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1、标准菌种的概念及其管理标准菌种是指由国家授权机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种。我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCMCCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCCCMCC）提供菌种的名称铜绿假单胞菌（）生孢梭菌（）大肠埃希菌（）金黄色葡萄球菌（）沙门菌（）枯草芽孢杆菌（）白色念珠菌（）黑曲霉（）微生物菌种的使用、保存与管理、验证。一.制定菌种使用保藏管理程序（1）做好菌种的来源登记，确保溯源性清楚.（2）菌种的接收与复活标准菌种的保藏形式 我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中，微生物通
2、常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。培养基的选择细菌一般用营养琼脂培养基，特别指出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基进行传代。真菌一般用改良马丁培养基。菌种的传代菌种的复苏菌种的确认菌种的接种菌种的保藏菌种的复苏中国药典2005版规定，所用标准菌种的传代次数不得超过5代。从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直至到第3代为工作菌种。严格控制菌种的传代避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作。1.复溶菌种并转种按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）2.鉴定菌种后制甘油冷冻管经菌种特
3、性鉴定后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，保存管（为第二代）同时挑取纯菌落接斜面，工作用菌种（为第三代）3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于试验4.取1支（第二代）冷冻保存管转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管（第三代）斜面养基适当温度培养后作为工作用菌种（第三代）5.将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。6.当工作用用菌种代数小于5时，可直接用上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三代）可直接转接第四代，直至四代转为五代。菌种保藏标签的规范与要求保藏标签的规范与要求菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏保藏标签必须规范、清晰，所有保藏
4、的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名称，系列号，传代次数，接种时间等。一旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必处理掉处理过程应记录。严格菌种的质量控制，确保菌种的质量菌种的质量对检验至关重要，对实验式储备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种进行纯度和属性确认外，还应对每一次传代都进行确认的质量控制系统。因为微生物菌种从上一代传到下一代时，很可能发生污染或变异，因此每次传代中至少要对菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验。菌种处理
5、的注意事项与有关记录菌种是特殊的标准品，在一定条件下，许多种类都是病原菌，这就要求处理菌种时有一些有别于其他标准品的特殊要求。1.根据菌株对人和动物的致病力、毒性流行传染的危害程度，要实行严密安全的保藏管理。2.所有的与菌种有关联的事情，例如菌种的接收、检查和保藏等都应有专门的微生物分析员处理和控制，建立进出账目，填写菌种纪录，纪录内容包括：菌种名称、编号、来源、形态特征、培养特性、生化检定、传代次数、最适培养基和培养条件、保藏方法、储存条件及保存库址等。3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安全防护措施规程，采取有效预防措施进行自我保护。4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处，其他部门的人员未
6、经允许不得进微生物实验室。所有的意外情况，都必须立即向主管部门报告以便得到及时解决。5相关记录在菌种的使用制备与保藏过程中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录格式。菌种的确认一.初步鉴定试验分离培养菌落形态革兰染色菌体染色特性及菌形生化试验检测细菌对各种基质的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌的种类二.全面鉴定血清分型毒素分析内毒素和外毒素基因分型蛋白组分析自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）铜绿假单胞菌形态特征：G-杆菌、直或微弯、较细长、散在排列、无芽胞、有荚膜、单端有13根鞭毛。培养特性：专性需氧，最适温度为35，但在42生长是铜绿假单胞菌的一个特点。营养无特殊要求，普通培养基上均能生长
7、，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成菌膜。分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基生化反应：氧化酶试验（）（培养物呈粉红色渐变为紫红色）绿脓菌素试验（）（盐酸溶液呈粉红色）铜绿假单胞菌琼脂平板的形态铜绿假单胞菌鞭毛染色形态生孢梭菌形态特征：G粗大芽胞杆菌、但在陈旧培养物中菌体革兰染色为阴性，芽胞正圆形或卵圆形，直径大于菌体，位于军体中央或近端，有周身鞭毛，能运动。培养特性：专性厌氧，但要求不严格。一般培养时不易形成芽孢，在普通营养琼脂培养基形成不规则菌落。在硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基上形成圆形、光
8、滑、湿润、不透明的菌落。在硫乙醇酸盐流体培养基中常在其表面形成菌膜。大肠埃希菌形态特征：G-直短杆状杆菌、无芽胞、有周身鞭毛，能运动。有菌毛。培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。分离培养：伊红美兰培养基（EMB平板）生化反应：IMViC试验结果：MUG试验结果：荧光：大肠埃希菌EMB平板菌落形态大肠埃希菌显微镜下菌体形态大肠埃希菌电镜下菌体形态金黄色葡萄球菌形态特征：G球菌、呈单个、成双、短链或排列呈葡萄串样，无鞭毛、芽胞。培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆
9、形、光滑、湿润、隆起、边缘整齐、不透明的菌落。菌落因种不同而出现不同的色素。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。分离培养：高盐甘露醇培养基生化反应：血浆凝固酶试验结果：金黄色葡萄球菌显微镜下菌体形态金黄色葡萄球菌电镜下菌体形态沙门菌形态特征：G-直杆菌、无芽胞、无荚膜、多具有周身鞭毛，能运动。有菌毛。培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上可生长，形成圆形、光滑、湿润、半透明、边缘整齐的菌落。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。分离培养：沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S)琼脂培养基生化反应：三糖铁琼脂反应：碱/酸，葡萄糖产 气，H2S阳性多价血清凝集试验：阳性沙门菌SS平板菌落形态沙门菌
10、显微镜下菌体形态沙门菌血清凝集试验结果枯草芽孢杆菌形态特征：G直杆菌、多呈链状排列，有鞭毛、有芽胞，位于菌体中心或次极端，不小于菌体。培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色菌落。在营养肉汤培养基中形成菌膜,很少混浊或不混浊。分离培养：营养琼脂平板血琼脂平板枯草芽孢杆琼脂平板的形态枯草芽孢杆显微镜下菌体形态真菌的初步鉴定试验标本直接检查显微镜检查真菌的分离培养.酵母型菌落：是单细胞真菌的菌落。形态与一般细菌菌落相似，但较大些，菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，有部分单细胞真菌可在培养基中形成假菌丝，
11、此菌落称为类酵母型菌落。.霉菌型菌落：是多细胞真菌的菌落。菌落成棉絮状、绒毛状、粉末状，并产生不同的色素。快速显色鉴别培养法：经3712d就能显示结果。如白色念珠菌呈绿色或蓝绿色菌落，黑曲霉呈白色丝状菌落，里面呈淡粉红色，一周后逐渐变成黑色。霉菌各种菌落形态白色念珠菌形态特征：G、圆形或卵圆形、着色不均匀、在玉米培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成灰白色、表面光滑、带有浓重酵母气味的典型的类酵母菌落。培养稍久，菌落增大。在改良马丁培养基中呈沉淀生长。分离培养：快速显色培养基白色念珠菌显色平板的形态白色念珠菌显微镜下菌体形态黑曲霉形态特征：单层和双层瓶梗、孢子头球
12、形放射状、褐至黑色、孢子梗无色至褐色。培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成菌落初为白色羊毛状，继而黑色或黑褐色，粗绒状。分离培养：快速显色培养基黑曲霉显微镜下菌体形态黑曲霉电镜下菌体形态菌种传代的工作环境、工具及其他器皿环境1、洁净工作室：环境洁净度10000级下的局部100级的单向流空气区域内，全过程必须无菌操作，防止微生物污染。2、无菌隔离舱工具1、接种环2、接种针3、接种铲4、接种钩5、酒精灯及其他玻璃器械培养所用器具1、玻璃器皿：如各种规格培养皿。2、微生物实验室常用的设备，如高压灭菌锅、恒温培养箱等菌种的接种操作步骤一.斜面接种法：1.从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟
13、。2.将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入接种室或超净工作台。打开紫外灯照射一小时。3.关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。4.右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。5.塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面
14、的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。6.取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。7.将已接种好的细菌管置3537细菌培养箱培养2224h，霉菌管置2328霉菌培养箱培养7天。二.穿刺接种法：用接种针取细菌少许，从培养基的中央垂直刺入，接近管底但不接触管底，然后接种针沿穿刺线原路退出。主要用于生孢梭菌的传代。三.液体接种法：用接种针取菌少许，在试管内壁与液面交界处的管壁上轻轻研磨，使菌混合于培养液中。黑曲霉接种方法：黑曲霉孢子悬液，可以保存在4环境，并应在一个月内尽快完成转种操作。转种操作应在
15、超净工作台（或相当此环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯，拧开瓶盖，用无菌吸管吹吸管内液体，取12滴滴在改良马丁琼脂斜面，用吸管涂布均匀，置2328培养57日，培养斜面形态可参照下图。如上图，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。转种完毕的冻存管和使用过的器具应经121湿热灭菌30分钟再作处理。菌种的保藏菌种的保藏 菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。一、菌种保藏的目的一、菌种保藏的目的n 菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、二、菌种保藏的原理二、菌
16、种保藏的原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株三、菌种保藏方法三、菌种保藏方法各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。斜面低温保藏法甘油冷冻管保藏法试管熔封（密封）保藏法石蜡油封藏法砂土管保藏法麸皮保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法（一）斜面低温保藏法
17、（一）斜面低温保藏法常用保藏常用保藏法法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续。此法适用于细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏短期保藏.此法的主要保藏措施是低温。一般可保存16个月左右。优点：简便易行、容易推广，适用于大多数微生物缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短；传代次数多；菌种容易发生变异和被污染。（二二）甘油冷冻管保藏法将待保藏菌种接种在适宜的斜面培养基上，适宜温度下培养适宜时间后，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使细菌充分扩散到预先装于试管中的
18、无菌蒸馏水中，调正菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管，向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装无菌小管，最好在-30条件下储存，一般可保存2年.（三）试管熔封（密封）保藏法熔封 用各种琼脂斜面（普通肉汤等）常规灭菌后，经接种，室温培养2448h后，将接种菌生长旺盛的试管用喷灯将其管口熔封，分别置室温和冰箱下保存。使用时，用砂轮在管口划一圈，在乙醇灯下火烟灭菌后敲开管口即可转接到另一斜面上。室温保存期可达3年，特别是适宜一些因培养物陈旧极易死亡的铜绿假单菌。密封 将需保存种菌按无菌操作要求接种至固体培养基塞紧棉塞，放
19、在干燥器内，干燥器密封处涂上凡士林，盖紧后使之与真空泵相连接。开动真空泵抽真空30min至1h（真空度约为640）关闭密封口，拨出胶塞，置于室温下保存。待用时，打开盖，取出种菌，接种至培养基上即可。（四）石蜡油封藏法（四）石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加硅胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4冰箱内保藏。此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存12年左右。（五）冷冻真空干燥保藏法（五）冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌
20、种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。n此法适用于各大类微生物。n此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达515年，存活率高，变异率低，是目前 被广泛采用的一种较理想的保藏方法。n该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设 备。（六）液氮超低温保藏法（六）液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（196）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从
21、常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。菌种的保藏条件及时间菌种培养基保存条件及时间大肠埃希菌营养琼脂培养基46保存23个月金黄色葡萄球菌营养琼脂培养基46保存23个月枯草芽孢杆营养琼脂培养基46保存36个月铜绿假单胞菌营养琼脂培养基室温沙门菌营养琼脂培养基46保
22、存23个月生孢梭菌硫乙醇酸盐培基46保存6个月以上白色念珠菌改良马丁培养基46保存46个月黑曲霉改良马丁培养基46保存4个月菌液的制备取铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中置3537细菌培养箱培养1824h；白色念珠菌的新鲜培养物少许接种至改良马丁培养基中置2328霉菌培养箱培养48h。黑曲霉的菌液制备：将黑曲霉的孢子接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，于2328霉菌培养箱培养57天，使大量的孢子产生。加入35ml的0.9%无菌氯化钠溶液，用无菌玻棒或接种环轻轻将孢子洗脱，然后，用
23、一支管口塞有无菌棉花的无菌球形毛细吸管吸出孢子菌液至无菌试管内，可用比浊法或玫瑰红钠琼脂培养基注皿（1ml），按规定条件培养后计数。菌液的稀释方法细菌的生长曲线细菌群体的生长繁殖可分为四期：一期：迟缓期（一期：迟缓期（lag phase）细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少。迟缓期长短因种类、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为14小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。二期：对数期二期：对数期(logarithmic phase)又称指数期(exponentia
24、lphage)。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。三期：稳定期（三期：稳定期（stationary phase）该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、H2O2等）积累ph下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物
25、如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽胞等。四期：衰亡期（四期：衰亡期（decline phase）随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。细菌的分离培养技术平板划线分离法一.连续划线分离法：此法用于含菌量少的菌液。先将培养物于平板1/5处密集涂布，然后来回做曲线连续划线接种，线于线之间有一定的距离，划满平板为止。二.分区划线分离法：此法用于含菌量多的菌液。先将培养物涂布于平板表面边缘第一区，约占平板1/5面积，再在二、三、区依次连续划线。每划完一个区，均将接种环灭菌一次。每一区的划线均接触上一区的接种线12次，使菌量逐渐减小，以获得单个菌落。细菌分离培养的直观图纯培养 所谓微生物的纯培养是指在一个微生物的菌落形成单位中，所有的微生物细胞或孢子都属于生物学的同一个种。严格地说，纯培养是在培养基上由一个细胞或孢子分裂、繁殖而产生的后代。在该细胞或孢子的生长过程种，不受其他微生物的侵犯，不会在培养物中产生另外微生物种的后代，在整个生长过程中不发生变异或死亡。