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1、高效表达目标基因的战略和技术表达质粒的优化和设计共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA基因提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性高密度发酵和工程化宿主细胞 表达质粒的优化和设计在各种表达载体中，启动子和SD序列的下游都设计了一段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的一部分，因此它对构建高效表达质粒是至关重要的。由于每一个基因都具备各自独特的5端结构，最终构建成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。表达质粒的优化和设计表达质粒的优化和设计 构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成处于一个
2、适当的范围。核糖体结合位点序列的变化对mRNA的翻译效率有显著影响，表达质粒的优化和设计具体表现为：具体表现为：具体表现为：具体表现为：SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA高36倍。翻译起始密码ATG与UAAGGAGG的最适距离是68个碱基长度，与AAGAA的最适距离是57个碱基长度。ATG与UAAGGAGG至少相隔34个碱基，与AAGAA至少相隔5个碱基mRNA的翻译才能进行。ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，mRNA翻译效率较高。表达质粒的优化和设计 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因mRNA 5端的二级结构，研究表明mRNA 5端形成的“茎环”结构阻
3、碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合，从而抑制了翻译的起始。尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T碱基的含量，降低mRNA 5端形成的“茎环”结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。表达质粒的优化和设计 在必要的情况下，还可通过顶点突变，PCR等技术改变个别关键的碱基来破坏mRNA 5端的“茎环”结构。把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下。表达质粒的优化和设计 在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征和特点，注意引入翻译增
4、强子序列 能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻译增强子。表达质粒的优化和设计共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有：编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA编码 Cys 的密码子 UGU、UGC编码 Gly 的密码子 GGA、GGG编码 Leu 的密码子 CUA、CUC编码 IIe 的密码子 AUA编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC编码 Thr 的密码子 ACA 由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度有正
5、比关系，稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。解决这一问题的办法：u 通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率的同义密 码子。u 在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因，以提高大肠杆 菌细胞内稀有密码子tRNA的丰度。共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因 在所有的大肠杆菌稀有密码子tRNA中，tRNA Arg（AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密码子在真核基因中经常出现。人尿激酶原 ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂NTA等基因中都含有较多的 AGG 和 AGA 密码子，在大肠杆菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达 tRNA Arg（AG
6、G/AGA）基因argU后，这些基因的表达水平能明显得到提高。共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因 现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响。因为稀有密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA的二级结构的不同决定了它对翻译是有差别的。所有的结论要通过实验才能得出。由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌中的核酸酶和蛋白质水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因蛋白质水解酶的特点 细胞质是蛋白水解酶含量最多的区域，目标蛋白在细胞质中
7、最容易受到蛋白水解酶的作用。通过对已知大肠杆菌细胞内半衰期的蛋白质的统计学分析，发现N末端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp残基的蛋白质，含有Pro、Glu、Ser、Thr丰富区的蛋白质降解，稳定性较差。在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理因素的刺激的条件下，大肠杆菌细胞内的蛋白质水解酶活力往往能达到比较高的水平。共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因1.利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积累在周质空间，或分泌到培养基2.采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。3.对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达。4.共表达能提高特定目标稳定性的辅助因子，如分子伴侣基因。
8、5.对蛋白质序列中的蛋白质水解酶敏感区域和识别位点进行改造。6.在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。提高目标蛋白的稳定性的措施 但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途的不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主要表现为：大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的转运和分泌效率 一般比较低，不能满足大规模制备的需要。蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速度 慢，使高密度发酵比较困难。融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样，导致 生物比活力降低，甚至没有活性。融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学切割出单体 目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分离去除。化学法比酶法成本低，但不少
9、裂解试剂有毒性。对蛋白质序列进行改造需要有基本的蛋白质结构数 据，而目前这方面的数据库还不完整。大肠杆菌高密度发酵时大规模制备蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种。高密度发酵和工程化宿主细胞构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌 高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培养基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的积累，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的抑制作用。这是高密度发酵工艺研究中最迫切需要解决的问题。虽然
10、在发酵过程中可采取通氧气，提高搅拌速度，控制补料速度等措施来控制溶氧饱和度，减少乙酸的产生。但从实际应用上看，这些措施都有一定的滞后效应，难以做到比较精确的控制。因此构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌，是从根本上解决问题的途径之一。高密度发酵和工程化宿主细胞 利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白基因vgb 导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值。用基因敲出技术缺失大肠杆菌的磷酸乙酰酶基因 pta1和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合途径被阻断。改变代谢流的方向，通过共转化把枯草杆菌、酿酒酵
11、母的乙酰乳酸合成酶基因alsS，单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因pdc1 和乙醇脱氢酶基因adh2 导入大肠杆菌，使丙酮酸代谢有选择地向生成3-羟基丁酮或乙醇的方向进行。高密度发酵和工程化宿主细胞构建蛋白质水解酶活力低的工程化宿主菌 对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋白而言，随后发酵后期各种蛋白酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解酶的作用而被降解。为了使对蛋白酶比较敏感的目标蛋白也能获得较高水平的表达，需要构建蛋白水解酶活性低的工程化宿主菌。rpoH 基因编码大肠杆菌 RNA聚合酶的r32 亚基，r32 亚基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力有正调控作用。rpoH基因缺陷的突变株已经被构建，研究结果表明它能
12、明显提高目标基因的表达水平。到目前为止，已知的大肠杆菌蛋白水解酶基因缺陷的突变株都已被获得，其中一部分具有实际应用的潜力。高密度发酵和工程化宿主细胞大肠杆菌表达系统研究的发展趋势构建各种表达载体建立新的表达系统目前研究的重点完善现有的表达系统，解决表达系统中还存在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括：重组蛋白质的正确折叠、构象形成和分泌 菌体表面表达技术及其应用 重组蛋白质修饰加工研究大肠杆菌表达系统研究的发展趋势共表达与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣包涵体是由于在新合成的大量目标蛋白质的折叠过程中，大肠杆菌细胞内参与折叠的蛋白质因子的量不能满足需要，无法形成正确的构象而产生的，因此在大肠杆菌
13、内共表达与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣，折叠酶或硫氧化蛋白基因可以使目标基因可溶性表达的比例明显上升。研究表明这种作用是具有专一性的，不同的目标蛋白需要不同类型的蛋白因子共表达。在有些情况下需要多个蛋白因子共表达才能达到预期的目标。大肠杆菌表达系统研究的发展趋势共表达人或小鼠的二硫键异构酶、促进二硫键形成和正确折叠大肠杆菌周质空间通过二硫键形成酶DsbA 和 DsbB二个蛋白维持适当的氧化还原态势使蛋白质的二硫键形成。共表达人或小鼠的蛋白质二硫键异构酶（PDI）u PDI 能互补dsbA缺陷株，但在dsbB缺陷株中PDI失去原 有的功能u PDI 对目标蛋白的二硫键形成和正确折叠的促进作用
14、可 以受到谷胱甘肽的调节。u PDI 具有的二硫键异构，交换和功能有效地弥补了DsbA 和DsbB功能上的不足，从而提高了目标蛋白正确折叠的 比例。大肠杆菌表达系统研究的发展趋势降低蛋白质合成的速率，从而增加正确折叠重组蛋白质 从phoA基因合成速度低的突变株中发现其分泌在周质空间的phoA 的产物-碱性磷酸酯酶比野生型菌株有显著增加，由于只有构象正确的酶原才能被大肠杆菌蛋白转运系统识别和分泌，这一结果表明了目标蛋白合成的速率能对其构象形成正确与否产生影响。采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降低蛋白质合成的速率，从而达到增加正确折叠重组蛋白质的目的。大肠杆菌表达系统研究的发展趋势改造信
15、号肽的序列和结构，提高分泌效率 比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因phoA信号肽的疏水区置换为多聚Leu残基能明显提高分泌效率。表明信号肽核心部位疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好参考依据。大肠杆菌表达系统研究的发展趋势大肠杆菌表面表达技术的建立膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点领域，膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面技术的建立。外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程度上能与噬菌体展示系统相媲美。大肠杆菌表达系统研究的发展趋势大肠杆菌表面表达技术的建立主要通
16、过三条途径是目标蛋白呈现在菌体表面：u 把外源序列插入LamB、OmpA、PhoE等外膜蛋白的膜外区u 把外源蛋白导入大肠杆菌鞭毛或伞毛的结构 这二种方法适合表达一段长度小于100个氨基酸残基的外源序列，因为较大的外源序列的插入往往会使外膜蛋白不能形成原来的三维结构，影响它转运过程和在膜上的定位。u 在脂蛋白、lgA蛋白酶、ompA基因的N端或C端融合外源基因 这种融合表达的方法对外源基因的限制条件就比较小，其序列可在50到500氨基酸残基长度范围内。大肠杆菌表达系统研究的发展趋势重组蛋白质修饰加工研究 蛋白质C末端酰胺化和侧链糖基化是常见的翻译后修饰加工类型，目前C末端酰胺化一般都是在体外通
17、过肽酰苷氨酸酰胺酶把C末端甘氨酸转换为氨基 把其他微生物的肽酰甘氨酸酰胺酶，真核生物糖基化过程所涉及的酶系导入大肠杆菌的设想很早就被提出，但这些工作都还在探索之中。其中需要研究的主要问题有：如何使肽酰苷氨酸酰氨酶在大肠杆菌内有较高的活力和专一性；如何通过基因工程技术改造真核生物的糖基化体系使其能整合到大肠杆菌的染色体中和对糖基化位置、糖基种类和长度进行控制。重组工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制改善基因工程菌不稳定性的策略四、基因工程菌的稳定性重组工程菌的遗传不稳定性的表现 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：结构
18、不稳定性 重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失。分裂不稳定性 整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）四、基因工程菌的稳定性u 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的 降解u 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长 代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序四、基因工程菌的稳定性重组工程菌的遗传不稳定性的产生机制重组工程菌的遗传不稳定性的产生机制u重组质粒在受体细胞质粒分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因u 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失 重排四、基因工程
19、菌的稳定性重组质粒的逃逸率 当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为重组质粒的宏观逃逸率。四、基因工程菌的稳定性重组质粒的逃逸率重组质粒逃逸的原因有：u 高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料促进重组质粒渗透u 受体细胞中的核酸酶降解重组质粒u 重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重 组质粒拷贝数的差异随着细胞分裂次数增多而加剧四、基因工程菌的稳定性质粒稳定性分析方法：将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基，培养1012h，然后随机挑选100个菌落接种到含抗性标记抗生
20、素的平板培养基上，统计长出的菌落数。每一个样品应取3次重复的结果，计算出比值，该比值反映了质粒的稳定性。四、基因工程菌的稳定性影响基因工程稳定性的因素遗传特性载体的性质宿主的选择外源基因整合到宿主染色体发酵工艺培养基生长速率限制性基质温度pH和溶氧外源基因表达四、基因工程菌的稳定性培养基一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质，微生物的生长较在基本培养基中快。四、基因工程菌的稳定性比生长速率 基因重组细菌的比生长速率对质粒稳定性有很大的影响。提高比生长速率有助于提高质粒稳
21、定性。基因重组细菌的比生长速率与培养环境有关，如温度、pH，溶氧，限制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和pH下，限制性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。四、基因工程菌的稳定性限制性基质 一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物的生长通常会受到一种或是几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不同的影响。四、基因工程菌的稳定性pH和溶解氧 pH和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重组菌时，通常都需要维持一定的pH和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养时，为了维持所需的溶氧水平，除了提高搅拌转速和通气量，往往还要在通入的空气中补充氧气，以提高
22、发酵罐的供氧能力。pH和溶氧影响重组酵母菌的稳定性。四、基因工程菌的稳定性外源基因的表达 外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定性 外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干扰宿主细胞的正常代谢活动，并造成质粒不稳定。四、基因工程菌的稳定性施加选择压力u 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定 时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力u 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组分 培养基复杂，成本较高四、基因工程菌的稳定性改善基因工程菌
23、不稳定性的策略改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：u 将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的 无质粒细胞u 正确设置载体上的多克隆位点 禁止DNA片段插在稳定区内u 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb 基因（DNA单链结合蛋白编码基因）四、基因工程菌的稳定性改善基因工程菌不稳定性的策略分阶段控制培养因外源基因表达造成质粒不稳定性时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 u 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造 成不稳定性问题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或
24、诱导外源基因表达。u 连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行 生长，维持菌体的稳定性，在第二级进行表述。四、基因工程菌的稳定性改善基因工程菌不稳定性的策略控制目的基因的过量表达u 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程 度u 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的 拷贝数优化基因工程菌的培养工艺u 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定u 培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定四、基因工程菌的稳定性改善基因工程菌不稳定性的策略工程菌的培养条件对其质粒的稳定性和表达效率影响很大可调控的环境参数为：培养基组分、培养温度、pH和溶解氧浓度。有些含质粒的菌对发酵环
25、境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间歇隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可以提高质粒的稳定性。四、基因工程菌的稳定性改善基因工程菌不稳定性的策略控制培养条件 有些含有质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变改变稀释的方法都可以提高质粒的稳定性。例如研究表达干扰素的大肠杆菌W3110(pEC901)在不同比生长速率下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰素的比效价也明显增大。四、基因
26、工程菌的稳定性改善基因工程菌不稳定性的策略固定化 固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性 u 基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目 标产物的表达率都有了很大的提高。u 在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压 力稳定质粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法后，这种选择压力则可被省去。u 不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的 稳定性。四、基因工程菌的稳定性改善基因工程菌不稳定性的策略1 基因工程菌的培养方式和培养设备2 基因工程菌的分离纯化工艺五、基因工程菌的培养和分离纯化技术基因工程菌培养方式基因工程菌发酵的基本操作方式有：分批培养分批培养操作简单，但
27、因不能控制生长，获得的菌体密度也有限半连续培养（补料分批）在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的生长，或得到更多的代谢产物连续培养 不断地流加营养，并不断地取出发酵液。连续培养则多用于动力学特征和稳定性等研究。透析培养固定化培养基因工程菌培养方式补料分批培养 补料分批培养是将种子液接入发酵液反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。基因工程菌培养方式连续培养 连续
28、培养是将种子液接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了良好的条件。基因工程菌培养方式连续培养 但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获得最高表达水平或最大产率。基因工程菌培养方式透析培
29、养 透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。采用膜透析装置是在发酵过程中用蠕动泵将发酵液抽出打入罐外的膜透析器的一侧循环，其另一侧通入透析液循环，在补料分批培养中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密度菌体。基因工程菌培养方式透析培养 膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响。基因工程菌培养方式固定化培养 基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。
30、有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。基因工程菌培养设备 应用发酵罐来大规模培养基因工程菌。为了防止工程菌丢失携带的质粒，保持基因工程菌的遗传特性，因而对发酵罐的要求十分严格。由于生化工程学和计算机的发展，新型自动化发酵罐完全能满足这些要求。常规的微生物发酵设备可直接用于基因工程菌的培养。不同点在于，微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标。基因工程菌培养设备 基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。由于这类物质是相对独立
31、于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质，因此，培养设备以及设备控制应满足获得高浓度的受体细胞和高表达的基因表达产物。基因工程菌培养设备发酵罐的组成部分有：发酵罐体 保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置 残留气体处理装置 参数测定与控制系统 培养液配制及连续操作装置等基因工程菌培养设备基因工程菌在发酵培养过程中要求 环境条件恒定，不影响其遗传特性，更不能引起所带质粒丢失。对发酵罐有特殊要求 如要提供菌体生长的最适条件 培养过程不得污染 保证纯菌培养 培养及消毒过程中不得游离出异物，干扰细菌代谢活动基因工程菌培养设备 发酵罐的结构材料的稳定性要好，一般要应用不锈钢制成罐体表面光滑易清洗，灭菌时没有死角 与发酵罐连接的阀门要用膜式阀，不用球形阀 所有的连接接口均要用密封圈密封，不留“死腔”，不得有泄露搅拌器转速和通气应适当基因工程菌培养设备 空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料 培养液要经化学处理或热处理后才可排放 发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才能将废气放出。轴封可采用磁力搅拌或双端面密封