目的基因的制备ppt课件.ppt

《目的基因的制备ppt课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《目的基因的制备ppt课件.ppt（117页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、2022-8-11第五章 目的基因的制备第一节 目的基因的制备目的基因的制备第二节 目的基因的分离目的基因的分离我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-12一 概 述 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。目目的的基基因因确定其表达调控机制和生物学功能建立高效表达系统构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）体外进行必要的结构功能修饰输回细胞内改良生物体遗传性状，包括人体基因治疗我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里

2、呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-13二 什么是目的基因 基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出此类基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因通常称之为目的基因。 如抗逆性相关基因（抗病、抗寒等）、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因 、工业用酶等相关基因等。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-14 一般来说，目的基因的制备战略分为一般来说，目

3、的基因的制备战略分为两大类两大类 一类是构建感兴趣的生物个体的一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库基因文库，即将，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；组克隆； 另一类是利用另一类是利用PCR扩增扩增技术甚至技术甚至化学合成化学合成法体外法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。直接合成目的基因，然后将之克隆表达。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物202

4、2-8-1第一节 目的基因的制备5第一节 目的基因的制备目的基因的制备 1、直接法制备基因、直接法制备基因 2、从基因组文库中钓取目的基因、从基因组文库中钓取目的基因 3、从、从cDNA文库中钓取目的基因文库中钓取目的基因 4、通过、通过PCR直接扩增出目的基因直接扩增出目的基因我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-161.1 限制性核酸内切酶酶切分离法 限制性内切酶酶切分离法适于从简单基因组（如质粒和病毒）中分离目的基因。 对已定序的DNA分子，只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶

5、进行一次或几次切割，分离纯化所需DNA片段，与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。 对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性内切酶识别位点，用适当的限制性内切酶切割，一次就可获得目的基因。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-17 所谓所谓基因就是基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以只所以只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。 19771977

6、年，利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激年，利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。学合成基因得到了很大的发展迅速。早期通过化学合成的部分基因早期通过化学合成的部分基因 基因人胰岛素转运RNA-干扰素肠促胰液肽尿抑胃激素-干扰素大小（bp）12654281162453合成年代197819791981198219821984 基因视紫红质前脑菲肽ATP酶溶菌酶RNA酶T1RNA酶大小（bp）105777170385324375合成年代

7、1985198519851985198619871.2 化学法直接合成基因化学法直接合成基因2022-8-181.2.1.1小片段粘接法：小片段粘接法： 混合退火混合退火根据目的基因全序列，分别合成根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链碱基长的单链DNA小片段小片段T4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 1.2.1 化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成有三种战略：2022-8-19混合退火混合退火T4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 Klenow酶聚合酶聚合1.2.1.2 补钉延长法补钉延长法根据目的基因两条互补链

8、全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段2022-8-110根据目的基因根据目的基因的的全序列，分别合成全序列，分别合成40-50碱基长的单链碱基长的单链DNA片段片段混合退火混合退火T4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 Klenow酶聚合酶聚合1.2.1.3 大片段酶促法大片段酶促法 2022-8-1111.2.1.4 三种方法各有利弊三种方法各有利弊 化学合成化学合成DNADNA的单片段愈短，收率就愈高，但的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片

9、段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%95%则合则合成成5050个碱基长的个碱基长的DNADNA单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率只有7.7%7.7%2022-8-1121.2.2 化学合成的单元操作化学合成的单元操作化学合成化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：一个个接上去，每接一个

10、单体就是一个循环反应，包括：基团保护基团保护、分离分离、缩合缩合、分离分离、去保护去保护五大操作单元。五大操作单元。 从反应机理上来讲，从反应机理上来讲，DNA化学合成有化学合成有磷酸二酯法磷酸二酯法、磷酸三酯法磷酸三酯法、亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法；具体操作过程又有；具体操作过程又有液相合成液相合成和和固相合成固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据合成仪就是根据固固相亚磷酸三酯法相亚磷酸三酯法原理设计的原理设计的我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样

11、一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-113OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH激活缩合氧化脱取代基玻璃珠化学合成的单元操作化学合成的单元操作DMT： 二甲氧基三苯甲基连接臂2022-8-114合成天然基因合成天然基因修饰改造基因修饰改造基因 设计新型基因设计新型基因 制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头 1.2.3 DNA化学合成的用途化学合成的用途如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、

12、干扰素基因等基因、干扰素基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备15第一节 目的基因的制备目的基因的制备 1 直接法制备基因直接法制备基因 2 从基因组文库中钓取目的基因从基因组文库中钓取目的基因 3 从从cDNA文库中钓取目的基因文库中钓取目的基因 4 利用利用PCR直接扩增出目的基因直接扩增出目的基因我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的

13、世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-116 对于高等真核生物而言，基因组DNA庞大，组成结构复杂，存在间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，大多数基因难以直接分离得到。 为了解决这个难题，可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。 但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增,而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因组文库。然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证

14、实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备172、从基因组文库中钓取目的基因、从基因组文库中钓取目的基因 2.1基因文库的构建基因文库的构建 2.1.1基因文库的基本概念基因文库的基本概念 基因库基因库(gene pool):特定生物体全基因组的集合（天然存在）特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库基因文库(gene library or gene bank):从特定生物个体中分离的从特定生物个体中分离的全部全部基因，这些基因以基因，这些基因以克隆克隆的形式存在（人工构建）的形式存在（人工构建）一个受体菌一个受体菌的群体之中的群体之中 , 这个群体即为

15、这种生物的基因文库。这个群体即为这种生物的基因文库。 根据构建方法的不同，基因文库分为根据构建方法的不同，基因文库分为:基因组文库（含有全部基基因组文库（含有全部基因）；因）； cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备182.1.2 基因文库构建的材料来源基因文库构建的材料来源材料来自染色体材料来自染色体DNA或或mRNA 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段在高度分化的生

16、物体中，不同组织和细胞在不同时段的的mRNA一般还有组织细胞的界定，如肝组织一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库文库或胚胎组织或胚胎组织cDNA文库等。很显然，文库等。很显然， cDNA文库的信息量文库的信息量远小于基因组文库种类不同（即基因的表达谱不同），因远小于基因组文库种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的此同种生物体的cDNA文库文库我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1192.1.3 基因文库的完备性基因文库的完备性 基因文库的完备性是指：在构建的基因文

17、库中任一基因基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N N之间的关之间的关系可用下式表示：系可用下式表示：其中：其中：P=P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，f=f=克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小/ /生物基因组的大小生物基因组的大小 N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提

18、高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-120For example : 期望值为0.99，插入片断为20kb20kb的的 E.coli (4.6106 bp) 和 human (3109 bp) 基因组的克隆数的计算 N E.coli= =1.1 103 ln( 1-0.99) ln1-(2104/4.6106)Nhuman= = 6.9 105 ln(1-0.99) ln1-(2 104/3 109) 这个例子说明用质粒载体（插入片

19、段5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备212.1.4基因文库的质量标准基因文库的质量标准 除了尽可能高的除了尽可能高的完备性外，完备性外，一个理想的基因文库一个理想的基因文库应具备下列条件：应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度载体的装载量最好大于基因的长度 避

20、免基因被分隔克隆避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选重组克隆能稳定保存、扩增、筛选我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1222.1.5基因文库的构建技术路线 材料的选择及基因组DNA的制备； 载体的选择； 载体与基因组DNA的限制性酶切； 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； 重组克隆的筛选

21、和保存。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备232.1.5.1 基因组基因组DNA的制备的制备 A A A A文库构建的文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高用常规方法制备的染色体用常规方法制备的染色体DNA的

22、长度一般在的长度一般在100 kb左右。如左右。如果先将细胞固定在低融点凝胶果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有中，然后置入含有SDS、蛋白、蛋白酶酶K、RNase的缓冲液中浸泡，的缓冲液中浸泡，可获得可获得1000 kb大小的大小的DNA片段片段我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备242.1.5.2 载体的选择载体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YA

23、C或BAC载体。由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。上述几种上述几种载体的最大装载量如下：载体的最大装载量如下： l l-DNA 质粒质粒 考斯质粒考斯质粒 10 kb 23 kb 45 kb BAC 300 kb用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备252.1.5.3 载体与基因组载体与基因组DNA的切割的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超

24、声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一 保证DNA片段之间存在部分重叠区。第二 保证DNA片段大小均一。超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头。部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，这样DNA酶解片段的大小可控。连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备262.1.5.4 载体与外源片段的连接载体与外源片段的连接（1） 连接酶

25、 DNA连接酶；T4 DNA连接酶；连接酶；E.coli DNA连接酶连接酶它们都可以催化5末端磷酸和3末端羟基形成磷酸二酯键。但由于T4 DNA连接酶既能连接粘性末端还能连接平末端，而E.coli DNA连接酶主要连接粘性末端，所以一般连接反应中都用T4 DNA连接酶。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备27（2）连接反应的效率 连接反应的效率和连接产物的组成与DNA末端的特性、DNA末端的浓度以及所用的连接酶量有关。平末端连接反应的效率相对较低，它需要较

26、高浓度的平末端、较大的连接酶量、较低浓度的ATP以及不能有象亚精胺一类的多胺。在连接反应中加入15的PEG 8000或11.5pmolL 氯化六氨合钴等浓缩剂可极大地促进平末端反应的连接速度，同时可改变不同连接产物的比例，使连接产物增多。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备28（3）避免）避免外源外源DNADNA片段之间的连接片段之间的连接措施措施 在基因组在基因组文库的构建过程中，文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：最应引起重视的问题是：严禁外源严禁外

27、源DNADNA片段之间的连接！片段之间的连接！ 为了避免上述情况的发生，为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：可采取下列措施的组合： 将待连接的将待连接的DNA片段根据载体的装载量片段根据载体的装载量分级分离分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团片段的末端磷酸基团 用酶在用酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端片段的末端上增补同聚尾末端我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备29我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为

28、什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备302.1.5.5 重组重组DNADNA导入宿主及筛选导入宿主及筛选 转化 转导 转染 感染 结合 其它我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-131密集铺板（密集铺板（1-10万）万） 杂杂交交 挖挖取取目的重组克隆目的重组克隆 铺铺板板 铺铺板板我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测

29、没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备32构建噬菌构建噬菌体基因组体基因组文库的主文库的主要步骤要步骤 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备33我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备342.1.5.6 基因组文库重组克隆的排序 大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困大型基因文库（

30、包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个难，如果一个YACYAC基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNADNA序列。序列。 然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体个像天然染色体DNADNA上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作我吓了一

31、跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备35（1）酶切片段末端标记法）酶切片段末端标记法 将单一的将单一的YACYAC克隆插入克隆插入DNADNA片段用限制性内切酶分布均匀地水解成片段用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标记同位素。若干片段，末端标记同位素。 然后再用然后再用Sau3A ISau3A I或或Mbo IMbo I将末端标记的将末端标记的DNADNA片段降解成碎片，聚片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每丙烯酰胺凝胶电泳，每1010个个YACYAC克

32、隆走在同一块板上，形成克隆走在同一块板上，形成1010个个克隆的特征性克隆的特征性DNADNA指纹图谱指纹图谱 电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNADNA的指纹图谱有部分的指纹图谱有部分相同的，则其两个相同的，则其两个YACYAC片段就有互相重叠的可能性，于是这两个片段就有互相重叠的可能性，于是这两个YACYAC克隆的克隆的DNADNA片段克隆在染色体上是排列一起的片段克隆在染色体上是排列一起的 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节

33、 目的基因的制备36HHHHS S SSSSSSSSSSSSS SSSS单一克隆指纹图谱十克隆指纹图谱载体载体DNA克隆克隆DNA我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备37（2）随机探针联合杂交法）随机探针联合杂交法 将若干将若干YACYAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成2020种不种不同序列的短探针，其序列是随机的。同序列的短探针，其序列是随机的。 用用2020种探针随机定位杂交（一对一）种探针随机定位杂交（

34、一对一）2020份份YACYAC克隆薄膜。克隆薄膜。 如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”1”，而阴，而阴性结果记为性结果记为“0”0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述，可清晰地列成一张表，最终排出上述YACYAC克隆克隆的排列顺序的排列顺序 。2022-8-1380102030405060708091011121314151617181920A B C DE FG0102 03 04 05 06 07 08 09 10 1

35、1 12 13 1415 16 1718 19 20DABCEFG1111111111111111111111111111112022-8-13901 04 12 06 13 14 02 17 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18DABCEFG111111111111111111111111111111FCAD DGEB我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-140（3）染色体走读法（）染色体走读法（chromosome walking） 从基因文库中

36、任取一个克隆作为染色体走读的起点，将从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在之两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5 2.0 kb范围范围内内 分别以上述亚克隆分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入库，杂交阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆片段必定与起点克隆所含的所含的DNA片段连锁在一起片段连锁在一起 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体走读，直至线型染色体DNA的端点的端点2022-8-141染色体走读法

37、（染色体走读法（chromosome walking）走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列亚克隆旁测序列探针标记探针标记第一轮杂交第一轮杂交阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交2022-8-142染色体走读法（染色体走读法（chromosome walking）走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1432.1.5.7 从基因组文库中钓取目的基因从基因组文库中钓取目的基因 构建了基因文库仅仅是完成了

38、基因克隆，并不等于完成了基因分离。构建成的文库仅是一个杂乱无章的“基因图书馆”，要想从中找到所需基因，必须有一些相关线索。分离目的基因也要知道与目的基因有关的某些或某个特征，才能据此找到相关基因。主要方法有：核酸杂交方法；免疫学检测方法；DNA同胞选择法（极少用）；PCR筛选法；其他方法。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-144（1）核酸杂交方法 适用于大量筛选，常用，可靠。但需制备探针，所用探针有多种，获得探针的方法很多；（2）免疫学检测方法（3）DNA同胞选择法（极少用）使用

39、抗体探针，通过检测重组克隆表达出的蛋白质来筛选目的克隆。只适用于表达文库的筛选，并只能筛选出表达了的克隆。DNA同胞选择法是按矩阵分值亚库，用mRNA与cDNA杂交后释放出mRNA ，使其在无细胞蛋白合成体系中翻译，并对翻译产物进行免疫沉淀、PAGE电影鉴定或活性分析等来筛选目的快乐，该方法要求全长cDNA，一般只在无其他方法可用或表达产物很小时才用我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-145（4）PCR筛选法 其显著特点是快速、简便。该方法的基本策略是采用“反应池” ，将基因文库分

40、装96孔培养板，如有2304个克隆分别置于24个96孔培养板中，现以反应板为单位，将96个克隆混合成一个“反应池”，进行一个PCR反应，如图：我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-146 从24个反应板中找出具有阳性克隆的反应板，再将该板中的12个横向克隆与8个纵向克隆分别混合，形成12个横向池及8个纵向池，进行20个（8+12）反应，如图，横向阳性池与纵向阳性池交叉的孔为阳性单克隆，通过44个反应可从2304个克隆中筛选分离出单个克隆。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么

41、把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-147大肠杆菌作为寄主进行大肠杆菌作为寄主进行DNADNA克隆的实验方案克隆的实验方案DNADNA片段片段的获得的获得载体构建载体构建细菌转化细菌转化重组体重组体的鉴定的鉴定限制性内限制性内切酶消化切酶消化机械切割机械切割双链双链cDNA的合成的合成化学法化学法直接合成直接合成同聚物同聚物加尾加尾粘性末端粘性末端连接连接平末端平末端连接连接加接头造成加接头造成粘性末端粘性末端重组噬菌体重组噬菌体DNA转染转染重组质粒重组质粒的转化的转化体外包装体外包装进行转导进行转导表型鉴定表型鉴定核酸杂交

42、核酸杂交免疫学分析免疫学分析酶切鉴定酶切鉴定我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备482.1.5.7从基因组文库中钓取目的基因总结图从基因组文库中钓取目的基因总结图我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备49第一节 目的基因的制备目的基因的制备 1、直接法制备基因、直接法制备基因 2、从基因组文库中钓取目的基因、从基因组文库中钓

43、取目的基因 3、从、从cDNA文库中钓取目的基因文库中钓取目的基因 4、通过、通过PCR直接扩增出目的基因直接扩增出目的基因我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1第一节 目的基因的制备503 从从cDNA文库中钓取目的基因文库中钓取目的基因 3.1 cDNA文库的构建文库的构建 3.2 cDNA克隆的操作流程克隆的操作流程我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1513.1

44、.1. cDNA以以mRNA为模板为模板逆转录逆转录出的出的DNA称称cDNA。3.1.2. cDNA librarymRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物利用某种生物的利用某种生物的总总mRNA合成合成cDNA，再将，再将这些这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称行保存和扩增，称cDNA文库。文库。3.1 cDNA文库的构建文库的构建我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1523.1.4. 构建构建cDNA文库的一般步

45、骤文库的一般步骤（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取3.1.3. cDNA文库的特点文库的特点提取总提取总RNA有商业化的试剂盒（有商业化的试剂盒（kit）。）。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-153分离分离mRNA用商业化的用商业化的Oligo dT纤维柱。纤维柱。 利用利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，将尾巴，将mRNA从总从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。等）中分离纯化。 mRNA只占总只占总RNA的的1%-2%。（2）mRNA的分

46、离纯化的分离纯化 原理原理 mRNA的分离纯化的分离纯化Column（柱）（柱）我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-154我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-155反转录酶反转录酶（3）cDNA的合成的合成 cDNA第一链合成第一链合成逆转录酶能以逆转录酶能以RNA为模板合成为模板合成DNA。 用用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成（或随机引物）作引物，合成cD

47、NA的第一链。的第一链。 mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-156用用碱碱处理或用处理或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 3 5 5 引物引物cDNA第一链第一链3 5 引物引物 降解降解mRNA模板模板或或RNaseH碱碱我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在

48、这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-157剩下的剩下的cDNA单链的单链的3末端一般形成一个末端一般形成一个弯弯回来的双链发卡结构回来的双链发卡结构（机理不明），可成（机理不明），可成为合成第二条为合成第二条cDNA链的引物。用链的引物。用DNA聚聚合酶合成第二链合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链第一链5 cDNA第二链合成第二链合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDNA第二链合成第二链合成我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜

49、测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-158去掉发卡结构去掉发卡结构核酸酶核酸酶S1用用核酸酶核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会可以切掉发卡结构（但这会导致导致cDNA中有用的序列被切掉！）。中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 5 3 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-159在双链在双链cDNA末端接上末端接上人工接头人工接头，即可与，即可与载体连接，转入受体菌。载体连接，转入受体菌。或借助

50、或借助末端转移酶末端转移酶给载体和双链给载体和双链cDNA的的3端分别加上几个端分别加上几个C或或G，成为粘性末端。，成为粘性末端。3.1.5.3.1.5.cDNA与载体连接：与载体连接：接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-160我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2022-8-1613.2 cDNA克隆的操作流