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1、2.3 2.3 菌种保藏菌种保藏2.3.12.3.1菌种的衰退与复壮菌种的衰退与复壮2.3.1.1.2.3.1.1.衰退衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。衰退的原因：基因突变，分离现象。常见的衰退现象常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；2.3.1.2.3.1.2 2 菌种的复壮菌种的复壮：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出
2、未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。菌种的复壮措施：菌种的复壮措施：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）；通过寄主体内生长进行复壮；淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）；2.3.1.2.3.1.3 3防止菌种衰退的方法防止菌种衰退的方法：控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方
3、法，可以减少移种和传代数）；选择合适的培养条件；采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；采用有效的菌种保藏方法。2.3.22.3.2菌种保藏菌种保藏2.3.2.12.3.2.1 菌种保藏的重要意义菌种保藏的重要意义菌菌种种保保臧臧是进行微生物学研究和微生物育种工作的重重要要组组成成部部分分。其任务首先是使菌种不不致致死死亡亡，同时还要尽可能设法把菌种的优优良良特特性性保保持持下来而不不致致向向坏的方面转化。坏的方面转化。当然保藏菌种使其不变异亦是相相对对而而言言的。实际上没有一种方法可使菌种绝对不变化，所以研究菌种保藏就是要采用最最合合适适的的保保存存方
4、方法法，使使菌菌种种的的变变异异和和死死亡减少到最低限度。亡减少到最低限度。2.3.2.22.3.2.2 菌种保藏的原理和方法菌种保藏的原理和方法菌种保藏主要是根据菌种的生生理理生生化化特特点点，人工创造条件，使孢子或菌体的生生长长代代谢谢活活动动尽尽量量降降低低，以减减少少其其变变异异。一般可通过保持培培养养基基营营养养成成分分在在最最低低水水平平，缺缺氧氧状状态态，干干燥燥和和低低温温，使使菌菌种种处处于于“休休眠眠”状态，抑制其繁殖能力状态，抑制其繁殖能力。一种好的保藏方法，首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变。菌种保藏的方法很多，一般有下面几种一般有下面几种：A 斜面冰箱保藏法斜面冰
5、箱保藏法 斜斜面面保保藏藏是是一一种种短短期期、过过渡渡的的保保藏藏方方法法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4冰冰箱箱保保存存。一一般般保保存存期期为为三三个个月月到到六六个月个月。B 沙土管保藏法沙土管保藏法这是国内常采用的一种方法。适合于产产孢孢子子或或芽芽孢孢的微生物。它的制备方法制备方法是：首先，将沙与土洗净烘干过筛洗净烘干过筛后，按沙与土的比例按沙与土的比例为为l2 l混合均匀混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左右厘米左右，121C间歇灭菌三次间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用沙用80目过筛目过筛，土用土用30100目过筛目过筛。
6、其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合直接与沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为保存期为1年左右年左右。C石蜡油封存法石蜡油封存法向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高高出出斜斜面面一一厘厘米米，然后保存在冰箱中。此法可通通用用于于不不能能利利用用石石蜡蜡油油作作碳碳源源的的细细菌菌、霉霉菌菌、酵母等微生物的保存酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。保存期约一年左右。D真空冷冻干燥保减法真空冷冻干燥保减法真真空空冷冷冻冻干干燥燥保保臧臧法法是目前常用的较理想的一种方法。其基基本本原原理理是在较低的温度下（15），快速
7、地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水水分分升升华华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。因此，菌种可以保存很长时间，一一般般5年年左左右右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。这种方法的基基本本操操作作过程是先将微生物制制成成悬悬浮浮液液，再与与保保护护剂剂混混合合，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低低温温下下用用真真空空泵泵抽干抽干，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。保保护护剂剂一一般般采采用用脱脱脂脂牛牛奶奶或或血血清清。保护剂的作用可能是在冷
8、冻干燥的脱脱水水过过程程中中代代替替结结合合水水而而稳稳定定细细胞胞成成分分（细细胞胞膜膜）的的构构型型，防防此此细细胞胞膜膜因因为为冻冻结结而而破破坏坏。保护剂还可以起支支持持作作用用，使微生物疏松地固定在上面。牛奶可以离心或加热的方法脱脂牛奶可以离心或加热的方法脱脂。E 液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法液氮超低温保臧法是近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是是适适用用范范围围最最广广的的微微生生物物保保藏藏法法。尤其是一些不不产产孢孢子子的的菌菌丝丝体体，用其它保藏方法不理想，可用液氮保臧法液氮保臧法。其保存期最长。a 原理原理用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达一一196，
9、远远低于其新陈代谢作用停止的温度新陈代谢作用停止的温度（一（一130），所以此时菌种的代谢活动已停止代谢活动已停止，化化学作用亦随之消失学作用亦随之消失。b 操作方法及步骤操作方法及步骤（1）安安瓿瓿管管要要求求由于液氮保存于超低温状态，所使用的安安瓿瓿管管需需能能承承受受大大的的温温差差而而不不致致于于破破裂裂，一般用95料料或或GCl7的的玻玻璃璃管管，安瓿管选好后印印上上标标记记，加加棉棉塞后灭菌，烘干后备用塞后灭菌，烘干后备用。（2）菌种准备及分装）菌种准备及分装 因为液氮法菌种要经受超低温超低温的冷冻过程的冷冻过程。所以也需要保护剂保护剂，常用的保护剂为保护剂为10甘油甘油。用保护剂
10、制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安瓿管的装量为0.21mL。（3）冻冻结结液氮法的关关键键是先先把把微微生生物物从从常常温温过过渡渡到到低低温温。这样在细胞接接触触低低温温前前，使使细细胞胞内内自自由由水水通通过过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。美国ATCC采用先先将将菌菌液液降降温温到到0，再以每每分分钟钟降降低低1的的速速度度，一一直直降降低低到到38，然后才把装有菌液的安瓿管放入液液氮氮罐罐的的气气相相中中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，冰冰晶晶状状态态发发生生变变化化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮的残存量，定期补加常常注意液
11、氮的残存量，定期补加。（4）重新培养）重新培养当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或室温或3540水浴中迅速水浴中迅速解冻解冻，当升温至升温至0时即可打开安瓿管时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。我国国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种部分单位采用液氮法保存菌种。几种常用菌种保藏方法的比较几种常用菌种保藏方法的比较方法名称方法名称主要措施主要措施适宜菌种适宜菌种保藏期保藏期评评价价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法石蜡油封藏法*沙土保藏法沙土保藏法冷冻干燥法冷冻干燥法低温低温低温低温低温、缺氧低温、缺
12、氧干燥、无营养干燥、无营养干燥、无氧、低干燥、无氧、低温、有保护剂温、有保护剂各大类各大类细菌、酵母菌细菌、酵母菌各大类各大类*产孢子微生物产孢子微生物各大类各大类3-63-6月月6-126-12月月1-21-2年年1-101-10年年5-155-15年年以上以上简便简便简便简便简便简便简便简便有效有效简便简便有效有效2.3.3国内外主要菌种保藏机构介绍国内外主要菌种保藏机构介绍菌种是一个国家的重要资源，世界各国都对菌种极为重视，设置了各种专专业业性性保保藏藏机机构构，主要的菌种保藏机构介绍如下：（1）ATCC American Type Culture Collection.Rockvil1
13、Maryland.U.S.A。美国标准菌种收藏所美国标准菌种收藏所，美国，马里兰洲，罗克维尔市。（2）CSH（Cold Spring Harbor Laboratory），U.S.A冷泉港研究室，美国。冷泉港研究室，美国。（3）IAM（Institute of Applied Microbiology），University of Tokyo，Japan。日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。（4）IFO（Institute for Fermentation），Osaka，Japan。发酵研究所，日本大阪。发酵研究所，日本大阪。（5）KCC（Kaken
14、 Chemical Company Ltd），Tokyo，Japan。科研化学有限公司，日本东京。科研化学有限公司，日本东京。（6）NCTC（National Collection of Type Cuure），），London United Kingdom，国立标准菌种收藏所，英国伦敦。国立标准菌种收藏所，英国伦敦。（7）NIH（National Institutes of Health），Bethesda，Maryland，U.S.A国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达。国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达。（8）NRRL（Northern Utilization Research
15、 and Developmcnt Division，U.S.Dpartment of Agriculture，Peoria，U.S.A。美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市。在我国为了推动菌种保臧事业的发展，1970年7月在国家科委和中国科学院主持下，召开了第一次全国菌种保藏工作会议，在会上成立了中中国国微微生生物物菌菌种种管管理理委委员员会会（CCCMS）委委托托中中国国科科学学院院负负责责担担负负全全国菌种保藏管理业务，下设六个菌种保藏管理中心。国菌种保藏管理业务，下设六个菌种保藏管理中心。l）普通微生物菌种保藏管理中心（）普通微生物
16、菌种保藏管理中心（CCGMC）；）；中中国国科科学学院院微微生生物物研研究究所所，北北京京（AS）：真真菌菌，细细菌。菌。中中国国科科学学院院武武汉汉病病毒毒研研究究所所，武武汉汉（ALIV）：病病毒。毒。2）农业微生物菌种保藏管理中心（）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）；）；中国农业科学院土壤肥料研究所，中国农业科学院土壤肥料研究所，3）工业微生物菌种保藏管理中心（）工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）；）；轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京。轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京。4）医学微生物菌种保藏管理中心（）医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）；）；中国医学科学院皮肤病研究
17、所，南京（中国医学科学院皮肤病研究所，南京（ID）真菌。真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。5）抗生素菌种保藏管理中心（）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）；）；中中国国医医学学科科学学院院抗抗生生素素研研究究所所，北北京京和和四四川川抗抗生生素素工工业研究所，成都：新抗生素菌种。业研究所，成都：新抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种6）兽医微生物菌种保藏管理中心（）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）；）；农业部兽医药品监察所，北京。农业部兽医药品监察所，北京。