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1、微生物试验微生物试验细菌形态观看细菌分布消毒灭菌微生物试验报告细菌形态观看一、试验目的1. 把握光学显微镜油镜的使用及日常维护2. 把握细菌的三种形态3. 把握临床常见细菌的形态及染色4. 把握细菌的特别构造5. 了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的构造特点二、试验原理1. 一般光学显微镜油镜的使用1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头2. 从侧面观看并渐渐转动粗调整器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停顿转动，以免碰撞玻片，用双眼观看目镜，同时调整细调整器，直至细菌清楚3. 依据需要调整显微镜亮度2. 一般光学显微镜的维护1. 移动显微镜时，用右手持镜壁，左手
2、托镜座，平端于胸前2. 油镜用毕后， 要马上用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最终，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头3. 镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内4. 做好使用记录3. 微生物学问1. 细菌按形态分类：球菌：球形包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等 杆菌：杆状包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等 螺旋菌：螺旋状包括螺旋菌、弧菌等2. 细菌的根本构造细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体3. 细菌的特别构造荚膜：如肺炎双球菌鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。如：变形杆菌为周毛菌菌毛芽胞：如破伤风梭
3、菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌4. 微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体真核类：真菌、原生动物、显微藻类非细胞类：病毒、亚病毒5. 真菌单细胞：圆形、芽生孢子。如：酵母菌2多细胞：菌丝及孢子、孢子出芽。如：霉菌6. 白假私酵母菌白念生物学性状：G+单细胞真菌、芽生孢子、类酵母型菌落厚膜孢子、假菌丝有助于鉴定致病性：皮肤粘膜鹅口疮、 内脏感染、CNS 感染微生物学检查：直接涂片、染色后镜检菌体、芽生孢子、假菌丝7. 型隐球菌生物学性状 ：圆形酵母型菌、外周有厚荚膜比菌体大1-3 倍致病性：吸入后侵害皮肤、
4、粘膜等慢性炎症和脓肿；侵袭CNS亚急性或慢性脑膜炎微生物学检查：脑脊液离心后取沉淀、痰和脓标本直接检查；墨汁负染见出芽菌体外围有宽厚荚膜为阳性三、试验材料记号笔：1 支；大镊子：1 支；火柴： 1 盒；蜡笔：1 支；试管架： 1 个；酒精灯：1 个； 接种环： 1 支；Olympus 显微镜：1 台；显微镜使用记录本：1 个四、试验内容1. 观看细菌三种形态1） 球菌链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌子弹形、脑膜炎双球菌蚕豆形、四联菌2） 杆菌破伤风杆菌、白喉杆菌异染颗粒、绿脓杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌3） 螺形菌弧菌霍乱弧菌；螺菌；螺杆菌幽门螺杆菌；弯曲菌2. 观看细菌的特别构造芽胞、鞭毛、荚膜、异
5、染颗粒、钩端螺旋体、幽门螺杆菌3. 绘图葡萄球菌(staphyloccocus)；肺炎双球菌(pneumo coccus)；脑膜炎球菌(meningococcus)；破伤风杆菌Clostridium Tantenus；霍乱弧菌vibrio cholera)；芽胞(spore)；鞭毛flagellum)；荚膜(capsule)；钩端螺旋体(leptospira)五、试验结果绘 8 幅细菌镜以下图，已交。六、思考与争辩1. 显微镜高倍镜使用时看不清楚的常见缘由（1） 未滴加镜油（2） 镜头不干净（3） 标本放置反了，所以达不到对焦平面（4） 制片问题：标本太厚、染色误差等细菌分布一、试验目的1.
6、把握固体培育基的制备2. 把握机体常见部位及环境中的细菌采样、培育、及初步鉴定3. 把握革兰氏染色方法及结果判定二、试验原理1. 培育基：1. 细菌生长所需养分物质：水、碳源、氮源、无机物和生长因子2. 培育基分类：（1） 依据养分物质：养分培育基、选择培育基、鉴别培育基（2） 依据物理性质：液体培育基、固体培育基和半固体培育基3. 细菌在培育基中的生长状况：外表生长、均匀浑浊生长、沉淀生长2. 革兰氏染色：革兰阳性细菌细胞壁的肽聚糖(peptidoglycan)层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，通道弯曲，结晶紫与碘的复合物保存在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，
7、脂肪含量高，经乙醇处理后孔径仍可使结晶紫与碘的复合物通过，因而将染料洗去而被脱色。三、试验材料咽拭子、羊血培育皿：1 套/人；大号一般培育皿：1 块/2 人；载玻片：1 片/人； A、B 菌： 6 套/桌；NS：1 份/人；滤纸：1 张/人；消毒液：4 套/桌；三角瓶、电天平、养分琼脂、称药纸、称药勺、量筒：1 套/桌四、试验内容1. 培育基制备 1按产品要求称取养分琼脂2每试验桌制备 200ml3） 高压蒸汽灭菌后，在干净工作台内倒平皿4） 所制备的一般平皿用于空气培育2. 机体不同部位的细菌采样、培育1） 咽部正常菌群的采样、培育咽拭子擦拭咽部，平行划线法接种于羊血平皿。2） 手指消毒前后
8、细菌的采样培育未消毒手指平行划线法接种于一般平皿；同一手指碘酒、酒精消毒后平行划线法接种于一般平皿。3. 环境中细菌采样培育1） 空气培育将培育皿翻开暴露于空气中，20 分钟后盖好平皿盖儿2） 流通纸币或硬币的细菌采样培育将硬币正反面分别在培育基上充分接触3） 采样完毕后，将培育皿底部朝上放入铁丝筐，统一置培育箱：37 18-24 小时4. A、B、C 菌鉴定革兰氏染色法1. 细菌涂片制备程序：（1） 取一干净玻片，火焰上方缓缓通过三次去油（2） 蜡笔画线将玻片分割为A、B、C 三区域（3） 接种环取生理盐水分别滴入A、B 两区域各一滴（4） 分别取少许A、B 、C 菌 ，与生理盐水充分混匀成
9、菌液，风干后形成菌膜（5） 固定火焰上方缓缓通过三次（6） 革兰氏染色（7） 滤纸吸干水分，油镜观看2. 革兰氏染色：（1） 细菌涂片、火焰固定（2） 结晶紫初染 1min（3） 卢戈氏碘液媒染 1min495%乙醇脱色 30-40s5沙黄复染 1min五、试验结果A：G+，球菌，推想为金黄色葡萄球菌； B：G-，短杆菌，推想为大肠杆菌；六、思考与争辩1 影响革兰氏染色的因素：（1） 细菌本身因素：菌龄：假设菌龄太大，可能消灭假阴性（2） 操作因素涂片：取菌应适量，涂片要均匀，假设某个局部菌层太厚，可能在脱色时达不到，会导致局部假阳性固定：固定温度太高或时间太长都会导致细菌构造破坏而消灭假阴性
10、；但是固定不够， 细菌会在水洗时被冲掉初染：初染时间虽然说是 1 分钟，但是可以适当延长，时间太短会消灭假阴性；染色滴加不均匀可能消灭半阴半阳媒染：和初染一样脱色：脱色时间不能过长，根本上用酒精滴过之后马上水冲就可以了，否则简洁消灭假阴性复染：复染时间需足够长，否则可能会染不上消毒灭菌一、试验目的1. 了解试验室常用消毒灭菌方法及其原理2. 把握试验中所用仪器的使用方法3. 把握机体常见部位及环境中的细菌培育物的初步鉴定4. 强化革兰氏染色技能二、试验原理1. 口咽部及皮肤正常菌群鼻咽部及扁桃体：葡萄球菌、类白喉杆菌、肺链、溶血及非溶血性链球菌、奈瑟菌等口腔：链球菌多见、放线菌、螺旋体、G-杆
11、菌等皮肤：表皮葡萄球菌、丙酸杆菌、类白喉杆菌、铜绿假单胞菌2. 溶血类型 溶血：现象：草绿色溶血环常见菌种：时机致病菌甲链、肺链 原理：细菌产生过氧化氢将血红蛋白氧化成深绿色的高铁血红蛋白溶血：现象：透亮溶血环常见菌种：致病菌乙链 )原理：细菌释放溶血素使红细胞裂开，血红蛋白释放三、试验材料咽拭子培育物：1 套/人；空气、纸币、手指消毒前后培育物：1 套/2；载玻片： 1 片/人；NS：1 支/人；滤纸：1 张/人四、试验内容1. 常用消毒灭菌方法：示教讲解1热力灭菌：1干热灭菌法：焚化、烧灼、干烤 160 ，2 小时2湿热灭菌法：煮沸 2%Na 2CO3，105；高压蒸汽灭菌 103.4kP
12、a ，20 分钟，121 ，临床运用最广的灭菌方法 2. 紫外线Ultraviolet radiation)：波长 265nm-266nm(DNA 吸取光谱杀菌力量最强。紫外光穿透力差，一般只用于不耐热物品外表的消毒。3. 过滤(filtration)用物理阻流的方法除去液体或空气中的细菌，用于不耐热物质的灭菌血清、毒素、抗生素等滤菌器：薄膜滤菌器、玻璃滤菌器、石棉滤菌器、素陶瓷滤菌器4. 低温保存菌种冷冻真空枯燥法5常用的化学消毒剂类别作用机制酚类蛋白变性，细胞膜损伤醇类去除脂类，蛋白变性卤素 蛋白变性重金属盐 蛋白变性醛类 蛋白变性外表活性剂 蛋白变性，细胞膜损伤酸碱类破坏细胞膜、细胞壁，
13、蛋白变性染料干扰氧化、抑制生殖 6试验室常用化学消毒剂：70-75%乙醇干净台消毒：来苏水擦拭防腐剂：三氯甲烷、硫柳汞、叠氮钠2. 细菌分布结果鉴定1） 观看菌落2） 取局部菌落的细菌进展革兰氏染色并观看五、试验结果常用种类洗必泰 乙醇氯气、碘酊 、碘伏红汞、硫柳汞、硝酸银福尔马林、戊二醛洁而灭十一烯酸龙胆紫1. 咽部正常菌群的采样、培育结果： 在羊血培育皿上消灭四种菌落：（1） 数目多，划线沿线都有；针尖大小；无色、光滑、潮湿、透亮、圆形。四周消灭草绿色溶血环，发生了不完全溶血即溶血。（2） 数目较多，划线沿线都有；较小；乳白色、光滑、潮湿、半透亮、圆形。（3） 少，只消灭在四个点；中型；乳
14、黄色、光滑、半潮湿、不透亮、外形不规章。在此种菌落下方的培育基消灭了透亮溶血环，发生了完全溶血即溶血。（4） 1 个菌落；较大；乳白色、光滑、潮湿、半透亮、圆形。粘稠。取1、2、3进展革兰氏染色，结果如下;（1） G+，链球菌，依据不完全溶血推断，为甲型链球菌。（2） G-，球菌，细胞个体小，外形像金黄色葡萄球菌，但是染色为阴性。（3） G-，球菌。2. 手指消毒前后细菌的采样培育结果：1） 消毒前：仅消灭 2 个菌落，较小；乳白色、光滑、潮湿、有光泽、圆形。革兰氏染色结果：G-，杆菌2） 消毒后：无菌落消灭。3. 硬币正反面的细菌采样培育结果：1） 正面 三种菌落：113 个菌落；较小；乳白
15、色、光滑、潮湿、有光泽、圆形。和手指消毒前的菌落一样。21 个菌落；较大；白色、光滑、潮湿、近似圆形。35 个菌落；较大；中心乳黄色边缘颜色变浅、光滑、潮湿、中间凸、不规章、边缘光滑取其中2、3进展革兰氏染色，结果如下：2G-，杆菌。和手指消毒前的细菌一样3G-，链杆菌。形态较大，外形像炭疽芽胞杆菌，但是没有芽孢且染色为阴性。2） 反面 两种菌落：12 个；较大，乳白色、光滑、潮湿、有光泽、圆形。2多个，沿硬币边缘线连成一片；针尖大小、无色、光滑、潮湿、透亮。4. 空气培育结果平皿放开在试验室的窗台上放置了约20 分钟，当时阳光照在上面： 平皿消灭了五种菌落：111 个；中等大小；白色、光滑、
16、潮湿、半透亮、圆形22 个；较大；四周白色，中间有一个透亮圈，光滑、潮湿、中间凹的圆饼状31 个；较大；四周黄色，中间有一个透亮的圆形区域，半潮湿、没有光泽41 个；较大；边缘橘黄色，中心偏白、明显凸起、枯燥、外形不规章51 个；较大；边缘透亮，中心乳黄色，光滑、潮湿、半透亮、圆形取其中3、4进展革兰氏染色，结果如下：3G-，杆菌。和手指消毒前、硬币正面菌落2的细菌一样4消灭三种细菌： G-，双球菌 G+，双球菌G-，梭菌5. 八个取样染色结果取样细菌来源染色结果细菌形态1咽部G+链球菌2咽部G-球菌3咽部G-球菌4手指消毒前G-杆菌5硬币正面G-杆菌6硬币正面G-链杆菌7空气试验室窗台G-杆
17、菌8空气试验室窗台G-双球菌G+双球菌六、思考与争辩G-梭菌1. 巴氏消毒法的利用巴氏消毒法是一种低温消毒法，包括：低温维持法：62.8 摄氏度维持 30 分钟；高温瞬时法： 71.3 摄氏度作用 15-30 秒。该法适用于食品的消毒。现主要应用于乳制品。2. 为什么湿热消毒法的温度比干热消毒法低？课堂上讲到的干热消毒法温度都比湿热消毒法要高，说明湿热灭菌法可在较低的温度下到达的灭菌效果可以与干热法一样，分析缘由如下：（1） 湿热中蛋白吸取水份，更易凝固变性；（2） 水分子的穿透力比空气大，更易均匀传递热能，在干热状态下，由于热穿透力较差，微生物的耐热性较强，必需长时间受高温的作用才能到达灭菌
18、微生物试验报告的目的（3） 蒸汽潜热大，每 1 克水由气态变成液态可释放出 529 卡热能，可快速提高物体的温度。3. 细菌分布试验结果争辩咽部正常菌群主要为：溶血和非溶血性链球菌、球菌等，不同人由于个体差异和取样部位差异，所得菌种也有所不同手的消毒是有效的，消毒后细菌明显削减了。同时手上的菌是很多的，所以需要常洗手。手上较常见的是四联球菌。硬币上的菌也相对较多，由于它经受的环境很多。在咽部、硬币和未消毒的手上，都得到了一种很像大肠杆菌的革兰氏阴性杆菌，说明这种菌分布格外广泛。4. 空气培育取样染色时，为什么得到三种菌？图 1 空气培育取样革兰氏染色10*100一般认为，菌落形成是一个菌落到培育基上并增殖而来，但是在空气培育得到的菌落取样染色时，觉察了三种形态完全不同的菌如图1，较大的双球菌和梭菌为革兰氏阴性，较小的双球菌为革兰氏阳性。可能的缘由有：（1） 取样的污染，该菌落被两次取用，可能遭到污染（2） 在格外小的概率下，三个不同的菌掉到了同一处，同时这三种菌的生长互不影响甚至互利，于是形成了混合菌群。（3） 三个菌落在生长过程中由于靠得很近而融合了。9