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1、会计学1液相色谱基本理论培训液相色谱基本理论培训色谱分析方法的特点色谱分析方法的特点:n n特点:HPLC的特点可以归结为“三高一广一快”。即高压，高效，高灵敏度;使用范围广；分析速度快。n n优点：可以用于高沸点，分子量大，难挥发的有机物质和有生物活性物质的分析和分离，分析速度快，灵敏度高，选择性好n n缺点：缺少通用型的检测器类型，不能用于有机物质的准确定性第1页/共15页色谱分析方法的原理色谱分析方法的原理;n n原理：使混合物中个组分在两相间进行分配，其中一相是不动的，称为固定相；另一相是携带混合物流过此固定相的流体，称为流动相，当流动相中所含混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，
2、由于各组分在性质和结构上的差异，以及与固定相发生作用的大小，强弱也有差异。因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。第2页/共15页色谱分析方法的两个理论依据：色谱分析方法的两个理论依据：n n塔板理论（塔板理论（plate theoryplate theory）理论假设：快速分配平衡；脉动式的进入；沿柱方向扩散；分配系数为一定值。理论假设：快速分配平衡；脉动式的进入；沿柱方向扩散；分配系数为一定值。解决的问题：色谱流出曲线方程：解决的问题：色谱流出曲线方程：C=C0/(2)0.5e-(t1-t2)/2C=C0/(2)0.5e-(t1-
3、t2)/2 可以导出可以导出n n与色谱峰半峰宽度或峰底宽度的关系：与色谱峰半峰宽度或峰底宽度的关系：n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/W)2n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/W)2优点：成功的解释了流出曲线的形状（呈正态分布），浓度极大点的位置以及计优点：成功的解释了流出曲线的形状（呈正态分布），浓度极大点的位置以及计算评价柱效能的方法。算评价柱效能的方法。缺点：不能解释塔板高度是受那些因素影响的本质问题缺点：不能解释塔板高度是受那些因素影响的本质问题 不能解释为什么在不同的流速下可以测得不同的理论塔板数不能解释为什么在不同的流速下可以测得不同的理论塔板数第3页/共1
4、5页速率理论（速率理论（rate theory）理论假设：由踏板理论和塔板高度的动力学因素构成。理论假设：由踏板理论和塔板高度的动力学因素构成。H=A+B/u+cUH=A+B/u+cU涡流扩散项（多路径效应）：涡流扩散项（多路径效应）：A=2dpA=2dp -填充物的不均匀性填充物的不均匀性 dp-dp-填充物的平均颗粒直径填充物的平均颗粒直径实际意义：使实际意义：使AA可使可使Hn=L/HnHn=L/Hn塔板数上升可以提高柱效塔板数上升可以提高柱效分子扩散项（纵向扩散项）：分子扩散项（纵向扩散项）：B=2rDgB=2rDg r-r-因载体填充在柱内而引起的气体扩散路径弯曲的因数因载体填充在柱
5、内而引起的气体扩散路径弯曲的因数 Dg-Dg-组分在气相中的扩散系数反比于再起相对分子量的平方组分在气相中的扩散系数反比于再起相对分子量的平方根根实际意义：实际意义：MDg(B/U)nMDg(B/U)n塔板数上升可以提高柱效塔板数上升可以提高柱效传质阻力项：传质阻力项：C=Cg+ClC=Cg+Cl Cg-Cg-气相传质阻力项气相传质阻力项 Cl-Cl-液相传质阻力项液相传质阻力项第4页/共15页关于基线的关于基线的3个概念个概念基线：没有组分进入检测器时，反映基线：没有组分进入检测器时，反映检测器系统噪声随时间变化的线检测器系统噪声随时间变化的线称为基线称为基线基线漂移：基线随时间的定向缓慢变
6、基线漂移：基线随时间的定向缓慢变化化基线噪声基线噪声:指由各种因素所引起的基指由各种因素所引起的基线起伏线起伏第5页/共15页关于保留时间关于保留时间6个概念（体积）个概念（体积）死时间：不被固定相吸附或溶解的组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所要的时间保留时间：指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需要的时间调整保留时间：扣除死时间的保留时间死体积：指填充柱管内固定相颗粒间所剩留的空间以及柱前和柱后连接头的空间总和保留体积：指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需要的流动相体积调整保留体积：扣除死体积的保留体积第6页/共15页两个重要因子两个重要因子选择因子选择因子：某组分：某
7、组分2 2的调整保留时间与另一个组分的调整保留时间与另一个组分1 1的的调整保留时间的比值调整保留时间的比值 =r21=t(2)/t(1)=r21=t(2)/t(1)容量因子容量因子：在一定的温度和压力下，在两相间达到分：在一定的温度和压力下，在两相间达到分配平衡时，组分在两相间的质量比配平衡时，组分在两相间的质量比 =ms/mm=ms/mm第7页/共15页一个系数一个系数分配系数K：在一定的温度下，在两相间达到分配平衡时，组分在两相间的浓度比 K=Cs/Cm第8页/共15页几个重要色谱数学表达式：几个重要色谱数学表达式：n n分离度：分离度：R=tR(2)-tR(1)/0.5(Y1+Y2)R
8、=tR(2)-tR(1)/0.5(Y1+Y2)n n色谱分离基本方程式色谱分离基本方程式:R=1/4n1/2(a-1)/ak/(1+k)R=1/4n1/2(a-1)/ak/(1+k)n n理论塔板数与板高度方程式理论塔板数与板高度方程式:n=5.54(tR/Y1/2)2=16(tR/Y)2 n=5.54(tR/Y1/2)2=16(tR/Y)2 H=L/n H=L/n第9页/共15页HPLC构成和使用时的注意事项构成和使用时的注意事项1.流动相储液箱：主要用于流动相的存放。2.在线脱气机：主要用于流动相的脱气，防止在流动相中有溶解的气体以引起基线噪声的增加。3.比例阀：用于二元泵或四元泵的流动相
9、中各组分的混合。4.高压泵：给流动相一个高压的推动力，使其通过色谱柱。5.进样器（六通进样阀）：将样品顺利的注入色谱系统。6.柱温箱：维持色谱柱的恒定温度，使一定的流动相粘度和压力降稳定，以获得稳定的保留时间，使其有良好的重现性。7.色谱柱：样品中个组分分离的主要场所。8.检测器：将样品中各组分的量转化为可检测的信号。（常用的是紫外检测器）第10页/共15页HPLC色谱条件的优化：色谱条件的优化：1.流动相的优化：流动相的优化：HPLCHPLC要提高分离的效率，必须提高柱内填料装要提高分离的效率，必须提高柱内填料装填的均匀性和减小填充物质的颗粒粒径，以加快传质效率。填的均匀性和减小填充物质的颗
10、粒粒径，以加快传质效率。选用低粘度的流动相，也可以在一定程度上提高传质效率。选用低粘度的流动相，也可以在一定程度上提高传质效率。2.2.柱温的选择柱温的选择:温度恒定可以使流动相的粘度相对稳定，以保持保留温度恒定可以使流动相的粘度相对稳定，以保持保留时间稳定的重现性，适当提高柱温以降低流动相的粘度，可时间稳定的重现性，适当提高柱温以降低流动相的粘度，可以在一定程度上提高传质效率。以在一定程度上提高传质效率。3.3.进样时间和进样量的选择：进样时间太长，试样原始浓度变大，进样时间和进样量的选择：进样时间太长，试样原始浓度变大，半峰宽变宽，柱效下降，故进样速度必须快；进样量太多，半峰宽变宽，柱效下
11、降，故进样速度必须快；进样量太多，峰叠加，分离不好，进样量少又会使含量少的组分检测不到，峰叠加，分离不好，进样量少又会使含量少的组分检测不到，应控制在峰高和峰面积与进样量呈线性关系的范围内。应控制在峰高和峰面积与进样量呈线性关系的范围内。4.4.分离模式的选择：合成高分子一般用体积排阻色谱（分离模式的选择：合成高分子一般用体积排阻色谱（SECSEC）;蛋白蛋白质一般用凝胶过滤色谱（质一般用凝胶过滤色谱（GFCGFC）和体积排阻色谱（）和体积排阻色谱（SECSEC）;小小分子可以根据其溶解性对其选择，水溶性的强极性物质反相分子可以根据其溶解性对其选择，水溶性的强极性物质反相色谱（色谱（RPCRP
12、C）为其首选分离模式）为其首选分离模式;醇溶性的物质可以选用正相醇溶性的物质可以选用正相色谱（色谱（NPCNPC）为其首选分离模式。）为其首选分离模式。第11页/共15页具体色谱条件分析具体色谱条件分析：n n格列奇特分离度调整：n nT=35 F=1 M=水：乙腈=60:40R=1.22n nT=35 F=0.8 M=水：乙腈=60:40R=1.31n nT=25 F=0.8 M=水：乙腈=60:40R=1.37 n nT=25 F=0.8 M=水：乙腈=60:40R=1.51n nT=25 F=0.8 M=水：乙腈=50:50R=0.63n nT=25 F=1.0 M=水：乙腈=65:35
13、R=2.55n nT=25 F=1.5 M=水：乙腈=65:35R=2.40峰保留值调至正常第12页/共15页主要参考文献：主要参考文献：朱明华朱明华.仪器分析仪器分析.北京：高等教育出版社，北京：高等教育出版社，19981998苏立强，郑永杰等；色谱分析法苏立强，郑永杰等；色谱分析法.清华大学出版清华大学出版社，社，20092009刘国诠，余兆楼刘国诠，余兆楼.色谱柱技术色谱柱技术.北京北京.化学工业出化学工业出版社，版社，20052005弓爱君弓爱君,弓文秀弓文秀.高等色谱高等色谱.北京：化学工业出版北京：化学工业出版社，社，20092009刘虎威刘虎威.使用色谱技术问答使用色谱技术问答.北京：化学工业出北京：化学工业出版社，版社，20092009第13页/共15页谢谢大家谢谢大家!第14页/共15页