菌种的保藏课件.ppt

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1、关于菌种的保藏关于菌种的保藏现在学习的是第1页，共27页目录什么是菌种？菌种保藏意义、基本原理及策略菌种保藏意义、基本原理及策略菌种保藏方法菌种保藏方法（常见菌种举例）（常见菌种举例）（常见菌种举例）（常见菌种举例）菌种保藏注意事项及专业机构菌种保藏注意事项及专业机构现在学习的是第2页，共27页1.1菌种简介用于发酵过程作为活细胞催化剂的微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。来源于自然界大量的微生物，从中经分离并筛选出有用菌种，再加以改良，贮存待用于生产。现在学习的是第3页，共27页1.2菌种制备 也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备

2、过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。现在学习的是第4页，共27页 种子制备包括孢子制备和菌丝体制备（见上图），其中(1)(4)为孢子制备过程。保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25（或较高温度）下培养57天(或较长时间)。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子，对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基。将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于2528培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10以下，并放入 4冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。放线菌孢

3、子的培养基大多是采用麸皮或豌豆浸出液、牛肉膏及无机盐与琼脂制成的。将斜面孢子接入扩大的扁瓶孢子培养基中,于2837培养514天。所获得的大量孢子可直接作为种子罐(6)的种子。如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的,则可采用摇瓶（5）液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆等）,及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐(7)的种子应是生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮,无杂菌及异常菌体。接种量一般在1020。现在学习的是第5页，共27页2.1菌种保藏的目的及意

4、义菌种保藏的目的及意义目的目的 把微生物菌种资源在一定条件下保存，把微生物菌种资源在一定条件下保存，使其存活、不丢失、不污染杂菌、不发生或少发生使其存活、不丢失、不污染杂菌、不发生或少发生变异，保持菌株原有培养特性和生理活性。变异，保持菌株原有培养特性和生理活性。意义意义 菌种是国家的一种重要资源，保持优良菌种是国家的一种重要资源，保持优良菌种的优良性能，可保证高产稳产；在基础研究中，菌种的优良性能，可保证高产稳产；在基础研究中，菌种保藏可保证研究结果获得良好的重复性菌种保藏可保证研究结果获得良好的重复性现在学习的是第6页，共27页2.2法律规定2006年3月中华人民共和国农业部发布的食用菌菌

5、种管理办法规定：“农业部主管全国菌种工作。县级以上地方人民政府农业（食用菌，下同）行政主管部门负责本行政区域内的菌种管理工作。”“县级以上地方人民政府农业行政主管部门应当加强食用菌种质资源保护和良种选育、生产、更新、推广工作，鼓励选育、生产、经营相结合。”现在学习的是第7页，共27页2.32.3菌种保藏基本原理及策略菌种保藏基本原理及策略原理原理 采用物理或化学方法使微生物的生命活动采用物理或化学方法使微生物的生命活动处于半永久性的处于半永久性的休眠状态休眠状态，使微生物的新陈代谢，使微生物的新陈代谢作用限制在最低的范围内。作用限制在最低的范围内。菌体变异发生在细胞遗传物质的复制过程中。减少细

6、胞菌体变异发生在细胞遗传物质的复制过程中。减少细胞繁殖次数，可以避免变异的发生。繁殖次数，可以避免变异的发生。策略策略 有针对性的创造有针对性的创造干燥、低温和隔绝空气干燥、低温和隔绝空气的的环境条件，使微生物细胞代谢处于低水平或几乎环境条件，使微生物细胞代谢处于低水平或几乎停止，是微生物菌种保藏的基本策略。停止，是微生物菌种保藏的基本策略。现在学习的是第8页，共27页3.1保藏方法保藏方法暂时保藏法暂时保藏法长期保藏法长期保藏法斜面传代法斜面传代法穿刺法穿刺法液体石蜡法液体石蜡法 甘油管法甘油管法砂管保藏法砂管保藏法砂土管保藏法砂土管保藏法滤纸片保藏法滤纸片保藏法冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法

7、 液氮冷冻法液氮冷冻法 注意：由于微生物的多样性，注意：由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择保藏方法因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。件等进行综合考虑。现在学习的是第9页，共27页菌菌种种保保 藏藏方方 法法菌菌种种保保 藏藏方方 法法生活态生活态传代培养保藏法传代培养保藏法连续在培养基上（内）移种连续在培养基上（内）移种连续在活宿主上（内）移种连续在活宿主上（内）移种休眠态休眠态湿法湿法干法

8、干法固体斜面固体斜面半固体琼脂柱半固体琼脂柱液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）藏在玻璃管内藏在玻璃管内吸附在合适的载体上吸附在合适的载体上现在学习的是第10页，共27页3.2常见几种菌种保藏方法1、斜面传代保藏法斜面传代保藏法把菌种接种到所需要的斜面培养基上，最适温度下培养，把菌种接种到所需要的斜面培养基上，最适温度下培养，长出丰满的菌体细胞或孢子后，置于长出丰满的菌体细胞或孢子后，置于4的冰箱或冷库中的冰箱或冷库中保藏。然后每隔一定时间重新移接一次，传代保藏。移保藏。然后每隔一定时间重新移接一次，传代保藏。移种时间因菌种不同而异，几周到几个月不等。种时间因菌

9、种不同而异，几周到几个月不等。优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长，传代多，菌种容易变异。缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长，传代多，菌种容易变异。适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌现在学习的是第11页，共27页斜面传代保藏法斜面传代保藏法(附图附图)现在学习的是第12页，共27页2、矿油（液体石蜡）保藏法、矿油（液体石蜡）保藏法1938年发明。年发明。基本方法和原理：是在斜面培养或穿刺培养上加一层基本方法和原理：是在斜面培养或穿刺培养

10、上加一层液体石蜡，液体石蜡可以防止失水干燥，隔绝空气，液体石蜡，液体石蜡可以防止失水干燥，隔绝空气，降低菌种细胞代谢速率。此法适用于各类微生物，尤降低菌种细胞代谢速率。此法适用于各类微生物，尤其是不形成芽孢或孢子的真菌，保藏期限其是不形成芽孢或孢子的真菌，保藏期限2-10年。年。操作方法：操作方法：矿油灭菌；矿油灭菌；菌种培养；菌种培养；灌注矿灌注矿物油物油；低温（低温（5 左右）保藏左右）保藏 现在学习的是第13页，共27页3、砂管保藏法、砂管保藏法 把微生物附着在沙质载体上，置干燥处进行保藏，适合把微生物附着在沙质载体上，置干燥处进行保藏，适合于保藏放线菌、芽孢细菌和某些真菌。保藏时间可达

11、几于保藏放线菌、芽孢细菌和某些真菌。保藏时间可达几年到几十年。年到几十年。制备砂管制备砂管：河砂河砂60目过筛目过筛去杂质漂洗去杂质漂洗烘干分装烘干分装灭菌灭菌烘干。烘干。准备菌种：准备菌种：在合适培养基上培养获得孢子。在合适培养基上培养获得孢子。接种：接种：干法接种，直接将放线菌、真菌孢子接种于沙干法接种，直接将放线菌、真菌孢子接种于沙管中。湿法接种，先将斜面培养物制成菌悬液，吸取菌管中。湿法接种，先将斜面培养物制成菌悬液，吸取菌悬液于沙管中（每管约悬液于沙管中（每管约10滴）。滴）。干燥保藏：干燥保藏：将含菌沙管放在含干燥剂的干燥器中吸水干将含菌沙管放在含干燥剂的干燥器中吸水干燥。低温或室

12、温下干燥处保藏。燥。低温或室温下干燥处保藏。现在学习的是第14页，共27页4、冷冻真空干燥保藏法、冷冻真空干燥保藏法首先把加一定保护剂的菌悬液冷冻，然后在冷冻状首先把加一定保护剂的菌悬液冷冻，然后在冷冻状态下予以真空干燥，使微生物细胞处于半永久的休态下予以真空干燥，使微生物细胞处于半永久的休眠状态，从而达到长久保藏的状态。眠状态，从而达到长久保藏的状态。现在学习的是第15页，共27页冷冻真空干燥操作流程冷冻真空干燥操作流程配制保护剂配制保护剂灭菌灭菌菌种菌种培养培养制备菌悬液制备菌悬液分装安培瓶分装安培瓶洗净烘干洗净烘干装标签装标签加棉塞加棉塞预冻预冻真空干燥真空干燥测定水分测定水分熔封管口熔

13、封管口检查真空度检查真空度包藏包藏现在学习的是第16页，共27页5、液氮冷冻保藏技术、液氮冷冻保藏技术 1、选选择择冷冷冻冻保保护护剂剂，最最常常用用的的冷冷冻冻保保护护剂剂是是二二甲甲亚亚砜砜和和甘甘油油，最终使用浓度一般为甘油最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜、二甲亚砜5。2、制备待冷冻保藏菌种悬液，制成孢子及菌体细胞悬液；、制备待冷冻保藏菌种悬液，制成孢子及菌体细胞悬液；0.5lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。3、玻璃安瓿用酒精喷灯封口。、玻璃安瓿用酒精喷灯封口。4、以、以1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上的致冷速度降温，直到

14、温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点几度的细胞冻结点(通常为通常为-30)5、将安瓿迅速移入液氮罐中于液相、将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96)或或 气相气相(-156)中保存。中保存。6、复苏：、复苏：迅速将安瓿置于迅速将安瓿置于37-40水浴中，并轻轻摇动以加速解；水浴中，并轻轻摇动以加速解；现在学习的是第17页，共27页其他保藏方法其他保藏方法冷冻法：冷冻法：分低温冷冻（分低温冷冻（20）与超低温冷冻）与超低温冷冻（196）两种。适用于细菌、真菌、病毒等）两种。适用于细菌、真菌、病毒等的保藏的保藏液态真空干燥法：液态真空干燥法：菌体在恒温液态条件下进行菌体在恒温液态条件下进行真空干燥

15、。适用于包括细菌、病毒，特别适真空干燥。适用于包括细菌、病毒，特别适用于冷冻干燥保藏效果不佳的菌种。用于冷冻干燥保藏效果不佳的菌种。琼脂穿刺封口保藏法：琼脂穿刺封口保藏法：适用于适用于不产孢子不产孢子细菌的细菌的保藏保藏现在学习的是第18页，共27页曲法保藏：曲法保藏：将麸皮与水按比例混合，灭菌后接入菌种，将麸皮与水按比例混合，灭菌后接入菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管放入盛有氯化钙的干燥待孢子长成后即为成曲。将试管放入盛有氯化钙的干燥器中，干燥后低温保藏。器中，干燥后低温保藏。适用于有大量孢子的霉菌和适用于有大量孢子的霉菌和某些放线菌的保藏。某些放线菌的保藏。麦粒保藏法：麦粒保藏法：麦粒灭

16、菌后接入菌液，培养有菌丝或孢麦粒灭菌后接入菌液，培养有菌丝或孢子时，置通风、避光、干燥处保藏。子时，置通风、避光、干燥处保藏。适用于一些放线适用于一些放线菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。无水硅胶保藏法：无水硅胶保藏法：将细胞悬浮液和等体积的脱脂灭将细胞悬浮液和等体积的脱脂灭菌牛奶混匀，加入装有无水硅胶的试管中，然后将菌牛奶混匀，加入装有无水硅胶的试管中，然后将试管放于干燥器内，室温或试管放于干燥器内，室温或4 保藏。保藏。对于细菌和真对于细菌和真菌效果都较好。菌效果都较好。现在学习的是第19页，共27页3.3细菌的保藏细菌的保藏保藏方法保藏方法适合菌种适合菌种定期移植保藏法

17、定期移植保藏法固固氮氮菌菌属属 芽芽孢孢杆杆菌菌属属 棒棒状状杆杆菌菌属属 欧欧文文氏氏菌菌属属 黄黄杆杆菌菌属属 微微球菌属球菌属 分枝杆菌属分枝杆菌属 假单孢杆菌属假单孢杆菌属 根瘤菌属根瘤菌属 埃希氏杆菌属埃希氏杆菌属液体石蜡保藏法液体石蜡保藏法无无色色细细菌菌属属 气气单单孢孢菌菌属属 芽芽孢孢杆杆菌菌属属 纤纤维维单单孢孢菌菌属属 色色杆杆菌菌属属 埃埃希希氏氏杆杆菌菌属属 克克雷雷伯伯氏氏菌菌属属 微微球球菌菌属属 丙丙酸酸杆杆菌菌属属 链链球球菌菌属属 变形杆菌属变形杆菌属 根瘤菌属根瘤菌属 弧菌属弧菌属冻结保藏法冻结保藏法醋醋酸酸杆杆菌菌属属 无无色色细细菌菌属属 色色杆杆菌菌

18、属属 纤纤维维粘粘菌菌属属 芽芽孢孢杆杆菌菌属属 链球菌菌属链球菌菌属 发光杆菌属发光杆菌属 变形杆菌属变形杆菌属 假单孢杆菌属假单孢杆菌属冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法醋醋酸酸杆杆菌菌属属 节节杆杆菌菌属属 短短杆杆菌菌属属 芽芽孢孢杆杆菌菌属属 链链球球菌菌菌菌属属 棒棒状状杆杆菌菌属属 柄柄细细菌菌属属 乳乳杆杆菌菌属属 分分枝枝杆杆菌菌属属 变变形形杆杆菌菌属属 假假单孢杆菌属单孢杆菌属 欧文氏菌属欧文氏菌属 纤维单孢菌属纤维单孢菌属干燥保藏法干燥保藏法产芽孢细属产芽孢细属液氮保藏法液氮保藏法大多数细菌大多数细菌现在学习的是第20页，共27页3.4放线菌菌种的保藏放线菌菌种的保藏放线菌菌

19、种的长期保藏以保藏放线菌的分生孢子放线菌菌种的长期保藏以保藏放线菌的分生孢子为主要方式。为主要方式。保藏方法主要有：保藏方法主要有：沙土管法、冷冻干燥法、液氮冷冻法沙土管法、冷冻干燥法、液氮冷冻法沙土管法、冷冻干燥法、液氮冷冻法沙土管法、冷冻干燥法、液氮冷冻法现在学习的是第21页，共27页几种常用菌种保藏方法的比较几种常用菌种保藏方法的比较方法名称方法名称主要措施主要措施适宜菌种适宜菌种保藏期保藏期评评价价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法石蜡油封藏法*沙土保藏法沙土保藏法冷冻干燥法冷冻干燥法低温低温低温低温低温、缺氧低温、缺氧干燥、无营养

20、干燥、无营养干燥、无氧、低干燥、无氧、低温、有保护剂温、有保护剂各大类各大类细菌、酵母菌细菌、酵母菌各大类各大类*产孢子微生物产孢子微生物各大类各大类36月月612月月12年年110年年515年年以上以上简便简便简便简便简便简便简便简便有效有效简便简便有效有效现在学习的是第22页，共27页几种菌种（附图）现在学习的是第23页，共27页4.14.1菌菌菌种保藏注意事项及专业机构菌种保藏注意事项及专业机构注意事项:1 1）经长期保藏后菌种存活健在。）经长期保藏后菌种存活健在。2 2）保证高产突变株不改变现型和基因型，）保证高产突变株不改变现型和基因型，特别是不可改变初级代谢和次级产物 生产的高产能

21、力。生产的高产能力。3 3、保藏方法经济简便。、保藏方法经济简便。现在学习的是第24页，共27页4.2 4.2 保藏机构保藏机构国际重要菌种保藏机构国际重要菌种保藏机构缩写缩写名称名称ATCC美国标准菌种保藏所，马里兰州，罗克维尔市美国标准菌种保藏所，马里兰州，罗克维尔市CBS真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市NCTC国立标准菌种保藏所，英国，伦敦国立标准菌种保藏所，英国，伦敦CCGMC中科院微生物所普通微生物菌种保藏管理中心中科院微生物所普通微生物菌种保藏管理中心CCTCC武汉大学中国典型培养物保藏中心武汉大学中国典型培养物保藏中心ARS美国农业部农业研究服务部美国

22、农业部农业研究服务部现在学习的是第25页，共27页中国一般保藏机构中国一般保藏机构l l）普通微生物菌种保臧管理中心（）普通微生物菌种保臧管理中心（）普通微生物菌种保臧管理中心（）普通微生物菌种保臧管理中心（CCGMCCCGMC）；）；）；）；中国科学院微生物研究所，北京（中国科学院微生物研究所，北京（中国科学院微生物研究所，北京（中国科学院微生物研究所，北京（ASAS）：真菌，细菌。）：真菌，细菌。）：真菌，细菌。）：真菌，细菌。中国科学院武汉病毒研究所，武汉（中国科学院武汉病毒研究所，武汉（中国科学院武汉病毒研究所，武汉（中国科学院武汉病毒研究所，武汉（ALALIVIV）：病毒。）：病毒。

23、）：病毒。）：病毒。2 2）农业微生物菌种保藏管理中心（）农业微生物菌种保藏管理中心（）农业微生物菌种保藏管理中心（）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCCACCC）；）；）；）；中国农业科学院土壤肥料研究所，中国农业科学院土壤肥料研究所，中国农业科学院土壤肥料研究所，中国农业科学院土壤肥料研究所，3 3）工业微生物菌种保臧管理中心（）工业微生物菌种保臧管理中心（）工业微生物菌种保臧管理中心（）工业微生物菌种保臧管理中心（CICCCICC）；）；）；）；轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京。轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京。轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京。轻工业部食品发酵工业科学研究所

24、，北京。4 4）医学微生物菌种保臧管理中心（）医学微生物菌种保臧管理中心（）医学微生物菌种保臧管理中心（）医学微生物菌种保臧管理中心（CMCCCMCC）；）；）；）；中国医学科学院皮肤病研究所，南京（中国医学科学院皮肤病研究所，南京（中国医学科学院皮肤病研究所，南京（中国医学科学院皮肤病研究所，南京（IDID）真菌。真菌。真菌。真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒

25、。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。现在学习的是第26页，共27页5 5）医学微生物菌种保臧管理中心（）医学微生物菌种保臧管理中心（）医学微生物菌种保臧管理中心（）医学微生物菌种保臧管理中心（CMCCCMCC）；）；）；）；中国医学科学院皮肤病研究所，南京（中国医学科学院皮肤病研究所，南京（中国医学科学院皮肤病研究所，南京（中国医学科学院皮肤病研究所，南京（IDID）真菌。真菌。真菌。真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。中国医学科学

26、院病毒研究所，北京：病毒。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。6 6）抗生素菌种保藏管理中心（）抗生素菌种保藏管理中心（）抗生素菌种保藏管理中心（）抗生素菌种保藏管理中心（CACCCACC）；）；）；）；中中中中圈圈圈圈医医医医学学学学科科科科学学学学院院院院抗抗抗抗生生生生素素素素研研研研究究究究所所所所，北北北北京京京京和和和和四四四四川川川川抗抗抗抗生生生生素素素素工工工工业业业业研研研研究究究究所所所所，成成成成都都都都：新抗生素菌种。新抗生素菌种。新抗生素菌种。新抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种7 7）兽医微生物菌种保藏管理中心（）兽医微生物菌种保藏管理中心（）兽医微生物菌种保藏管理中心（）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCCCVCC）；）；）；）；农业部兽医药品监察所，北京。农业部兽医药品监察所，北京。农业部兽医药品监察所，北京。农业部兽医药品监察所，北京。现在学习的是第27页，共27页