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1、会计学1高效液相色谱高效液相色谱 什么是色谱什么是色谱?色谱法的简称色谱法的简称色谱法的简称色谱法的简称(又叫色层法又叫色层法又叫色层法又叫色层法,层析法层析法层析法层析法),),),),其本质是一种分离分析方法其本质是一种分离分析方法其本质是一种分离分析方法其本质是一种分离分析方法 常见的分离方法常见的分离方法常见的分离方法常见的分离方法n n蒸馏蒸馏蒸馏蒸馏n n离心离心离心离心n n电泳电泳电泳电泳n n过滤过滤过滤过滤n n色谱色谱色谱色谱(目前最有效的分离方法目前最有效的分离方法目前最有效的分离方法目前最有效的分离方法)第2页/共86页色谱法简介色谱法简介色谱法色谱法(Chromat
2、ography)溯源溯源 100多年前俄国植物学家多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时采分离植物色素时采用用 的实验方法的实验方法 他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下再加入石油醚使其自由流下,结果色素结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带 Tswett用希腊语用希腊语chroma(色色)和和graphos(谱谱)描述他描述他的实验方法，即现在的的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法色谱法)第3页/共86页色谱法的发展色谱法的发展
3、色谱法是一种现代的分离方法色谱法是一种现代的分离方法 1906年正式命名年正式命名20世纪世纪30年代开始广泛研究和应用年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪世纪70年代年代第4页/共86页色谱法原理色谱法原理 色谱法的原理色谱法的原理色谱法的原理色谱法的原理 是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配分配分配分配,吸附等化学作用性能的差异吸附等化学作用性能的差异吸附等化学作用性能的差异吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时当
4、两相作相对运动时当两相作相对运动时当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离到相互分离到相互分离到相互分离 两相中有一相是固定的两相中有一相是固定的两相中有一相是固定的两相中有一相是固定的,叫作固定相叫作固定相叫作固定相叫作固定相(Stationary(Stationary Phase),Phase),有一相是流动的有一相是流动的有一相是流动的有一相是流动的,称为流动相称为流动相称为流动相称为流动相(Mobile Phase),(M
5、obile Phase),流动相又叫洗脱剂流动相又叫洗脱剂流动相又叫洗脱剂流动相又叫洗脱剂,溶剂溶剂溶剂溶剂 相相相相(Phase):(Phase):物理化学术语物理化学术语物理化学术语物理化学术语,特指在某一系统中特指在某一系统中特指在某一系统中特指在某一系统中,具有相同成分及具有相同成分及具有相同成分及具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面明显可分的界面明显可分的界面明显可分的界面第5页/共86页色谱法原理色谱法原理分离是一个
6、分离是一个物理过程。物理过程。固定相固定相(Stationary Phase)流动相流动相(Mobile Phase)进样进样(Injection)洗脱洗脱(Elution)相互作用相互作用(Interaction)第6页/共86页色谱法的分类色谱法的分类 按分离过程的机理分按分离过程的机理分按分离过程的机理分按分离过程的机理分:n n吸附色谱吸附色谱吸附色谱吸附色谱(Absorption Chromatography)(Absorption Chromatography)(Absorption Chromatography)(Absorption Chromatography)n n根据样品
7、组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离现分离现分离现分离n n分配色谱分配色谱分配色谱分配色谱(Partition Chromatography)(Partition Chromatography)(Partition Chromatography)(Partition Chromatography)n n分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度分离基于样品组分在固定
8、相和流动相中的溶解度(分分分分配系数配系数配系数配系数)不同不同不同不同n n离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)(Ion Exchange Chromatography)(Ion Exchange Chromatography)(Ion Exchange Chromatography)n n根据样品组份离子交换亲和力的差异分离根据样品组份离子交换亲和力的差异分离根据样品组份离子交换亲和力的差异分离根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子简称离子简称离子简称离子色谱色谱色谱色谱(IC)(IC)(IC)(IC)n n体积
9、排除色谱体积排除色谱体积排除色谱体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)(Size Exclusion Chromatography)(Size Exclusion Chromatography)(Size Exclusion Chromatography)n nGPC(Gel Permeation Chromatography)GPC(Gel Permeation Chromatography)GPC(Gel Permeation Chromatography)GPC(Gel Permeation Chromatography)n n固定相是疏水性凝胶固定相
10、是疏水性凝胶固定相是疏水性凝胶固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶流动相是有机溶流动相是有机溶流动相是有机溶剂剂剂剂n nGFC(Gel Filtration Chromatography)GFC(Gel Filtration Chromatography)GFC(Gel Filtration Chromatography)GFC(Gel Filtration Chromatography)n n固定相是亲水性凝胶固定相是亲水性凝胶固定相是亲水性凝胶固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液流动相是水溶液流动相是水溶液流动相是水溶液第7页/共86页色谱法的分类色谱法的分类 按流动相的物态分按流动相的物态
11、分按流动相的物态分按流动相的物态分:n n气相色谱气相色谱气相色谱气相色谱 (Gas Chromatography,GC)(Gas Chromatography,GC)用气体作为流动相用气体作为流动相用气体作为流动相用气体作为流动相(又叫载气又叫载气又叫载气又叫载气)n n液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱 (Liquid Chromatography,LC)(Liquid Chromatography,LC)用液体作为流动相用液体作为流动相用液体作为流动相用液体作为流动相(又叫洗脱剂又叫洗脱剂又叫洗脱剂又叫洗脱剂)按固定相的形态分按固定相的形态分按固定相的形态分按固定相的形态分:n n平面色谱
12、平面色谱平面色谱平面色谱n n纸色谱纸色谱纸色谱纸色谱n n薄层色谱薄层色谱薄层色谱薄层色谱n n柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱第8页/共86页色谱法分类示意图色谱法分类示意图第9页/共86页n nHPLC的产生n nHPLC的固定相n nHPLC的流动相第10页/共86页HPLC的产生的产生n n液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长(常有几个小时常有几个小时)。第11页/共86页n n高效液相色谱法高效液相色谱法
13、高效液相色谱法高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography(High performance Liquid Chromatography，HPLC)HPLC)是在经典液相色谱法的基础上是在经典液相色谱法的基础上是在经典液相色谱法的基础上是在经典液相色谱法的基础上,于于于于6060年代后期引入了气相色年代后期引入了气相色年代后期引入了气相色年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗谱理论而迅速发展起来的。
14、它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀粒小而均匀粒小而均匀粒小而均匀,小颗粒具有高柱效小颗粒具有高柱效小颗粒具有高柱效小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力但会引起高阻力但会引起高阻力但会引起高阻力,需用高压输送流动需用高压输送流动需用高压输送流动需用高压输送流动相相相相,故又称高压液相色谱法故又称高压液相色谱法故又称高压液相色谱法故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC).HPLC).又因分析速度快而称为高速液相色谱法又因分析速度快而称为高速液相色谱法又因分析速
15、度快而称为高速液相色谱法又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed(High Speed Liquid ChromatographyLiquid Chromatography，HSLP)HSLP)。也称现代液相色谱。也称现代液相色谱。也称现代液相色谱。也称现代液相色谱。第12页/共86页n n高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法 n nHPLC(High Performance Liquid HPLC(High Performance Liquid Chromatography)Chromatography)是一种区别于经典液相色谱是一种区别于经典液相色谱是一
16、种区别于经典液相色谱是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的基于仪器方法的基于仪器方法的基于仪器方法的高效能分离手段高效能分离手段高效能分离手段高效能分离手段:n n高性能色谱柱高性能色谱柱高性能色谱柱高性能色谱柱,高精度输液泵高精度输液泵高精度输液泵高精度输液泵,高灵敏度检测高灵敏度检测高灵敏度检测高灵敏度检测器器器器n n广泛应用于各个领域广泛应用于各个领域广泛应用于各个领域广泛应用于各个领域:医药医药医药医药,环保环保环保环保,石化石化石化石化,生命科生命科生命科生命科学学学学,食品工业食品工业食品工业食品工业,农业农业农业农业n n无论在技术上无论在技术上无论在技术上无论在技术上,理论
17、上理论上理论上理论上,还是在应用上仍有较还是在应用上仍有较还是在应用上仍有较还是在应用上仍有较大的发展空间。大的发展空间。大的发展空间。大的发展空间。第13页/共86页高效液相色谱的高效液相色谱的固定相固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。可分为刚性固体和硬胶两大类。可分为刚性固体和硬胶两大类。可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体刚性固体刚性固体刚性固体以二氧化硅为基质，可承受以二氧化硅为基质，可承受以二氧化硅为基质，可承受以二氧化硅为基
18、质，可承受7.07.0 10108 8 1.01.0 10109 9PaPa的高压，可制成直径、形状、孔隙度的高压，可制成直径、形状、孔隙度的高压，可制成直径、形状、孔隙度的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。相。相。相。硬胶硬胶硬胶硬胶主要
19、用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为限为限为限为3.53.5 10108 8PaPa。第14页/共86页 固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。全多孔型固定相两类。全多孔型固
20、定相两类。全多孔型固定相两类。1.1.1.1.表面多孔型固定相表面多孔型固定相表面多孔型固定相表面多孔型固定相 它它它它的的的的基基基基体体体体是是是是实实实实心心心心玻玻玻玻璃璃璃璃球球球球，在在在在玻玻玻玻璃璃璃璃球球球球外外外外面面面面覆覆覆覆盖盖盖盖一一一一层层层层多多多多孔孔孔孔活活活活性性性性材材材材料料料料，如如如如硅硅硅硅胶胶胶胶、氧氧氧氧化化化化硅硅硅硅、离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂、分分分分子子子子筛筛筛筛、聚聚聚聚酰酰酰酰胺胺胺胺等等等等。这这这这类类类类固固固固定定定定相相相相的的的的多多多多孔孔孔孔层层层层厚厚厚厚度度度度小小小小、孔孔孔孔浅浅浅浅，相相相
21、相对对对对死死死死体体体体积积积积小小小小，出出出出峰峰峰峰迅迅迅迅速速速速、柱柱柱柱效效效效亦亦亦亦高高高高；颗颗颗颗粒粒粒粒较较较较大大大大，渗渗渗渗透透透透性性性性好好好好，装装装装柱柱柱柱容容容容易易易易，梯梯梯梯度度度度淋淋淋淋洗洗洗洗时时时时能能能能迅迅迅迅速速速速达达达达到到到到平平平平衡衡衡衡，较较较较适适适适合合合合做做做做常常常常规规规规分分分分析析析析。由由由由于于于于多多多多孔孔孔孔层层层层厚厚厚厚度度度度薄薄薄薄，最大允许量受到限制。最大允许量受到限制。最大允许量受到限制。最大允许量受到限制。第15页/共86页2.全多孔型固定相全多孔型固定相 由由由由直直直直径径径径
22、为为为为10nm10nm的的的的硅硅硅硅胶胶胶胶微微微微粒粒粒粒凝凝凝凝聚聚聚聚而而而而成成成成。这这这这类类类类固固固固定定定定相相相相由由由由于于于于颗颗颗颗粒粒粒粒很很很很细细细细（5 51010 mm），孔孔孔孔仍仍仍仍然然然然较较较较浅浅浅浅，传传传传质质质质速速速速率率率率快快快快，易易易易实实实实现现现现高高高高效效效效、高高高高速速速速。特特特特别别别别适适适适合合合合复复复复杂杂杂杂混混混混合合合合物物物物分分分分离离离离及及及及衡衡衡衡量量量量分分分分析。析。析。析。第16页/共86页液相色谱的流动相液相色谱的流动相 mobile phases of LC 1.1.流动相特
23、性流动相特性 （1）液液相相色色谱谱的的流流动动相相又又称称为为：淋淋洗洗液液，洗洗脱脱剂剂。流流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，称称为为正正相相液液液液色色谱谱法法，极极性性柱柱也也称称正正相柱。相柱。（3）若若流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱。组组分分在在两两种种类类型型分分离离柱柱上上的出峰顺序
24、相反。的出峰顺序相反。第17页/共86页2.流动相类别流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分；按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇 乙腈、水。乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第18页/共86页3.流
25、动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙
26、酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环环己烷己烷 己烷己烷 煤油煤油(最小最小)。第19页/共86页4.流动相的要求流动相的要求 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响并参与固定相对组分的竞争
27、，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1 1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2 2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器
28、，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干
29、扰组分的烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。吸收测量。吸收测量。吸收测量。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。第20页/共86页（3 3）高纯度）高纯度）高纯度）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要由于高效液相色
30、谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰伪峰伪峰伪峰”。（4 4）化学稳定性好）化学稳定性好）化学稳定性好）化学稳定性好（5 5）低粘度（粘度适中）低粘度（粘度适中）低粘度（粘度适中）低粘度（粘度适中）若使用高粘度溶剂，势必增高压若使用高粘度溶剂，势必增高压若使用高粘度溶剂，势必增高压若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、
31、甲醇和力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。响分离。响分离。响分离。第21页/共86页色谱法按分离机制的不同分为：色谱法按分离机制的不同分为：液固吸附色谱法液固吸附色谱法
32、液液分配色谱法液液分配色谱法离子交换色谱法离子交换色谱法分子排阻色谱法分子排阻色谱法 亲和色谱法亲和色谱法第22页/共86页液液-固色谱法固色谱法(吸附色吸附色谱谱)液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或或分子的性
33、质是多少不同于在内部的原子、离子或或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心。因此，液固色谱分散的具有表面活性的吸附中心。因此，液固色谱分散的具有表面活性的吸附中心。因此，液固色谱分散的具有表面活性的吸附中心。因此，液
34、固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离，故也称为液固吸附色谱。分离，故也称为液固吸附色谱。分离，故也称为液固吸附色谱。分离，故也称为液固吸附色谱。第23页/共86页 吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及的比表面
35、积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体易于吸附。从而使吸附
36、色谱成为分离几何异构体易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），同系物没有选择性（即对分子量的选
37、择性小），不能用该法分离分子量不同的化合物。不能用该法分离分子量不同的化合物。不能用该法分离分子量不同的化合物。不能用该法分离分子量不同的化合物。液固色谱法的固定相液固色谱法的固定相第24页/共86页 液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。可分为极性和非极性两种类型。可分为极性和非极性两种类型。可分为极性和非极性两种类型。非极性吸附剂最常见的是活性炭。非极性吸附剂最常见的是活性炭。非极性吸附剂最常见的是活性炭。非极性吸附剂最常见的是活性炭。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧
38、化镁、极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。碱
39、性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。和吡咯衍生物等。和吡咯衍生物等。和吡咯衍生物等。第25页/共86页 在液在液在液在液-固色谱中，选择流动相的基本原则固色谱中，选择流动相的基本原则固色谱中，选择流动相的基本原则固色谱中，选择流动相的
40、基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性是极性大的试样用极性较强的流动相，极性是极性大的试样用极性较强的流动相，极性是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。小的则用低极性流动相。小的则用低极性流动相。小的则用低极性流动相。为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比如果样品组分的分配比如果样品
41、组分的分配比如果样品组分的分配比k k k k值范围很广则使用梯值范围很广则使用梯值范围很广则使用梯值范围很广则使用梯度洗脱。度洗脱。度洗脱。度洗脱。液固色谱法的流动相液固色谱法的流动相第26页/共86页 在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不
42、相溶，两者细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。以气液分配色谱法一样，这种分配平衡的总结果导致各组分的以气液分配色谱法一样，这种分配平衡的总结果导致各组分的以气液分配色谱法一样，这种分配平衡的总结果导致
43、各组分的以气液分配色谱法一样，这种分配平衡的总结果导致各组分的差速迁移，从而实现分离。分配系数差速迁移，从而实现分离。分配系数差速迁移，从而实现分离。分配系数差速迁移，从而实现分离。分配系数（KK）或分配比（）或分配比（）或分配比（）或分配比（k k）小的组分，小的组分，小的组分，小的组分，保留值小，先流出柱。然而与气相色谱法不同的是，流动相的种类对保留值小，先流出柱。然而与气相色谱法不同的是，流动相的种类对保留值小，先流出柱。然而与气相色谱法不同的是，流动相的种类对保留值小，先流出柱。然而与气相色谱法不同的是，流动相的种类对分配系数有较大的影响。分配系数有较大的影响。分配系数有较大的影响。分
44、配系数有较大的影响。液液色谱液液色谱第27页/共86页液液色谱法的固定相液液色谱法的固定相 液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：（1 1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为30 30 4040 mm的实心玻璃球的实心玻璃球的实心玻璃球的实心玻璃球和厚度约为和厚度约
45、为和厚度约为和厚度约为1 1 2 2 mm的多孔性外层所组成。的多孔性外层所组成。的多孔性外层所组成。的多孔性外层所组成。（2 2）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径30-50 30-50 mm的多孔型颗粒。的多孔型颗粒。的多孔型颗粒。的多孔型颗粒。（3 3）全多孔型微粒载体，由）全多孔型微粒载体，由）全多孔型微粒载体，由）全多孔型微粒载体，由nmnm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载级的硅胶微粒堆
46、积而成，又称堆积硅珠。这种载级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为体粒度为体粒度为体粒度为5 5 10 10 mm。由于颗粒小，。由于颗粒小，。由于颗粒小，。由于颗粒小，所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。第28页/共86页 由于液相色谱中，流动相参与选择作用，由于液相色谱中，流动相参与选择作用，由于液相色谱中，流动相参与选择作用，由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值流动相极性的微
47、小变化，都会使组分的保留值流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可。如种不同极性的固定液即可。如种不同极性的固定液即可。如种不同极性的固定液即可。如 ，氧二丙氧二丙氧二丙氧二丙腈（腈（腈（腈（ODPNODPN），聚乙二醇（），聚乙二醇（），聚乙二醇（），聚乙二醇（PEGPEG），十八烷），十八烷），十八烷），十八烷（ODSODS）和角鲨烷固定液等。）和角鲨烷固定液等。）和角鲨烷固定液等。）和角鲨烷固定液等。液液色谱
48、法的固定液液液色谱法的固定液第29页/共86页液液色谱法液液色谱法的流动相的流动相 在液液色谱中，除一般要求外，还在液液色谱中，除一般要求外，还在液液色谱中，除一般要求外，还在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性质往往处于两因此固定液和流动相的性质往往处于两因此固定液和流动相的性质往往处于两因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端，例如当选择固定液是极性物质个极端，例如当选择固定液是极性物质个极端，例如当选择固定液是极性物质个极端，例如当
49、选择固定液是极性物质时，所选用的流动相时，所选用的流动相时，所选用的流动相时，所选用的流动相通常是极性很小的通常是极性很小的通常是极性很小的通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。溶剂或非极性溶剂。溶剂或非极性溶剂。溶剂或非极性溶剂。第30页/共86页液液色谱的分类液液色谱的分类 以极性物质作为固定相，非极性溶剂作以极性物质作为固定相，非极性溶剂作以极性物质作为固定相，非极性溶剂作以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的液液色谱，称为流动相的液液色谱，称为流动相的液液色谱，称为流动相的液液色谱，称为正相分配色谱正相分配色谱正相分配色谱正相分配色谱，适，适，适，适合于分离极性化合物；合于分离极性化合
50、物；合于分离极性化合物；合于分离极性化合物；反之，如选用非极性物质为固定相，而反之，如选用非极性物质为固定相，而反之，如选用非极性物质为固定相，而反之，如选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液液色谱称为极性溶剂为流动相的液液色谱称为极性溶剂为流动相的液液色谱称为极性溶剂为流动相的液液色谱称为反相分配反相分配反相分配反相分配色谱色谱色谱色谱，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。芳烃及烷烃等化合物。芳烃及烷烃等化合物。芳烃及烷烃等化合物。第31页/共86页 离子交换色谱离子