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1、返回章目录高效液相色谱法高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography分析化学教研室分析化学教研室高效液相色谱仪分析流程仿真系高效液相色谱仪分析流程仿真系高效液相色谱仪分析流程仿真系高效液相色谱仪分析流程仿真系统统统统 返回章目录高效液相色谱法高效液相色谱法概述概述1 1基本原理基本原理2 2各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法3 3固定相固定相4 4流动相流动相5 5高效液相色谱仪高效液相色谱仪6 6小结小结习题及解答习题及解答返回章目录一、概一、概 述述v高效液相色谱法高效液相色谱法：以经典液相色谱为基础，在气相色谱的：以经典液相色谱为基础，在
2、气相色谱的理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。v简称：简称：HPLC；HRLC；SPLC；UPLC 超高效液相色谱（超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography）v与经典与经典LCLC相比相比高效高效 高效填料：高效填料：3 35m 5m 高压泵输液高压泵输液 高灵敏度的检测器高灵敏度的检测器:在线检测在线检测返回章目录一、概一、概 述述分析对象分析对象流动相差别流动相差别GC能气化、热能气化、热稳定性好、且稳定性好、且沸点较低的样沸点较低的样品，占有机物品，占有机物的的20%20%惰性气体惰
3、性气体HPLCl不受样品挥不受样品挥发性和热稳定发性和热稳定性的限制，占性的限制，占有机物的有机物的80%80%l液体，种类液体，种类较多，选择余较多，选择余地广地广HPLCHPLC与与GCGC区别区别返回章目录一、概一、概 述述 HPLCHPLC仪器示意图仪器示意图返回章目录一、概一、概 述述Agilent 1100返回章目录一、概一、概 述述 HPLCHPLC仪器图仪器图SHIMADZUAGILENTWATERS返回章目录一、概一、概 述述application返回章目录高效液相色谱法高效液相色谱法概述概述1 1基本原理基本原理2 2各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法3 3固定相固定相4
4、 4流动相流动相5 5高效液相色谱仪高效液相色谱仪6 6返回章目录二、基本原理二、基本原理v范氏方程（Van Deemter equation)：重要GC：填充柱填充柱 H=A+B/u+Cu 开口毛细管柱开口毛细管柱H=B/u+Cu HPLC：H=A+Cu原因：原因：原因：原因：T T；u u 忽略忽略忽略忽略B B/u u返回章目录二、基本原理二、基本原理GC GC 和和 HPLC HPLC 的的 H-u H-u 图图(1)(1)B/u B/u (2)(2)Cu Cu (3)(3)A A (4)(4)HPLC HPLC 的的uopt (5)(5)GC GC 的的uopt返回章目录二、基本原理
5、二、基本原理vHPLC：H=A+Cu A=2dp C=Cm+Csmv影响因素影响因素：选球形固定相，高压、匀浆装柱法dp选粒径小的化学键合相C选粘度小、低流速的流动相范氏方程范氏方程范氏方程范氏方程（van Deemter equation)van Deemter equation)返回章目录高效液相色谱法高效液相色谱法概述概述1 1基本原理基本原理2 2各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法3 3固定相固定相4 4流动相流动相5 5高效液相色谱仪高效液相色谱仪6 6返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法（液固吸附色谱法（LSCLSC）1 1液液分配色谱法（液液分配
6、色谱法（LLCLLC）2 2化学键合相色谱法（化学键合相色谱法（BPCBPC）3 3返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法v液固吸附色谱法液固吸附色谱法分离机理:组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面活性中心固定相:硅胶流动相:底剂（烷烃）+极性调节剂 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱例如：TLC返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法v液液分配色谱法液液分配色谱法分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异分类分类:概念及保留行为（重要）概念及保留行为（重要）正相色谱正相色谱 NPLCNPLC固定液极性固定液极性 流动
7、相极性流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱后出柱 反相色谱反相色谱 RPLCRPLC固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性极性大的组分先出柱，极性小的组分极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱后出柱返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法化学键合相色谱法化学键合相色谱法 (bonded phase chromatography (bonded phase chromatography，BPC)BPC)概念：固定液的官能团通过概念：固定液的官能团通过 化学反应键合在载体表面化学反应键合在载体表面 反相键合相反相键合相 离子抑制离子抑制
8、 正相键合相正相键合相 离子对离子对返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法1.反相键合相色谱法反相键合相色谱法(RBPC)(RBPC)分离机制分离机制：疏溶剂理论等：疏溶剂理论等固定相：非极性的键合相固定相：非极性的键合相如如:十八烷基硅烷键合相（十八烷基硅烷键合相（ODSODS；C C1818柱柱)流动相：极性大的流动相流动相：极性大的流动相如如:甲醇甲醇-水或乙腈水或乙腈-水水流动相极性与流动相极性与k k的关系的关系:极性极性，洗脱能力，洗脱能力，kk，组分，组分t tR R极性大的组分先出柱极性大的组分先出柱应用：非极性应用：非极性-中等极性组分中等极性组分(80%)(
9、80%)返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法2.正相键合相色谱法正相键合相色谱法(NBPC)(NBPC)分离机制分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用力的差别力的差别固定相：极性大的氰基或氨基键合相固定相：极性大的氰基或氨基键合相流动相：极性小的底剂（烷烃）流动相：极性小的底剂（烷烃）+极性调节剂极性调节剂 流动相极性与流动相极性与k k的关系的关系：流动相极性流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，组分，组分t tR R，k k结构相近组分，极性大的组分后出柱结构相近组分，极性大的组分后出柱返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色
10、谱法3.离子对色谱法离子对色谱法(IPC,PIC)(IPC,PIC)分离机制分离机制：在流动相中加入离子对试剂，使形成：在流动相中加入离子对试剂，使形成不带电的中性离子对，以改善分离不带电的中性离子对，以改善分离机理：机理：流动相流动相 固定相固定相 B+H+BH+RSO3Na RSO-3+Na+BH+.RSO-3 BH+.RSO-3 中性离子对中性离子对 增加了在非极性固定相中溶解度。增加了在非极性固定相中溶解度。返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法常用离子对试剂：分析对象分析对象离子对试剂离子对试剂例如例如碱碱烷基磺酸钠烷基磺酸钠C C5 5、C C6 6、C C7 7、
11、C C8 8磺磺酸钠酸钠,SDS,SDS酸酸四丁基季铵盐四丁基季铵盐四丁基胺磷酸盐四丁基胺磷酸盐（TBATBA）返回章目录三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法4.离子抑制色谱法离子抑制色谱法(ISC)(ISC)分离机制分离机制：通过调节流动相的：通过调节流动相的pHpH，抑制组分离解，抑制组分离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸，弱碱的目的弱碱的目的适用范围：适用范围：3.0pK3.0pKa a7.0 7.0 的弱酸的弱酸 7.0pK7.0pKa a8.0 8.0 的弱碱的弱碱抑制剂抑制剂:弱酸（弱酸（HAcHAc）、弱碱（）
12、、弱碱（NHNH3 3H H2 2O O）或缓冲液）或缓冲液 返回章目录HPLC概述概述1 1基本原理基本原理2 2各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法3 3固定相固定相4 4流动相流动相5 5高效液相色谱仪高效液相色谱仪6 6返回章目录四、固定相四、固定相v液液-固色谱固定相固色谱固定相v载体：载体：硅胶硅胶无定形全多孔硅胶无定形全多孔硅胶YWGYWG球形全多孔硅胶球形全多孔硅胶YQGYQG高分子多孔微球高分子多孔微球YSGYSG特点：柱选择性好，峰形好，柱效低特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 返回章目录四、固定相四、固定相v化学键合相化学键合相特点特点：不易流失不易流失；热稳定性好；化学性
13、能稳定热稳定性好；化学性能稳定载样量大；适于梯度洗脱载样量大；适于梯度洗脱分类分类：非极性键合相：非极性键合相：ODSODS中等极性键合相：醚基键合相中等极性键合相：醚基键合相极性键合相：氨基、氯基键合相极性键合相：氨基、氯基键合相返回章目录四、固定相四、固定相v非极性键合相：非极性键合相：ODSODS载体：全多孔载体：全多孔YWGYWG，YQGYQG、堆积硅球、堆积硅球表面覆盖度：表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。其大小，决定键合相是分配还是吸附占主导作用。键合基团键长：键长键合基团键长：键长，载样量，载样量，kk 返回章目录HPLC概述概述1 1基本原理基本原理2
14、 2各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法3 3固定相固定相4 4流动相流动相5 5高效液相色谱仪高效液相色谱仪6 6返回章目录五、流动相五、流动相v要求：要求：与固定液不反应；对样品有良好溶解度与固定液不反应；对样品有良好溶解度粘度小；与检测器匹配粘度小；与检测器匹配 与固定相性质和流动相种类有关与固定相性质和流动相种类有关k 与流动相配比有关与流动相配比有关返回章目录五、流动相五、流动相v正相洗脱正相洗脱流动相的极性小于固定相的洗脱流动相的极性小于固定相的洗脱v反相洗脱反相洗脱流动相的极性大于固定相的洗脱流动相的极性大于固定相的洗脱v洗脱方式：洗脱方式：等度洗脱(isocratic elut
15、ion)恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱(gradient elution)在一个分析周期内不断改变流动相的比例返回章目录五、流动相五、流动相 返回章目录HPLC概述概述1 1基本原理基本原理2 2各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法3 3固定相固定相4 4流动相流动相5 5高效液相色谱仪高效液相色谱仪6 6返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站高效液相色谱仪高效液相色谱仪HPLC返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站泵：恒压泵恒流泵:柱塞往复泵返回章目录六、
16、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪AgilentAgilent 二元泵示意图二元泵示意图返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站色谱柱：由柱管色谱柱：由柱管(不锈钢管不锈钢管)和固定相组成和固定相组成分析柱分析柱 2-4.6mm L 10-25cm 常量柱常量柱 1-1.5mm L 10-20cm 常微量柱常微量柱制备柱制备柱 20-50mm L 3-25cm 返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v输液泵输液泵进
17、样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站检测器检测器:1.1.紫外检测器紫外检测器2.2.荧光检测器荧光检测器3.3.蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器4.4.其它检测器其它检测器返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪T/minT/min波长波长波长波长(nm)(nm)色谱光谱图色谱光谱图色谱光谱图色谱光谱图返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v输液泵输液泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器工作站工作站2489UVD2489UVD2414RID2414RID242
18、4ELSD2424ELSD2465ECD2465ECDWATERSWATERSWATERSWATERS返回章目录六、高效液相色谱仪六、高效液相色谱仪v超高效液相色谱仪()返回章目录小结熟悉掌握了解HPLC的特点.HPLC的仪器结构及各部件.HPLC中色谱条件的选择.化学键合相色谱法.范氏方程在HPLC的表达形式.分离度影响因素正相色谱和反相色谱.返回章目录习题及解答习题及解答3.HPLC3.HPLC流动相的流动相的pHpH值应控制为值应控制为_ 小于小于小于小于H=A+CuH=A+CuH=A+CuH=A+Cu2-82-82-82-81.1.反相色谱中固定相的极性反相色谱中固定相的极性 流动相的
19、极性流动相的极性.2.HPLC2.HPLC中范氏方程的表达式为中范氏方程的表达式为:_填空题：填空题：返回章目录习题及解答习题及解答1.1.键合相的键合基团的碳链长度增长后键合相的键合基团的碳链长度增长后 ()A.A.极性减少极性减少 B.B.极性增大极性增大 C.C.载样量增大载样量增大 D.D.载样量减少载样量减少2.2.提高色谱柱柱效的可行方法是提高色谱柱柱效的可行方法是 ()()A.A.选择小粒度的固定相选择小粒度的固定相 B.B.降低固定相的粒度分布降低固定相的粒度分布C.C.选择球形固定相选择球形固定相 D.D.匀浆装柱匀浆装柱E.E.增加柱长增加柱长 F.F.选择适宜流动相选择适宜流动相G.G.降低流速降低流速ACACABCDABCD选择题：选择题：返回章目录习题及解答习题及解答计算题：计算题：1.用用15 cm长的长的ODS柱分离两个组分，已知在实验条件下柱分离两个组分，已知在实验条件下柱效柱效 n=2.84104 m-1，用苯磺酸溶液测得死时间，用苯磺酸溶液测得死时间 t0=1.31 min，测得，测得tR1=4.10 min及及tR2=4.38 min。求：（求：（1）k1、k2、R；（2）若增加柱长至）若增加柱长至30cm，分离度可否达到，分离度可否达到1.5？返回章目录习题及解答习题及解答解：（解：（1）同理：同理：（2）返回章目录分析化学教研室