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1、第第二二章章高效液相色谱法高效液相色谱法一、一、高效液相色谱法高效液相色谱法 的特点的特点二、流程及主要部件二、流程及主要部件三、三、影响分离的因素影响分离的因素四、四、高效液相色谱法高效液相色谱法 的主要分离类型的主要分离类型2023/4/252023/4/25液相色谱仪（液相色谱仪（1）2023/4/252023/4/25液相色谱仪（液相色谱仪（2）2023/4/252023/4/25液相色谱仪（液相色谱仪（3）2023/4/252023/4/25液相色谱仪（液相色谱仪（4）2023/4/252023/4/25液相色谱仪（液相色谱仪（5）2023/4/252023/4/25一、一、高效液相
2、色谱法的特点高效液相色谱法的特点 特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2023/4/252023/4/251 1高效液相色谱法与气相色谱法比较高效液相色谱法与气相色谱法比较（1 1）应用范围不同）应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。分解的物质。分解的物质。分解的物质。据统计只有大约据统计只有大约据统计只有大约据统计只有大约20%20%的有机物能的
3、有机物能的有机物能的有机物能用气相色谱分析用气相色谱分析用气相色谱分析用气相色谱分析；而液相色谱适合分子量较大、；而液相色谱适合分子量较大、；而液相色谱适合分子量较大、；而液相色谱适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约化合物及高聚物的分离分析，大约化合物及高聚物的分离分析，大约化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的占有机物的占有机物的占有机物的70 80%70 80%。（2）由于液体的扩散性比气体的小由于液体的扩散性比气体的小
4、由于液体的扩散性比气体的小由于液体的扩散性比气体的小10105 5倍，因此，倍，因此，倍，因此，倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，而在气相色谱中溶质在液相中的传质速率慢，而在气相色谱中溶质在液相中的传质速率慢，而在气相色谱中溶质在液相中的传质速率慢，而在气相色谱中气体的传质速率要快得多气体的传质速率要快得多气体的传质速率要快得多气体的传质速率要快得多。2023/4/252023/4/25（3 3）液相色谱能完成难度较高的分离工作）液相色谱能完成难度较高的分离工作 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，气相色谱的流动相载气是色谱惰
5、性的，而在而在而在而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素为提高选择性增加了一个因素为提高选择性增加了一个因素为提高选择性增加了一个因素。液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。地大；而气相色谱并不可能的。地大；而气相色谱并不可能的。地大；而气相色谱并不可能的。液相色谱通常在室温下操作，较低的
6、温度，液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择，而一般有利于色谱分离条件的选择，而一般有利于色谱分离条件的选择，而一般有利于色谱分离条件的选择，而气相色谱一气相色谱一气相色谱一气相色谱一般都在般都在般都在般都在较高温度较高温度较高温度较高温度下进行的。下进行的。下进行的。下进行的。（4 4）液相色谱中）液相色谱中）液相色谱中）液相色谱中制备样品简单制备样品简单制备样品简单制备样品简单，回收样品也比较容，回收样品也比较容，回收样品也比较容，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但
7、液相色易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵价格昂贵价格昂贵价格昂贵。2023/4/252023/4/25 2 2高效液相色谱法与经典液相色谱法比较高效液相色谱法与经典液相色谱法比较 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于在于高速、高效、高灵敏度、高自动化高速、高效、高灵敏度、高自动化高速、高效、
8、高灵敏度、高自动化高速、高效、高灵敏度、高自动化。例如对氨基酸分离，用经典色谱法需用例如对氨基酸分离，用经典色谱法需用2020多小时多小时才能分离出才能分离出2020种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lhlh之内即可完成。之内即可完成。又如用又如用25cm0.46cm25cm0.46cm的的LichrosorbLichrosorbODS(5)ODS(5)的的柱，采用梯度洗脱，可在不到柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h0.5h内分离出尿中内分离出尿中104104个组分个组分.2023/4/252023/4/25小结 综综上上所所述述，高高效效液液相相色色谱谱法法
9、是是吸吸取取了了气气相相色色谱谱与与经经典典液液相相色色谱谱的的优优点点，具具有有高高柱柱效效、高高选选择择性性、分分析析速速度度快快、灵灵敏敏度度高高、重重复复性性好、应用范围广好、应用范围广等优点。等优点。目目前前高高效效液液相相色色谱谱法法已已被被广广泛泛应应用用于于分分析析对对生生物物学学和和医医药药上上有有重重大大意意义义的的大大分分子子物物质质，例例如如蛋蛋白白质质、核核酸酸、氨氨基基酸酸、多多糖糖类类、植植物物色色素素、高高聚聚物物、染染料料及及药药物物等等物物质质的的分分离和分析。离和分析。高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主
10、要操作严格，这是它的主要缺点缺点。2023/4/252023/4/25二、流程及主要部件二、流程及主要部件1.1.流程流程高压输液系统高压输液系统高压输液系统高压输液系统 进样系统进样系统进样系统进样系统 分离系统分离系统分离系统分离系统 检测系统检测系统检测系统检测系统 数据处理系统数据处理系统数据处理系统数据处理系统2023/4/252023/4/25Agilent 1100 LC的主要部件的主要部件2023/4/252023/4/252.主要部件主要部件(1)(1)高压输液系高压输液系高压输液系高压输液系统统统统主主要要部部件件之之一一，包包括括贮贮液液装装置置、高高压压输输液液泵泵、过
11、过滤滤器器、脱脱气装置气装置等等 高压输液泵压力：高压输液泵压力：150350105 Pa。为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（10m），液液体体的的流流动动相相高高速速通通过过时时，将将产产生生很很高高的的压压力力，因因此此高高压压、高高速是高效液相色谱的特点之一。速是高效液相色谱的特点之一。基本要求：基本要求：应具有压力平稳、脉冲小、流量稳应具有压力平稳、脉冲小、流量稳 定可调、耐腐蚀等特性定可调、耐腐蚀等特性2023/4/252023/4/25(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度:利用两台高压输液泵，利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一
12、将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。混合后进入色谱柱。内梯度内梯度:一台高压泵一台高压泵,通过比例通过比例调节阀调节阀,将两种或多种不同将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。入高压泵中混合。2023/4/252023/4/25(3)进样装置进样装置 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，也可配备自动进样装置。通阀进样装置，也可配备自动进样装置。其结构如图所示：其结构如图所示：2023/4/252023/4/25(4)高效分离系统高效分离系统
13、色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。2023/4/252023/4/25(5)高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器 紫外光度检测器（紫外光度检测器（UVD）：）：最小检测量最小检测量10-9gmL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。最常用的检测器。最常用的检测器。2023/4/252023/4/25
14、光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个个二二极极管管阵阵列列，各各检检测测特特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2023/4/252023/4/25（6）数据处理系统数据处理系统 色谱工作站的功能：色谱工作站的功能：色谱参数的选择和设定；色谱参数的选择和设定；自动化操作仪器；自动化操作仪器；色谱数据的采集和存储，并作色谱数据的采集和存储，并作“实时实时”处理；处理；对采集和存储的数据进行后处理；对采集和存储的数据进行后处理；自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。自动打印，
15、给出一套完整的色谱分析数据和图谱。同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。2023/4/252023/4/252023/4/252023/4/251.固定相及分离柱固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。谱，其选用原则与气相色谱一样。选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项柱效，但在高效液
16、相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度；选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。研制高效柱填料是一活跃领域。三、三、影响分离的因素影响分离的因素2023/4/252023/4/252.流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性 （1）可可显显著著改改变变组组分分分分离离状状况况的的流流动动相相选选择择在在液液相相色色谱谱中中显显得得特特别别重重要要。液液相相色色谱谱的的流流动动相相又又称称为为：淋淋洗洗液液，洗洗脱脱剂。剂。（2）亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性淋淋
17、洗洗液液，即即淋淋洗洗液液的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，称称为为正正相相液液液液色色谱谱法法，极极性性柱柱也也称称正正相柱。相柱。（3）若若淋淋洗洗液液的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱。组组分分在在两两种种类类型型分分离离柱柱上上的出峰顺序相反。的出峰顺序相反。2023/4/252023/4/25流动相组成流动相组成 流动相按组成不同可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯
18、度淋洗。按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采采用用二二元元或或多多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动动相相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2023/4/252023/4/25选择流动相时应注意的几个问题：选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器
19、噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。2023/4/252023/4/25四、四、高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型1.1
20、.吸附色谱（液吸附色谱（液-固吸附色谱）固吸附色谱）“液液-固固色色谱谱法法”是是利利用用各各组组分分在在固固定定相相上上吸吸附附能能力力的的不不同同而而将将它它们们分分离离的的方方法法。以以固固体体吸吸附附剂剂为为固固定定相相，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等，较较常常使使用用的的是是510m的的硅硅胶胶吸吸附附剂剂。流流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2.2.分配色谱（液分配色谱（液-液分配色谱）液分配色谱）早早期期通通过过在在担担体体上上涂涂渍渍一一薄薄层层固固定定液液制制备备固固定定相相,现现多多为为化化学学键键合合固固定定相相，即即用用化
21、化学学反反应应的的方方法法通通过过化化学学键键将固定液结合在担体表面。将固定液结合在担体表面。2023/4/252023/4/253.3.离子交换色谱离子交换色谱 固固定定相相为为离离子子交交换换树树脂脂，流流动动相相为为无无机机酸酸或或无无机机碱碱的的水水溶溶液液。各各种种离离子子根根据据它它们们与与树树脂脂上上的的交交换换基基团团的的交交换能力的不同而得到分离。换能力的不同而得到分离。可可分分离离分分析析：核核苷苷酸酸、碳碳水水化化合合物物、有有机机酸酸、蛋蛋白白质、酶等质、酶等 4.4.凝胶色谱（空间排阻色谱）凝胶色谱（空间排阻色谱）按按分分子子尺尺寸寸的的差差异异进进行行分分离离的的一
22、一种种液液相相色色谱谱方方法法。以以凝凝胶胶为为固固定定相相。凝凝胶胶是是一一种种经经过过交交联联的的、具具有有立立体体网网状状结结构构和和不不同同孔孔径径的的多多聚聚体体的的通通称称。如如葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、琼琼脂脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。2023/4/252023/4/25五、高效液相色谱法的应用五、高效液相色谱法的应用1.在食品分析中的应用在食品分析中的应用1)食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类等；等；2)食品添加剂分析：防腐剂、着色剂等；食品添加剂分析：防腐剂、着色剂等；
23、3)食品污染物分析：霉菌毒素等。食品污染物分析：霉菌毒素等。2.在环境分析中的应用在环境分析中的应用 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药残留等。多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药残留等。2023/4/252023/4/25五、高效液相色谱法的应用五、高效液相色谱法的应用 3.在生命科学中的应用在生命科学中的应用 1)低分子量物质，如氨基酸、糖类、维生素等低分子量物质，如氨基酸、糖类、维生素等的分离和测定。的分离和测定。2)高分子量物质，如蛋白质和酶的纯化、分离高分子量物质，如蛋白质和酶的纯化、分离和测定。和测定。4.在医学检验中的应用在医学检验中的应用1）合成药物：抗生素、抗忧郁药物等。）合成药物
24、：抗生素、抗忧郁药物等。2）天然药物生物碱（鸦片碱）等）天然药物生物碱（鸦片碱）等5在无机分析中的应用在无机分析中的应用阳、阴离子的分析等。阳、阴离子的分析等。2023/4/252023/4/25请选择内容：请选择内容：第一节第一节 色谱法概述色谱法概述第二节第二节 气相色谱仪气相色谱仪第三节第三节 色谱理论基础色谱理论基础第四节第四节 气相色谱操作条件选择气相色谱操作条件选择第五节第五节 色谱定性、定量方法色谱定性、定量方法第六节第六节 毛细管色谱毛细管色谱第七节第七节 液相色谱法液相色谱法第八节第八节 离子色谱法离子色谱法第九节第九节 高效毛细管电泳高效毛细管电泳第十节第十节 薄层色谱与纸色谱法薄层色谱与纸色谱法结束结束2023/4/252023/4/25