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1、液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法v适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析v流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法v适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析v流动相只起运载样品分子的能力 液相色谱基础知识第1页/共40页一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱液相色谱基础知识俄国植物学家茨维特在1906年分离叶绿素.第2页/共40页色谱法的分离原理是：色谱法的分离原理是：溶于流动相溶于流动相(mobile phase)(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相中的各组分经过固定相时，由于与固定相(
2、stationary phase)(stationary phase)发生作用（吸发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。流出。第3页/共40页慢慢中等中等快快色谱分离色谱分离色谱分离色谱分离Temporal course淋洗液淋洗液第4页/共40页高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点一 、高压 液相色谱以液体作为流动相（称为载液），液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。在现代液体色谱中供液
3、压力和进样压力都很高，一般可达到150150300kg300kgcm2cm2，甚至可达700k700kcm2cm2以上。第6页/共40页二二 高速高速 高效液相色谱所需的分析时间较之经典液体色谱快得多，一般可达l10mLmin，个别可高达100mLmin以上，这已近似于气相色谱的流速。三三 高效高效 气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高，一般约可达 60000理论塔板米；第7页/共40页四四 高灵敏度高灵敏度 紫外检测器的最小检测量可达毫微克数量级(10-9 g)；荧光检测器的灵敏度可达10-11g。高效液相色谱的高灵敏度还表现在所需试样很少；微升数量级的样品就足以进行全分析。第8
4、页/共40页一、固定相和流动相一、固定相和流动相 常用的流动相：水、甲醇、乙腈等。常用的流动相：水、甲醇、乙腈等。流动相的选择：样品和流动相应具有化学上的相似性。流动相的选择：样品和流动相应具有化学上的相似性。流动相的过滤：流动相的过滤：用孔径为用孔径为0.450.45m m滤膜过滤除去固体颗粒杂质。滤膜过滤除去固体颗粒杂质。流动相过滤器流动相过滤器样品过滤器样品过滤器第9页/共40页液相色谱基础知识采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相的选择第10页/共40页溶 剂 等 级水的等级水的等级纯化水纯化水蒸馏水蒸馏水去
5、离子水去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸吸光光率率第11页/共40页溶 剂 等 级溶剂的等级溶剂的等级HPLCHPLCHPLCHPLC级级优级纯优级纯分析纯分析纯都经过蒸馏和0.45um的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2um的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱第12页/共40页第13页/共40页液相色谱基础知识液相色谱流程图液相色谱流程图溶剂输液泵进样器柱温箱检测器数据处理第14页/共40页 3-3 高效液相色谱仪基本结构一、
6、高效液相色谱仪基本组成一、高效液相色谱仪基本组成n输液系统输液系统n进样系统进样系统n分离系统分离系统n检测系统检测系统n色谱数据处理系统；色谱数据处理系统；第15页/共40页 3-3 高效液相色谱仪基本结构一、输液系统n滤头n贮液瓶第16页/共40页 3-3 高效液相色谱仪基本结构二、进样系统n手动进样器n自动进样器第17页/共40页 3-3 高效液相色谱仪基本结构三、分离系统n色谱柱第18页/共40页柱温箱柱温箱分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性 液相色谱基础知识第19页/共40页v柱压低于150kgf/cm2v柱温在40左右，最高使用温度为50v缓冲液PH使用范围为27ODS
7、ODS柱的使用注意点：柱的使用注意点：柱的使用注意点：柱的使用注意点：硅胶在硅胶在硅胶在硅胶在PHPHPHPH为为为为3 3 3 34 4 4 4时稳定性最好时稳定性最好时稳定性最好时稳定性最好碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。液相色谱基础知识第20页/共40页硅胶基底聚合物基底pH 范围2-7.5宽范围有机溶剂所有有限制压力 250 kgf/cm2低压温度宽范围60C液相色谱基础知识色谱柱的类型及适用范围第21页/共40页 3-3 高效液相色谱仪基本结构四、检
8、测系统n紫外检测器n蒸发光散射检测器n 二极管阵列检测器n 荧光检测器第22页/共40页v原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收v定量基础：比尔定律，AECLv优点：1）灵敏度高 2）对温度和流速不敏感 3）可用于梯度洗提v缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外检测器第23页/共40页过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 无在线脱气应注意：1）
9、每天脱气 2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长溶 剂 前 处 理第24页/共40页1.使用流动相溶解样品 -减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要 -保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀 2.进样前最好使用0.45um 的膜进行过滤 如果样品很脏，要使用0.2um的膜进行过滤样 品 处 理第26页/共40页General Maintenance and Troubleshooting缓冲液的使用 使用前必须过滤 使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:用纯水冲洗30-60min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min易受到细菌和霉菌的影响 不能
10、直接用有机溶剂冲洗第27页/共40页进样器进样器自动进样器手动进样器 原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入 2）部分注入液相色谱基础知识第28页/共40页手动进样器的原理图手动进样器的原理图 装填状态液相色谱基础知识进样状态第29页/共40页2、进样系统通常采用六通伐进样：色谱柱色谱柱泵泵12进样第30页/共40页手动进样法 1.进样状态下插入微量注射器 2.切到装填状态 3.注入样品 4.切回到进样状态第31页/共40页常用检测器常用检测器常用检测器常用检测器v紫外检测器（包括二极管阵列检测器）v荧光检测器v示差折光检测器v电导检测器液相色谱基础知识第32页/共40页 3-4 定性定量分析
11、一、定性分析一、定性分析uu 定性依据：保留时间（定性依据：保留时间（t t t tR R R R），即在相同条件下，），即在相同条件下，供试品溶液（样品溶液）所显示的主峰保留时间供试品溶液（样品溶液）所显示的主峰保留时间与对照品一致；与对照品一致；第34页/共40页色谱基本参数与流出曲线的表征1.1.基线基线 无无试试样样通通过过检检测测器器时时，检检测测到到的的信信号号即即为为基线。基线。2.2.保留值保留值 （1 1）时间表示的保留值）时间表示的保留值 保留时间保留时间(t tR R)：组分从进样到柱后出：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；现浓度极大值时所需的时间；第35页/共
12、40页3、分离度第36页/共40页定性定量分析混合标品溶液样品溶液第37页/共40页 3-4 定性定量分析二、定量分析二、定量分析二、定量分析二、定量分析uu 定量依据：朗伯定量依据：朗伯定量依据：朗伯定量依据：朗伯-比尔定律（比尔定律（比尔定律（比尔定律（A=kcA=kcA=kcA=kc）由由由由A=kc AA=kc AA=kc AA=kc A标标标标/A/A/A/A样样样样=c=c=c=c标标标标/c/c/c/c样样样样uu 方法：外标法、标准曲线法方法：外标法、标准曲线法方法：外标法、标准曲线法方法：外标法、标准曲线法 外标法：外标法：外标法：外标法：A A A A标标标标/A/A/A/A样样样样=c=c=c=c标标标标/c/c/c/c样样样样第38页/共40页 3-4 定性定量分析二、定量分析二、定量分析 标准曲线法（标准曲线法（P P9191）1 2 3 4 5 样品 C标 C1 C2 C3 C4 C5 CX A标 A1 A2 A3 A4 A5 AXACXAXCA1A2A3A5A4C2C1C3C5C4第39页/共40页感谢您的观看！第40页/共40页