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1、医学微生物学试验报告一、试验题目：脓汁和粪便标本中病原菌的检测二、试验目的：1、了解细菌生长的根本养分条件。生疏培育基的种类。把握培育基制备的原则和一般方法。了解理化因素对细菌的影响。把握常用的消毒灭菌法和无菌操作技术。2、把握病原菌的分别与培育方法。了解并比较细菌在固体、半固体及液体培育基上的生长特征。3、把握油镜的正确使用、细菌涂片标本的制备。把握革兰氏染色法。生疏细菌的根本形 态。了解细菌的特别构造。生疏几种常用的细菌生化反响的名称、原理、方法、结果分析及用途。把握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。把握玻片凝集试验的原理、方法、结果观看与推断。生疏药物敏感性试验方法的种类、原理及应用。把
2、握纸片集中法。三、试验器材接种环，接种针，酒精灯，脓汁标本1 支，粪便标本 1 支，碘酒棉球 1 瓶，酒精棉球 1瓶，眼科镊子 2 把，伊红美兰平板，养分琼脂平板；斜面培育培育基，养分肉汤，生理盐水， 镜油瓶、拭镜纸1 套，吸水纸1 本，载玻片4 张，半固体琼脂培育基，糖发酵管1 套，抗菌素纸片 1 套，药敏试验培育物 4 个四、方法与步骤4.1 试验原理（1） 、培育基制备：用人工方法将微生物生长生殖所需要的多种养分物质，按比例混合配制而成的养分制品，其主要用途是分别培育纯种微生物，传代或保存微生物，鉴别微生物的 种属，争辩微生物的生理及生化特性。（2） 、细菌的分别与培育：细菌学检验，特别
3、是细菌培育必需是无菌操作。细菌的接种技术主要有：平板划线分别法，斜面、液体或半固体培育基接种法。为避开在接种过程中污染环境和空气中的细菌污染培育物，要求在酒精灯旁进展细菌接种。承受一般培育法即需氧培育法，将已接种好的培育基置于37恒温箱中培育 1824 小时，一般细菌即可在培育基中生长生殖。（3） 、半固体培育基接种法(穿刺接种法)：不同的细菌生长在肯定的培育基上往往有不同的特征，因此，培育特征可以作为细菌分类鉴定的重要依据。（4） 、细菌个体形态特征的观看：细菌是一类具有细胞壁的单细胞微生物，在肯定环境下 有相对恒定的形态构造。尽管细菌菌落肉眼可见，但要观看单个细菌细胞，必需借助光学显 微镜
4、将其放大 9001000 倍在微生物学中主要使用的是油镜。油镜是由于在使用时需要香柏油作介质而得名。细菌菌体在强光下呈透亮或半透亮，其折光系数与玻璃片相像，在光学显 微镜下难以看清楚，所以，必需将细菌制成涂片，固定后，用化学染料使菌体着色，从而和四周背景产生鲜亮比照，才能观看到细菌的形态与构造。复染法，即鉴别染色法，是用两种 或两种以上染料，可将细菌染成不同的颜色，用于帮助鉴别细菌。常用的复染法有革兰氏染 色法和抗酸染色法。革兰氏染色法将细菌分成两大类：革兰阳性(G+)菌和革兰阴性(G-)菌。（5） 、细菌生化反响鉴定：血浆凝固酶试验：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝
5、剂的人或兔等动物血浆发生凝固，凝固的血浆沉积于菌体外表，阻 碍吞噬细胞的吞噬，或即使被吞噬，血浆凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。 糖发酵试验：单糖发酵微量管是只含有一种糖(如葡萄糖、乳糖)的 pH7.6 的蛋白胨水，并参加肯定量的指示剂。接种细菌经培育后，假设该菌具有分解该糖的酶，有酸产生时就能使指示剂变色。如指示剂为酸性复红pH4.2(红色)6.2(黄色)，则变成红色；溴甲酚紫pH5.2(黄色)6.8(紫色)则呈黄色。假设有气体产生，则微量管内集聚气泡。（6） 、细菌血清学鉴定：血清学反响是指抗原抗体在体外的特异性结合反响，可用抗 原检测未知抗体或用抗体检测未知抗原。常见的有凝集反
6、响、沉淀反响、补体结合反响 和中和反响等。血清学反响常用于传染病的诊断和微生物菌株的鉴定。将的抗体(诊断 血清)直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌)混合，在有适当电解质存在条件下，如两者对应 便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物消灭，即 为阴性，称为直接凝集反响，属定性试验，有玻片法和试管法两种，主要用于检测抗原，如菌种的鉴定与分型、ABO 血型鉴定等。（7） 、细菌药物敏感性试验：纸片集中法：是利用抗生素在琼脂培育基的集中渗透作用， 将含浓度的药物滤纸片贴于含有敏感性试验菌的琼脂培育基外表，抗生素就自纸片向平板四周集中渗透，在抑菌浓度所达范围内敏感菌的生长
7、被抑制而消灭抑菌圈，通过比较抗生 素浓度与抑菌圈的大小以测定抗生素的抑菌浓度。4.2 试验步骤（1） 培育基制备的一般程序：调配溶化 矫正 pH 分装灭菌检定保存。干粉培育基蒸馏水加热溶化分装灭菌检定保存。（2） 、细菌的分别与培育：细菌的分别：烧灼灭菌接种环分别取脓汁标本与粪便标本点在一般平板和依红美蓝平板上，各做两份烧灼接种环上的多余的标本在平板上划曲线移动平板依次划五区：从原 涂抹局部开头，连续平行划线，每次只划平板的 1/41/5，划毕后接种环再经火焰灭菌， 冷却后用同样方法在平板其余局部划线，每次划线要与前次划线重叠 13 条，共计 34 次(区)接种环烧灼灭菌平板倒置，做好标记37
8、培育 18-24 小时备用。细菌纯培育：先观看上述试验中平板分别出来的菌落接种环烧灼灭菌选择平板上典 型的四种单菌落白色、黄色、紫黑色、粉红色进展斜面接种纯培育，并做好标记接种环烧灼灭菌培育不得超过 18 小时保存备用。液体培育基接种：接种环烧灼灭菌分别取斜面培育试验中培育得到的四种菌苔适量接种到液体培育基中接种环烧灼灭菌35培育 4-6 小时，备用。半固体培育基接种法(穿刺接种法)：右手握接种针，灭菌冷却后，挑取菌苔少许，垂直刺入半固体琼脂培育基的中心，可刺达近管底处，但不要达于管底，然后沿原路退出接种完毕，试管口快速通过火焰 23 次灭菌，塞好棉塞。接种针烧灼前方可放下斜面培育基管置于 3
9、7培育过夜。（4） 、细菌个体形态特征的观看：观看细菌在固体培育基上生长特征平板菌落特征细菌在琼脂平板上培育肯定时间后，形成菌落。各种细菌菌落都有肯定的特点， 表现在以下几方面： 大小：大(直径约 3mm 以上)，中(直径约 13mm)，小(直径约 1mm 以下)。 外形：圆形，卵圆形、假根形、丝状、不规章等。 边缘：整齐，锯齿状，波浪状，羽毛状。 外表：隆起、平坦、中心凸起、脐形凹陷；光滑或粗糙、潮湿或枯燥。 溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落四周呈草绿色、不透亮)，溶血(菌落四周消灭透亮环) 色素：一般为无色或灰白色，特别色素有两类：脂溶性色素(菌落本身着色，培育基不着色)和水溶性色素(菌落
10、及培育基均着色)。斜面菌苔的特征：不同的细菌在斜面培育基上生长，往往也具有肯定的特征，表现在生长量、菌苔外形(如线状、念珠状、假根状、薄膜状等)、外表外形、光泽、透亮度、颜色等方面。细菌在液体培育基中生长特征的观看细菌在液体培育基中生长可消灭肉眼可见的各种特征，如培育液浑浊或澄清，消灭形态不一 (如絮状、块状等)的沉淀，或在培育基外表形成菌膜(薄膜、厚膜或仅沿管壁产生一圈菌膜即菌环等)。细菌在半固体培育基上生长特征的观看不同的细菌经半固体培育基穿刺接种后生长状况不同。能运动的细菌，往往沿穿刺线集中生 长(即有动力)，而使穿刺线四周消灭模糊或混浊；不能运动的细菌仅沿穿刺线生长；严格好氧菌仅外表生
11、长，兼性厌氧菌沿整个穿刺线生长。（5） 、细菌生化反响鉴定：细菌涂片制备：取干净的载玻片一张，用在火焰上烧过的接种环取生理盐水12 环于玻片上。接种环灭菌后，挑取细菌培育物少许与盐水轻轻磨匀，涂抹成直径 1 厘米大小的均匀薄膜。临床标本如脓汁、痰、分泌物等可直接涂片枯燥：涂片最好在室温中自然枯燥，必要时可将涂片膜面对上，留神连续地在弱火高处略烘，以助水分蒸发，但切勿紧靠火焰，以 免涂膜烤枯，染色后难以检查革兰染色法步骤：固定：手持玻片的一端，标本面朝上，在火焰外层快速地来回通过2 3 次，共约 23 秒，使标本固定，即可进展染色初染：在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液 12 滴，经 1 分钟后
12、用细流水缓缓冲洗，并倾去玻片上余水媒染：加芦戈氏碘液12 滴，经 1 分钟后用细流水缓缓冲洗，并倾去玻片上余水。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，不易脱落脱色：滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟， 使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色 或稍淡紫色为止(约需 2030 秒)，马上用细流水将酒精冲掉，并倾去玻片上余水复染： 加稀释复红 12 滴，经30 秒1 分钟后用细流水缓缓冲洗，并倾去玻片上余水。标本凉干后，滴加香柏油，用油镜观看，革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。糖酵解试验。用接种针分别挑少许紫黑和粉红色的细菌接种到葡
13、萄糖发酵管和乳糖发酵管中。将微量管平放在平皿盖内，在37下，培育 24 小时，观看其产酸产气状况。五血浆凝固酶试验：取干净玻片一块，用计号笔将玻片分为两格，其中一格加兔血浆1 2 滴，另一格加生理盐水1 滴将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌冷却后，取细菌颖培育物少许，在生理盐水中研磨混匀成细菌悬液用灭菌接种环取细菌悬液1 环，或挑取细菌培养物少许，在兔血浆中轻轻磨匀稍待片刻，观看结果结果推断：先观看生理盐水比照， 应呈均匀混浊现象。再观看细菌与兔血浆混合物，假设有凝块消灭，则为阳性；无凝块消灭为 阴性。（6） 、细菌血清学鉴定：血浆凝固酶试验。：取二滴兔血浆置于干净的玻片上接种环烧灼灭菌分别用接种
14、环取斜面纯化培育所得到的白色和黄色菌苔与血浆研磨混合边混匀边观看结果接种环烧灼 灭菌观看结果。玻片凝集试验：取干净的载玻片一张，将磨面近端设为比照区，滴加生理盐水15ul。远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul用接种环分别取粉红色菌苔，约12 个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀如上述混合悬液由均匀混浊变为澄清透亮，并 消灭大小不等的乳白色凝集块者即为阳性；如混合物仍呈均匀混浊则为阴性者，可认为阴性。（7） 、细菌药物敏感性试验：接种环分别取菌液2 环，各拘束四个平板上，作平板密集划线接种细菌纱窗样。设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作 标记：青、链、庆
15、。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压， 最终镊子火焰灭菌。371824 小时培育，观看结果。五、结果与争辩（1） 细菌分别培育特点：图一 脓汁标本分别培育消灭黄色和白色两种菌落 图二 粪便标本分别培育的紫黑色和粉红色菌落（2） 斜面培育基接种培育结果图三 粉红色菌落斜面接种结果图四 紫黑色菌落斜面接种结果（3） 、.革兰氏染色后显微镜下的镜检结果：图五 粪便标本革兰染色法涂片镜检图六 脓汁标本革兰染色法涂片镜检镜检结果：标本脓汁标本菌落颜色黄色粪便标本白色紫黑色带金属光泽粉红色半透亮形态 革兰阳性球菌,排列不规章，呈葡萄串状结果 典型的葡萄球菌；结合菌落颜色，黄色的是
16、金黄色葡萄球菌，白色的是白色葡萄球菌革兰阴性杆菌，散在排列从形态上不能鉴别是什么细菌表一 革兰染色法镜检结果(4)、细菌生化反响和血清学鉴定结果图七 血浆凝固酶试验图八 玻片凝固剂试验试验血浆凝固酶试验玻片凝集试验种类白色球菌左 黄色球菌右+兔+兔血清血清粉红色杆菌+生理盐水左粉红色杆菌+福氏志贺菌诊断血清右结果白色球菌与兔血清少量凝集+粉红色菌落的杆菌与生理盐水无反响黄色球菌与兔血清凝集现象较明显， -，但与福氏志贺菌诊断血清凝集有明显白色凝集物+表二 血浆凝固酶和玻片凝集试验结果图九 糖酵解试验，从左至右依次：紫黑色菌苔葡萄糖发酵及乳糖发酵，粉红色菌苔葡萄糖发酵及乳糖发酵图十 纸片集中法
17、从左往右：金黄色、白色、紫黑色、粉红色菌与青霉素、庆大霉素、头孢曲松药敏结果图十一 紫黑色菌落菌半固体穿刺试验图十二 粉红色菌半固体穿刺试验标本菌落形态血浆固酶葡萄糖发酵乳糖发酵半固体福痢血清青霉素链霉素庆大霉素结论脓汁标本黄色G+球菌+金黄色葡萄球菌白色G+球菌-+白色 葡萄球菌粪便标本紫黑G-杆菌+-+大肠埃希菌粉红G-杆菌-+-+福氏志贺菌表三结果汇总（5） 、试验争辩试验比较成功，结果符合客观事实。但在平板划线法涂布菌液时用力过猛划破培育基，且一 区所占面积较大影响了五区，导致最终培育出来的单菌落较少。以后试验要娴熟平板划线法。用油镜（6） 留意事项1、在革兰染色的操作当中，所取得菌量
18、不能太多，假设取得太多的菌量会在镜检时看到细菌与细菌之间重叠，分布过于密集，经常会导致假阳性的消灭。另外，革兰氏染色的关键在于严格把握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。因此应当要操作快速，把握在30 秒以内。此外，染色时通常会用颖的细菌培育物，由于菌龄会影响染色结果，如阳性菌培育时间过长，或已死亡及局部菌自 行溶解了，都常呈阴性反响。2、在糖发酵试验当中，存放的时间不应过长，否则会使产气的微量发酵管的气体排出，导致所看到的现象不准确。3、在操作动力试验的过程中，接种针应当要顺着原路退出，假设此过程中接种针左右摇摆了，会消灭本没有鞭毛的细菌
19、经培育呈现一片浑浊，难以推断是操作有误还是细菌的运动所致。4、试验的各个环节都要严格进展无菌操作假设无菌操作不严格，会产生杂菌影响试验结果。每次取菌(或接种)前后，均须烧灼接种工具，接种完毕，不能直接将接种环在火焰中烧灼， 以免环上的细菌或标本因受高热爆烈四溅，应先将细菌或标本烤干后再烧灼。不要划破琼脂 外表。5、留意无菌操作，防止空气中微生物掉入平板中造成污染。可将平皿盖翻开放在试验台上， 再行划线接种。6、取送显微镜时动作要轻，一只手持镜臂，一只手托镜座，防止反光镜、目镜、物镜等脱 落损坏。勿将镜臂弯曲，由于微生物学试验经常使用油镜，假设载物台倾斜，镜油易流淌外溢， 影响观看或造成污染。使
20、用油镜时，肯定要等标本干后才能滴加香柏油，滴油时应避开气泡 形成。调焦时要特别慎重，切忌承受眼睛对着目镜边观看边下降镜筒的错误操作，以免物镜 与玻片相撞，损坏镜头和压破标本。油镜用完后肯定要擦洗，以防油干影响其使用寿命。使 用油镜时，须加香柏油的原理(见图 7)是：油镜的透镜孔很小，自标本玻片透过的光线，涂片不行过厚，肯定要涂成薄膜。涂片必需留意轻轻操作，假设动作过猛，可能会产生气溶胶， 造成飞沫传染。7、固定要适当，温度不宜过高，否则可能使细胞形态转变。革兰氏染色时，关键环节是脱色。假设脱色不够，革兰氏阴性菌可被染成阳性菌；脱色过度，革兰氏阳性菌可被脱色而误认为是革兰氏阴性菌。8、糖酵解试验观看结果时，应先观看是否产气，切勿将微量管直立，以免气体溢出。兔血浆和细菌培育物要适量，以免枯燥，难以观看结果。9、诊断血清和细菌培育物比例要适量，以免枯燥，来不及观看结果。每一菌株应同时作生理盐水比照，防止误将细菌自凝现象认为凝集反响。购取抗生素滤纸片因产地不同，纸片含 药量也可能不同，因此在推断结果时应留意参照标准。10、药敏试验结果的读取应首先测量质控菌株的抑菌环直径，如在允许范围内，被检菌结果才可信。