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1、基因克隆的一般流程基因的获得基因的获得PCRRT-PCR载体载体连接连接准备感受态细胞准备感受态细胞转化转化重组子筛选重组子筛选下游工作下游工作载体的选择n基因工程载体一般要求：基因工程载体一般要求：能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力。易进入宿主细胞，进入效率越高越好。合适的多克隆位点（MCS）可接受外源片段，且不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。易从宿主细胞中分离纯化出来，便于重组操作。有筛选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。便于克隆操作。n常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等重组 DNA 技术的一般流程目的
2、目的DNADNA的获得的获得目的目的DNADNA与载体的连接与载体的连接重组子导入受体细胞重组子导入受体细胞重组子的筛选和鉴定重组子的筛选和鉴定实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建nNGF 基因的克隆(T-A克隆)NGF-sense:a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagtNGF-antisense:at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg5 56 6pEGFP 荧光质粒表达载体质粒DNA的酶切反应结果质粒质粒 M M 酶切反应酶切反应 M M 酶切反应酶切反应pEGFP pT-NGF酶切产物凝胶回收操作步骤（Gel Extraction Ki
3、t）仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的离心管中。称重。按300lS1溶液/100mg凝胶加入的比例加入S1溶液，置50水浴10分钟，使凝胶完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g30秒，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。在吸附柱中加入500l W1溶液，9000g15秒，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。重复一次洗柱。将吸附柱放入同一收集管中。9000g1分钟。将吸附柱放入一新ml离心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，静置1分钟，9000g1分钟。备用。重组子的筛选n耐药性基因 外源质粒赋予宿主抗生素抗性n蓝白斑筛选
4、（互补现象）lacZ plasmid 和 M15 cell strain 关于连接酶定义：定义：ATP存在下，在存在下，在3OH和和5 P之间形成磷酸二酯键。之间形成磷酸二酯键。特性：连接粘端的效率远高于平端。特性：连接粘端的效率远高于平端。策略：策略：1.首选不匹配粘端首选不匹配粘端2.次选匹配粘端，载体脱磷次选匹配粘端，载体脱磷3.平端连接，延长时间，提高酶量平端连接，延长时间，提高酶量平端连接图示匹配粘端连接图示 不匹配粘端连接图示连接反应的建立连接反应的温度：连接反应的温度：v粘性末端，按A-T，G-C含量计算，5。v如 Pst I（CTGCAG，12），EcoRI（GAATTC，8）
5、。v平末端，如EcoR（GATATC），可在室温进行，不超过30，酶的用量要比粘性末端加大10-100倍。DNA量：量：v摩尔数之比 载体:目的 DNA 1:(13)载体摩尔数 目标基因片段碱基数载体重量 目标DNA摩尔数 目标基因片段重量载体碱基数 载体和目标基因的连接反应如未定量可以按回收效率75计算DNA浓度，按载体与目的基因摩尔数比1:3进行连接。ml离心管中进行。15 l体积反应体系中：加ddH2O使终体积为 15 l Liner vector 50-100 ng Target gene fragment 15-30 ng 10Ligase Buffer(已含有ATP)1.5 l T4 DNA Ligase 1.O l轻轻混匀，稍加离心,14-16或4,O/N。重组子转入受体细胞体外重组的体外重组的DNADNA引入受体细胞引入受体细胞感受态感受态:受体细胞处于易于接受外源受体细胞处于易于接受外源 DNA DNA 的状态的状态原理原理:（1 1）遗传物质的传递）遗传物质的传递 （2 2）受体菌的选择与改造）受体菌的选择与改造重组质粒的酶切鉴定重组子的鉴定n插入片段长度大小鉴定插入片段长度大小鉴定 质粒抽提、酶切；PCRn插入片段方向性鉴定插入片段方向性鉴定 可以选择基因内部切点进行不对称酶切 nDNADNA序列测定序列测定荧光质粒转染观察