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-T 3T 333 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 5555 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-T T
24、 3 333 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 55Nick translationNick translation制备制备3232PP标记的探针标记的探针DNase IDNase IDNA pol IDNA pol IDNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I（DNA pol I DNA pol I）第21页/共90页大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本性质酶的基本性质大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 经枯草杆菌
25、蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得CC端端三分之二的大肽段，即为三分之二的大肽段，即为KlenowKlenow酶。酶。KlenowKlenow酶仍拥有酶仍拥有5533的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性和和3355的核酸外的核酸外切酶活性切酶活性，但失去了，但失去了5533的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。DNADNA聚合酶聚合酶第22页/共90页KlenowKlenow酶的基本用途酶的基本用途补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的55 粘性末端粘性末端DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止
26、法测定DNADNA序列序列大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）DNADNA聚合酶聚合酶第23页/共90页KlenowKlenow酶的基本用途酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的55 粘性末端粘性末端55 GG-CC-TT-GG-OHOH PP-AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA-AA-PP OHOH-GG-CC-TT-C 5 C 5 KlenowKlenowdATP dTTPdATP dTTP55 GG-CC-TT-GG-AA-AA-TT-TT-OH
27、OH PP-AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA-AA-PP OHOH-TT-TT-AA-AA-GG-CC-TT-C 5 C 5 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）DNADNA聚合酶聚合酶第24页/共90页KlenowKlenow酶的基本用途酶的基本用途：DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记55 GG-CC-TT-GG-OHOH PP-AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA-AA-PP OHOH
28、-GG-CC-TT-C 5 C 5 KlenowKlenowaa-3232P-ppP-ppppdA dTTPdA dTTP55 GG-CC-TT-GG-AA-AA-TT-TT-OHOH PP-AA-AA-TT-TT-CC-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-CC-TT-TT-AA-AA-PP OHOH-TT-TT-AA-AA-GG-CC-TT-C 5 C 5 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（Klenow Klenow）DNADNA聚合酶聚合酶第25页/共90页T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA酶的基本特性酶的基本特性在无在
29、无dNTPdNTP时，可以从任何时，可以从任何33-OHOH端外切端外切在只有一种在只有一种dNTPdNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止时，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种在四种dNTPdNTP均存在时，聚合活性占主导地位均存在时，聚合活性占主导地位5533的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和3355的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性DNADNA聚合酶聚合酶第26页/共90页T4-DNAT4-DNA聚合酶的基本用途聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的切平由核酸内切酶产生的33 粘性末端粘性末端55 GG-CC-TT-CC-TT-GG-CC-AA-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3
30、G 333 CC-GG-AA-GG-PP HOHO-AA-CC-GG-TT-CC-CC-TT-C 5 C 5 T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶55 GG-CC-TT-CC-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 333 CC-GG-AA-GG-PP HOHO-CC-CC-TT-C 5C 5注意：该酶也能降解双链注意：该酶也能降解双链DNADNA，只是其活性比单链降解活性低很多。只是其活性比单链降解活性低很多。T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶第27页/共90页T4-DNAT4-DNA聚合酶的基本用途聚合酶的基本用途：DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素
31、末端标记55 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-T 3T 333 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 55MgMg2+2+55ppp dN ppp dN 55 pppppp dA dA（aa-3232P-dATPP-dATP）5 5 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-OHOH HO HO-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 55T4-DNA polT4-DNA polT4-DNA polT4-DNA pol55 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-A
32、A-GG-T T 3333 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 55T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶第28页/共90页依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性反转录酶的基本特性：以：以RNARNA为模板聚合为模板聚合cDNAcDNA链链33AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA反转录酶反转录酶MgMg2+2+dNTP dNTP55TTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT oligo(dT)oligo(dT)12-1812-
33、1833AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT33cDNAcDNADNADNA聚合酶聚合酶第29页/共90页反转录酶的基本特性反转录酶的基本特性：双向外切：双向外切DNA-RNADNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNARNA链链反转录酶反转录酶3 RNA3 RNA55 DNADNA33553 RNA3 RNA55 DNADNA3355反转录酶反转录酶55 DNADNA33依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）DNADNA聚合酶聚合酶第30页/共90页核酸酶核酸
34、酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本特性核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae）ZnZn2+2+必需必需最适最适pHpH范围为范围为4.0-4.34.0-4.3需要需要NaCl 10-300 mMNaCl 10-300 mM降解单链降解单链DNADNA的速度比降解双链的速度比降解双链DNADNA快快7500075000倍倍降解单链降解单链DNADNA的速度比降解单链的速度比降解单链RNARNA快快77倍倍第31页/共90页S1S1核酸酶的基本反应核酸酶的基本反应：内切单链
35、：内切单链DNADNA或或RNARNA55 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-CC-TT-TT-GG-AA-GG-GG-AA-GG-T 3T 3S1S1ZnZn2+2+55 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-C TC T-TT-GG-AA-GG-GG-AA-GG-T 3T 355 GG-CC-TT-C AC A-GG-CC-TT-C TC T-TT-GG-AA-G GG G-AA-GG-T 3T 355 dNMPs dNMPs 或或 5 5 NMPsNMPs核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶第32页/共90页S1S1核酸酶的基本反应核酸
36、酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链：内切带缺口或缺刻的双链DNADNA或或RNARNA55 GG-CC-TT-CC-AA-G CG C-TT-GG-GG-AA-GG-T 3T 333 CC-GG-AA-GG-TT-CC-GG-AA-CC-CC-TT-CC-A A 5555 GG-CC-TT-CC-AA-GG-CC-TT-GG-GG-AA-GG-T 3T 333 CC-GG-AA-GG-TT-CC AA-CC-CC-TT-CC-A A 55nicknickgapgapS1S1ZnZn2+2+55 GG-CC-TT-CC-AA-GG33 CC-GG-AA-GG-TT-CCTT-GG-GG-AA-
37、GG-T 3T 3AA-CC-CC-TT-CC-A A 55核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶第33页/共90页单链内切双链外切的核酸酶：单链内切双链外切的核酸酶：Bal31Bal31核酸酶核酸酶Bal31Bal31核酸酶的基本特性核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（：来自艾氏交替单胞菌（A.espejianaA.espejiana）CaCa2+2+55 dNMPs dNMPs 或或 5 5 NMPsNMPsssDNA or RNAssDNA or RNACaCa2+2+CaCa2+2+核酸酶核酸酶第34页/共90页单链内切双链外切的核酸酶：单链内切双链外切的核
38、酸酶：Bal31Bal31核酸酶核酸酶Bal31Bal31核酸酶的基本用途核酸酶的基本用途：诱发：诱发DNADNA突变突变EcoEcoR IR IAABBCCEcoEcoR IR IEcoEcoR IR IBBCCAABal31Bal31BBCCAA环化环化AACC核酸酶核酸酶第35页/共90页末端脱氧核苷酰转移酶（末端脱氧核苷酰转移酶（TdTTdT）TdTTdT的基本特性的基本特性：来自小牛胸腺：来自小牛胸腺核酸修饰酶核酸修饰酶不需要模板的不需要模板的DNADNA聚合酶，聚合酶，随机掺入随机掺入dNTPsdNTPs5 p3 HOOH 3p 5TdTTdTMgMg2+2+dATPdATP5 p
39、3 HOAAAAAAAAAAAA OH 3p 5第36页/共90页TdTTdT的基本特性：的基本特性：5 p3 HOOH 3p 5TdTTdTCoCo2+2+dATPdATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTCoCo2+2+dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 AAAAAAAAAAA第37页/共90页碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIPCIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAPB
40、AP）5 pOH 3 DNA or RNA5 ppp dN5 pppNBAP/CIPBAP/CIPOH 3 5 HO5 HO dN5 HO N核酸修饰酶核酸修饰酶第38页/共90页T4-T4-多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（T4-PNPT4-PNP）T4-PNPT4-PNP的基本特性的基本特性：在：在DNADNA、RNARNA、dNRdNR、NRNR的的55 -OHOH上加磷酸上加磷酸5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPT4-PNPMgMg2+2+ppppATPppATP（gg-3232P-ATPP-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5 用于探针的末端同位素标记：用于探针的末
41、端同位素标记：核酸修饰酶核酸修饰酶第39页/共90页B 用于基因克隆表达的载体2 2 重组重组DNADNA技术所需的基本条件技术所需的基本条件质粒（质粒（plasmidplasmid）噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）人造染色体载体人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征第40页/共90页载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第41页/共
42、90页载体的功能及特征载体的功能及特征载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较高的外源高的外源DNADNA的载装能力的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 第42页/共90页质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征 质 粒 是 生 物 细 胞 内 固 有 的、能 独 立 于 寄 主 染 色 体 而 自 主 复 制、并质 粒 是 生 物
43、细 胞 内 固 有 的、能 独 立 于 寄 主 染 色 体 而 自 主 复 制、并能被稳定遗传的一类核酸分子；能被稳定遗传的一类核酸分子；质粒常见于原核细菌和真菌中；质粒常见于原核细菌和真菌中；绝 大 多 数 的 质 粒 是绝 大 多 数 的 质 粒 是D N AD N A型 的，绝 大 多 数 的 天 然型 的，绝 大 多 数 的 天 然D N AD N A质 粒 具 有 共 价质 粒 具 有 共 价封闭、环状的分子结构，即封闭、环状的分子结构，即cccDNAcccDNA；质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：1-300 1-300 kbkb。第43页/共90页质粒的基本特征质粒的
44、基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制；复制系统进行自主复制；质粒质粒DNADNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：类型：严紧型复制严紧型复制控制的质粒控制的质粒 1-3 1-3 拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid松弛型复制松弛型复制控制的质粒控制的质粒 10-60 10-60 拷贝拷贝 stringen
45、t plasmidstringent plasmid质粒质粒第44页/共90页质粒的自主复制性质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制：拷贝数的控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控制复制启动控制控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合orioriE.coli E.coli ColE1ColE1 plasmidplasmid复制方向复制方向roprop（+）RopRopRNA IIRNA IIRNA IRNA I33555533质粒的基本特征质粒的基本特征质粒质粒第45页/共90页控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（oriori）的结合的结合PcopPcopco
46、pcopP/OrepP/OreprepreporioriCopCopRepRep质粒的自主复制性质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制：拷贝数的控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控制复制启动控制质粒的基本特征质粒的基本特征质粒质粒第46页/共90页质粒的不相容性：质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，一般不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，一般不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组ColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，
47、彼此不相容pSC101pSC101、FF、RP4 RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15Ap15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容成成不相容性群不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：。以大肠杆菌的质粒为例：质粒的基本特征质粒的基本特征质粒质粒第47页/共90页质粒的可转移性：质粒的可转移性：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如细胞（接合作用），如FF
48、、ColCol、RR质粒等；质粒等；非接合型质粒非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。：不能在天然条件下独立地发生接合作用。值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1ColE1）在接合型质粒的存在在接合型质粒的存在和协助下，也能发生和协助下，也能发生DNADNA转移，这个过程由转移，这个过程由bombom和和mobmob基因决定。基因决定。质粒的基本特征质粒的基本特征质粒质粒第48页/共90页携带特殊的遗传标记：携带特殊的遗传标记：野 生 型 的 质 粒野 生 型 的 质 粒D N AD N A上 往 往 携 带 一 个 或 多 个 遗 传 标 记
49、基 因，这 使上 往 往 携 带 一 个 或 多 个 遗 传 标 记 基 因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物 质 抗 性物 质 抗 性 抗 生 素、重 金 属 离 子、毒 性 阴 离 子、有 机 物抗 生 素、重 金 属 离 子、毒 性 阴 离 子、有 机 物物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对DNADNA重组分子的筛选具有重要意义。重组分子的筛选具有重要意义。质粒的基本特征质粒的基本特征质粒质粒第49页/共90页质粒的构建质粒的构建 天然存在的野生型质粒由于分子量大
50、、拷贝数低、单一酶切位点少遗传标记不理想等缺陷，天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建而成的：多是由少数几个野生型质粒构建而成的：pSC101pSC1018.8 kb8.8 kb，拷贝数，拷贝数 5 5，四环素抗性标记基因，四环素抗性标记基因 TcTcrrColE1ColE16.5 kb6.5 kb，拷贝数，拷贝数 20 2