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1、3 高效液相色谱分析高效液相色谱分析 High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography第1页/共31页第2页/共31页HPLC特点：经典液体柱色谱引入气相色谱法理论高压：突出特点；150105 350105 Pa高速：20h-1h高效：GC-1000塔板/m HPLC3万塔板/m(固定相)高灵敏度：UV；AFS 第3页/共31页HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1 1分析对象分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，
2、高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚 物的样品不可检测 占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子 型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%第4页/共31页2 2流动相差别流动相差别vGC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 vHPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动
3、相种类较多，选择余地广流动相极性和流动相极性和pHpH值的选择也对分离起到重要作用值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性可以增大分离选择性3 3操作条件差别操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）第5页/共31页影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素3-3-1 1H=A+B/u+Cu液体与气体的不同？第6页/共31页1.涡流扩散项HeHe=2dp 一定 2.纵向扩散项HdHd=CdDm/试样分子本身运动所引起的纵向扩散，试样分子本身运动所引起的
4、纵向扩散，当线速度大于当线速度大于0.5 时，可忽略时，可忽略 3.传质阻力项：主要因素Hs=Csdf2 /Ds 试样分子从流动相进入到固定液试样分子从流动相进入到固定液Hm=Cmdp2 /DmHsm=Csmdp2 /Dm固定相传质阻力流动相传质阻力流动的流动相传质阻力滞留的流动相传质阻力（传质过程中主要作用）第7页/共31页H=2dp+CdDm/+Csdf2 /Ds +Cmdp2 /Dm+Csmdp2 /Dm ABC主要因素：传质相 C提高柱效有效途径：减小粒度Hmin小一个数量级柱外展宽：柱前峰展宽；柱后展宽试样注入到填料中心之内12mm 处，减少柱前扩散；连接管的体积和检测器的死体积应尽
5、可能小。第8页/共31页主要类型与分离原理basic principle and main separating types3-3-2 2一、液一、液-液分配色谱液分配色谱liquid-liquid partition chromatogra二、液二、液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatograph三、离子交换色谱三、离子交换色谱ion-exchange chromatograph四、空间排阻色谱四、空间排阻色谱size-exclusion chromatograph第9页/共31页第10页/共31页一、液-液分配色谱-化学键合相色谱 固定相与
6、流动相均为液体（互不相溶）固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：基本原理：组分在固定相和流动相上的相对溶解度不同；组分在固定相和流动相上的相对溶解度不同；流流动动相相：对对于于亲亲水水性性固固定定液液，采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定液液的的极极性性（正正相相 normal phase），反反之之，流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性（反反相相 reverse phase）。正正相与反相的出峰顺序相反；相与反相的出峰顺序相反；固定相：固定相：早期涂渍固定液，固定液流失早期涂渍固定液，固定液流失？，较少采用；，较少采用；化
7、化学学键键合合固固定定相相：（将将各各种种不不同同基基团团通通过过化化学学反反应应键键合合到到硅硅胶胶（担担体体）表表面面的的游游离离羟羟基基上上。C-18柱柱（反反相相化化学学键键合合相色谱应用最广泛相色谱应用最广泛）。）。第11页/共31页二、液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography 固固定定相相：固固体体吸吸附附剂剂 如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等，较较常常使使用用的的是是510m的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂；流动相：流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。各种不同极性的一元或多元溶剂。基基本本原原理理：试试样样分分子子和和流流动动相相分分
8、子子对对固固定定相相表表面面的的竞竞争吸附；争吸附；适适用用于于分分离离相相对对分分子子质质量量中中等等的的油油溶溶性性试试样样，对对具具有有官能团的化合物和异构体有较高选择性；官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；非线形等温吸附常引起峰的拖尾；第12页/共31页三、离子交换色谱 固定相：固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流流动动相相：阴阴离离子子离离子子交交换换树树脂脂作作固固定定相相，采采用用酸酸性性水水溶溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水
9、溶液；基基本本原原理理：组组分分在在固固定定相相上上发发生生的的反反复复可可逆逆离离子子交交换换反反应应；组组分分与与离离子子交交换换剂剂之之间间亲亲和和力力的的大大小小与与离离子子半半径径、电电荷荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长存在形式等有关。亲和力大，保留时间长.阳离子交换：阳离子交换：RSO3H +M+=RSO3 M +H+阴离子交换：阴离子交换：RNR4OH +X-=RNR4 X+OH-离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，根据不同离子对交换剂具有不同亲和力实现分离。第13页/共31页离子色谱法（IC）离子交换的基础上发展而来。离子交换的基础上
10、发展而来。水溶液中阴离子分析的最佳方法水溶液中阴离子分析的最佳方法。固定相：离子交换树脂固定相：离子交换树脂流动相：电解质溶液流动相：电解质溶液“用电导检测器对阳离子和阴离子混合物作常量和痕量分析的色谱法。分析时在分离柱后串接一根抑制柱，来抑制流动相中的电解质的背景电导率”第14页/共31页空间排斥（阻）色谱空间排斥（阻）色谱Size Exclusion ChromatographyM.W.tR四、排阻色谱色谱：不以相互作用力差异进行分离第15页/共31页 固定相：凝胶固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；原原理理：按按分分子子大大小小分分离离。小小分分子子可可以以扩扩散散
11、到到凝凝胶胶空空隙隙，由由其其中中通通过过，出出峰峰最最慢慢；中中等等分分子子只只能能通通过过部部分分凝凝胶胶空空隙隙，中中速速通通过过；而而大大分分子子被被排排斥斥在在外外，出出峰峰最最快快；溶溶剂剂分分子子小小，故在最后出峰。故在最后出峰。全部在死体积前出峰全部在死体积前出峰？；可可对对相相对对分分子子质质量量在在100-105范围内的化合物按质量分离范围内的化合物按质量分离 第16页/共31页排阻色谱法不能用来分离大小相似、相对分子质量接近的分子只能分离相对分子质量差别在10%以上的分子可测定高聚物的相对分子质量的分级情况第17页/共31页一、液相色谱固定相stationary phas
12、e of HPLC二、液相色谱流动相 mobile phase of HPLC液相色谱的固定相与流动相stationary phase and mobile phase of HPLC3-3-3 3第18页/共31页一、液相色谱固定相 stationary phases of LC 1.1.液液-液色谱及键合相色谱固定相液色谱及键合相色谱固定相 （1）全多孔型担体）全多孔型担体 由由氧氧化化硅硅、氧氧化化铝铝、硅硅藻藻土土等等制制成成的的多多孔孔球球体体；早早期期采采用用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现现采采用用10m以以下下的
13、的nm级级硅硅胶胶微微粒粒堆堆积积而而成成的的小小颗颗粒粒，化化学键合制备柱填料；学键合制备柱填料；（2）表层多孔型担体）表层多孔型担体 （薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体）3040m的的玻玻璃璃微微球球，表表面面附附着着一一层层厚厚度度为为1 2m的多孔硅胶。的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；表面积小，柱容量底；第19页/共31页（3）化学键合固定相 化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；稳定，耐水、耐光、耐有机溶
14、剂，应用最广；c.硅碳键型：硅碳键型：SiC d.硅氮键型：硅氮键型：SiN第20页/共31页化学键合固定相的特点（1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定稳定；（4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；存在着存在着双重分离机制双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：
15、分配为主；高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主；第21页/共31页 2.2.液液-固吸附分离固定固吸附分离固定相相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：粒度：510 m；第22页/共31页3.3.离子交换色谱离子交换色谱分离固定分离固定相相 结构类别：结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：树脂类别：（1）阳阳
16、离离子子交交换换树树脂脂（强强酸酸性、弱酸性）性、弱酸性）（2）阴阴离离子子交交换换树树脂脂（强强碱碱性、弱碱性）性、弱碱性）第23页/共31页 4.4.空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。第24页/共31页二、液相色
17、谱的流动相 mobile phases of LC 1.1.流动相特性流动相特性 （1）液液相相色色谱谱的的流流动动相相又又称称为为：淋淋洗洗液液，洗洗脱脱剂剂。流流动动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，称称为为正正相相液液液液色色谱谱法法，极极性性柱柱也也称称正正相柱。相柱。（3）若若流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为
18、反反相相柱柱。组组分分在在两两种种类类型型分分离离柱柱上上的出峰顺序相反。的出峰顺序相反。第25页/共31页2.2.流动相类流动相类别别 按流动相组成分：单组分和多组分；按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常常用用溶溶剂剂：己己烷烷、四四氯氯化化碳碳、甲甲苯苯、乙乙酸酸乙乙酯酯、乙乙醇醇、乙腈、水。乙腈、水。采采用用二二元元或或多多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。相的极性或
19、增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第26页/共31页3.3.流动相选流动相选择择 在选择溶剂时，在选择溶剂时，溶剂的极性溶剂的极性是选择的重要依据。是选择的重要依据。采用正相液采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧
20、六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)第27页/共31页4.4.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用）尽量使用高纯度高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固
21、定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。第28页/共31页思考题：1.正相色谱2.反相色谱3.化学键和固定相4.洗脱剂及其作用第29页/共31页离子对色谱强极性有机酸、有机碱的分离分析将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱的分离第30页/共31页谢谢您的观看！第31页/共31页