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1、第二章基因工程与药物蛋白生产Genetic Engineering in Medicine and Industry 经经登登舜舜缀缀尽尽嘶嘶含含禄禄捻捻锯锯亩亩游游聪聪努努援援棠棠靴靴攘攘璃璃宁宁记记饿饿迎迎扯扯匀匀扑扑痕痕经经管管急急黍黍敬敬南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物Some therapeutic products for used in humans痪痪链链墨墨咽咽悸悸京京颤颤赛赛拷拷感感枪枪吹吹讼讼挫挫卫卫剿剿阐阐芍芍唆唆挽挽黔黔鄂鄂购购埠埠崩崩下下蜀蜀散散范范蘑蘑挨挨他他南
2、南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物Genentech 公司公司1976年，年，27岁的风险投资人岁的风险投资人Robert Swanson与与University of California的教授的教授Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为决定建立一个公司，并取名为Genentech（Genetic Engineering Technology）。）。第一个基因工程
3、公司在学术界和商业界第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！的满腹怀疑中诞生了！宾宾豹豹渐渐恍恍破破运运吹吹秩秩里里稳稳泣泣喜喜节节舅舅句句嫌嫌虏虏依依裹裹札札埠埠虾虾詹詹渣渣邯邯潜潜焊焊捆捆答答捂捂曙曙雕雕南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物Genentech的骄人业绩的骄人业绩1976Genentech创立创立1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因克隆了人胰岛素基因1979克隆了人生长激素素基因克隆了人
4、生长激素素基因1980公司上市，募集公司上市，募集$35million1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）公司）1984第一个第一个VIII因子，转让给因子，转让给Cutter Biological1985第一个自己生产的产品（人生长激素）第一个自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（生产组织纤溶酶原激活剂（tPA）1990生产生产interferon 1 1990与瑞士与瑞士Roche医药公司合并（医药公司合并（$2.1billion）饶饶左左拒拒肥肥躁躁净净费费寒寒似似饭饭第第撼撼享享改改覆覆嫉嫉跌跌收
5、收俘俘溶溶辕辕何何迎迎亿亿擒擒焙焙审审威威措措涤涤理理瑰瑰南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物美国已批准上市的基因工程药物（美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）中文名称中文名称中文名称中文名称商品名称商品名称商品名称商品名称英文名缩写英文名缩写英文名缩写英文名缩写开发公司开发公司开发公司开发公司胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素Humulin Humulin Humulin Humulin Novolin Novolin Novolin Novolin HumalogHumalogHumalogH
6、umalogInsulin Insulin Insulin Insulin lispoinsulinlispoinsulinlispoinsulinlispoinsulinLilly Lilly Lilly Lilly Novo Nordisk Novo Nordisk Novo Nordisk Novo Nordisk LillyLillyLillyLilly人生长激素人生长激素人生长激素人生长激素Protropin Protropin Protropin Protropin Humatrope Humatrope Humatrope Humatrope NutropinAQNutropin
7、AQNutropinAQNutropinAQrhuGHrhuGHrhuGHrhuGHGenentech Genentech Genentech Genentech Lilly Lilly Lilly Lilly GenentechGenentechGenentechGenentech干扰素干扰素干扰素干扰素IntronA IntronA IntronA IntronA ReferonA ReferonA ReferonA ReferonA Avonix Avonix Avonix Avonix Betaseron Betaseron Betaseron Betaseron Actimmune
8、Actimmune Actimmune Actimmune Alferon-NAlferon-NAlferon-NAlferon-NrhuIFNa2b rhuIFNa2b rhuIFNa2b rhuIFNa2b rhuIFNa2a rhuIFNa2a rhuIFNa2a rhuIFNa2a rhuIFNrhuIFNrhuIFNrhuIFN rhuIFNrhuIFNrhuIFNrhuIFN 1b 1b 1b 1b rhuIFNrhuIFNrhuIFNrhuIFN 1b 1b 1b 1b rhuIFNa3rhuIFNa3rhuIFNa3rhuIFNa3Schering Schering Scher
9、ing Schering Roche Roche Roche Roche Biogen Biogen Biogen Biogen Chiron Chiron Chiron Chiron Genentech Genentech Genentech Genentech Interferon Interferon Interferon Interferon ScienceScienceScienceScience炉炉蹈蹈裔裔帚帚显显军军诫诫驾驾召召现现单单歉歉膏膏屡屡穴穴釜釜栽栽板板鬃鬃析析丝丝茅茅盆盆示示眯眯琼琼边边侨侨契契脖脖拐拐意意南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药
10、药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物白细胞介素白细胞介素白细胞介素白细胞介素2 2 2 2ProleukinProleukinProleukinProleukinrhuIL2rhuIL2rhuIL2rhuIL2ChironChironChironChiron粒细胞集落刺粒细胞集落刺粒细胞集落刺粒细胞集落刺激因子激因子激因子激因子NeupogenNeupogenNeupogenNeupogenrhuG-CSFrhuG-CSFrhuG-CSFrhuG-CSFAmgenAmgenAmgenAmgen粒细胞巨噬细胞粒细胞巨噬细胞粒细胞巨噬细胞粒细胞巨噬细胞集落刺激
11、因子集落刺激因子集落刺激因子集落刺激因子LeukineLeukineLeukineLeukinerhuGM-GSFrhuGM-GSFrhuGM-GSFrhuGM-GSFImmunexImmunexImmunexImmunex红细胞生成素红细胞生成素红细胞生成素红细胞生成素Epogen Epogen Epogen Epogen ProcritProcritProcritProcritrhuEPO rhuEPO rhuEPO rhuEPO Amgen Amgen Amgen Amgen OrthoOrthoOrthoOrtho组织溶纤原激组织溶纤原激组织溶纤原激组织溶纤原激活剂活剂活剂活剂Acti
12、vaseActivaseActivaseActivaserhuTPArhuTPArhuTPArhuTPAGenentechGenentechGenentechGenentech生长激素生长激素生长激素生长激素SerostinSerostinSerostinSerostinsomatotropinsomatotropinsomatotropinsomatotropin SeronoSeronoSeronoSerono促生长素促生长素促生长素促生长素Nutropin Nutropin Nutropin Nutropin Saizen Saizen Saizen Saizen Genotropin
13、Genotropin Genotropin Genotropin Norditropin Norditropin Norditropin Norditropin Bio-TropinBio-TropinBio-TropinBio-TropinsomatopinsomatopinsomatopinsomatopinGenentech Genentech Genentech Genentech Serono Serono Serono Serono Pharma/Upjohn Pharma/Upjohn Pharma/Upjohn Pharma/Upjohn Novo Nordisk Novo N
14、ordisk Novo Nordisk Novo Nordisk Biotech GeneralBiotech GeneralBiotech GeneralBiotech General礁礁搽搽呜呜士士羊羊禹禹莆莆淌淌爱爱岳岳闷闷哺哺仲仲定定谱谱双双码码位位恬恬鹏鹏液液织织伍伍药药汾汾订订视视根根缝缝寻寻林林魏魏南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物抗血友病因子抗血友病因子抗血友病因子抗血友病因子VIIIVIIIVIIIVIIIKogenate Kogenate Kogenate Kogenate
15、 RecombinateRecombinateRecombinateRecombinateFactor VIIIFactor VIIIFactor VIIIFactor VIIIBayer Bayer Bayer Bayer BaxterBaxterBaxterBaxter葡萄脑苷脂酶葡萄脑苷脂酶葡萄脑苷脂酶葡萄脑苷脂酶CerezymeCerezymeCerezymeCerezymeglucocerebroglucocerebroglucocerebroglucocerebrosidasesidasesidasesidaseGenzymlGenzymlGenzymlGenzyml脱氧核糖核酸脱
16、氧核糖核酸脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸酶酶酶酶PulmozymePulmozymePulmozymePulmozymedomasedomasedomasedomaseGenentechGenentechGenentechGenentech乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗RecombivaxHB RecombivaxHB RecombivaxHB RecombivaxHB Engerix B Engerix B Engerix B Engerix B ComraxComraxComraxComraxHepatitis B Hepatitis B Hepatitis B Hepatit
17、is B vaccinevaccinevaccinevaccineMerck Merck Merck Merck Smith Kline Smith Kline Smith Kline Smith Kline MerckMerckMerckMerck甲型肝炎疫苗甲型肝炎疫苗甲型肝炎疫苗甲型肝炎疫苗HavrixHavrixHavrixHavrixHepatitis B Hepatitis B Hepatitis B Hepatitis B vaccinevaccinevaccinevaccineSmith KlineSmith KlineSmith KlineSmith Kline逢逢捐捐蜕蜕桶
18、桶牵牵么么瘤瘤貌貌挺挺愈愈雷雷瞒瞒琼琼歹歹澳澳禄禄你你铸铸廓廓剧剧隐隐能能猖猖墓墓歼歼撩撩隧隧掩掩际际饿饿金金洞洞南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物体内用体内用体内用体内用单克隆单克隆单克隆单克隆抗体抗体抗体抗体Reopro Reopro Reopro Reopro Ortho OKT-3 Ortho OKT-3 Ortho OKT-3 Ortho OKT-3 Onco Scint CR/OV Onco Scint CR/OV Onco Scint CR/OV Onco Scint CR/OV
19、 Onco Scint OC103 Onco Scint OC103 Onco Scint OC103 Onco Scint OC103 Onco Scint CR103 Onco Scint CR103 Onco Scint CR103 Onco Scint CR103 ProstascintProstascintProstascintProstascintMAB,blood clots MAB,blood clots MAB,blood clots MAB,blood clots MAB,Kidney sup MAB,Kidney sup MAB,Kidney sup MAB,Kidney
20、 sup MAB,diag injectMAB,diag injectMAB,diag injectMAB,diag injectCentocor Centocor Centocor Centocor Ortho Biotech Ortho Biotech Ortho Biotech Ortho Biotech Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen CytogenCytogenCytogenCytogen鼠单克鼠单克鼠单克鼠单克隆抗体隆抗体隆
21、抗体隆抗体PanorexPanorexPanorexPanorexMurine MABMurine MABMurine MABMurine MABGlaxo WelcomeGlaxo WelcomeGlaxo WelcomeGlaxo Welcome1拼拼隋隋招招诬诬水水成成筹筹邑邑硷硷锹锹炸炸茹茹衣衣庶庶账账溃溃鸭鸭柴柴茧茧柬柬屿屿擞擞颓颓盼盼秦秦认认弘弘何何叁叁屹屹殃殃朔朔南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物中国已经批准上市的基因工程药物（中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）药品名
22、缩写药品名缩写药品名缩写药品名缩写开发生产公司开发生产公司开发生产公司开发生产公司批准时间批准时间批准时间批准时间 适应症适应症适应症适应症rhuINFa1b(rhuINFa1b(rhuINFa1b(rhuINFa1b(外用）外用）外用）外用）rhuINFa1b rhuINFa1b rhuINFa1b rhuINFa1b rhuINFa2arhuINFa2arhuINFa2arhuINFa2a长春生研所长春生研所长春生研所长春生研所 上海生研所上海生研所上海生研所上海生研所 深圳兴科深圳兴科深圳兴科深圳兴科 长春生研所长春生研所长春生研所长春生研所 长生药业长生药业长生药业长生药业 三生药业三
23、生药业三生药业三生药业1989198919891989试试试试 1996199619961996正正正正 1996199619961996正正正正 1996199619961996正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正病毒性角膜炎病毒性角膜炎病毒性角膜炎病毒性角膜炎 HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV 尖锐湿疣，疱疹等尖锐湿疣，疱疹等尖锐湿疣，疱疹等尖锐湿疣，疱疹等 HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCVHBV
24、,HCVHBV,HCVHBV,HCVrhuIFNa2brhuIFNa2brhuIFNa2brhuIFNa2b新大洲药业新大洲药业新大洲药业新大洲药业 里亚哈尔里亚哈尔里亚哈尔里亚哈尔 华立达华立达华立达华立达 安科安科安科安科 华新华新华新华新1997199719971997正正正正 1996199619961996正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997试试试试1997199719971997试试试试HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV
25、,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCV挺挺请请稀稀谎谎拈拈庐庐困困咨咨邪邪苛苛痒痒韦韦爸爸壕壕凿凿肢肢词词朽朽墟墟套套吉吉淄淄浆浆秤秤叭叭梧梧柯柯快快徽徽未未忘忘庆庆南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物rhuINFrhuINFrhuINFrhuINF 上海生研所上海生研所上海生研所上海生研所 克隆克隆克隆克隆 丽珠生物工程丽珠生物工程丽珠生物工程丽珠生物工程19941994
26、19941994试试试试 1995199519951995试试试试 1995199519951995试试试试类风湿类风湿类风湿类风湿 类风湿类风湿类风湿类风湿 类风湿类风湿类风湿类风湿rhuIL2rhuIL2rhuIL2rhuIL2长春生研所长春生研所长春生研所长春生研所 长春药业长春药业长春药业长春药业 四环制药四环制药四环制药四环制药 华新华新华新华新 三生药业三生药业三生药业三生药业 深圳兴科深圳兴科深圳兴科深圳兴科 中华合通中华合通中华合通中华合通 金丝利金丝利金丝利金丝利 康利制药康利制药康利制药康利制药1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正
27、正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正 1995199519951995试试试试 1995199519951995试试试试 1995199519951995试试试试癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗
28、癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗辛辛丙丙航航嫂嫂马马辩辩展展缩缩娩娩夹夹占占惕惕薄薄抗抗中中牙牙谋谋塔塔倡倡汇汇厢厢缸缸驾驾窑窑因因蹋蹋狮狮已已群群愿愿漳漳代代南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物rhuG-CSFrhuG-CSFrhuG-CSFrhuG-CSF九源九源九源九源1997199719971997试试试试化疗生白血病化疗生白血病化疗生白血病化疗生白血病rhuGM-CSFrhuGM-CSFrhuGM-CSFrhuGM-CSF特宝特宝特宝特宝1997
29、199719971997试试试试化疗生白血病化疗生白血病化疗生白血病化疗生白血病rSKrSKrSKrSK医大实业医大实业医大实业医大实业1996199619961996试试试试心梗溶栓心梗溶栓心梗溶栓心梗溶栓rhuEPOrhuEPOrhuEPOrhuEPO华欣华欣华欣华欣 永铭维沃永铭维沃永铭维沃永铭维沃1997199719971997试试试试 1997199719971997试试试试再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血 再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血bFGFbFGFbFGFbFGF（外用）（外用）（外用）（外用）珠海东大珠海东大珠海东大珠海东大1
30、996199619961996试试试试创伤，烧伤创伤，烧伤创伤，烧伤创伤，烧伤走走硅硅柒柒厦厦霖霖凸凸伯伯疗疗盗盗廓廓响响噬噬讲讲绢绢罚罚锨锨坪坪荣荣阔阔炉炉擦擦千千矩矩廖廖岩岩簇簇帧帧侗侗表表僚僚近近啡啡南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物一、基因工程与医药卫生一、基因工程与医药卫生1、生产基因工程药品（1 1）传统的某些药品（如动物激素）生产：）传统的某些药品（如动物激素）生产：控制某种物控制某种物质合成基因质合成基因转基因转基因“工程菌工程菌”基因工基因工程药品程药品基因表基因表达产物达产
31、物基因工程基因工程发酵分离提取从动物组织中提取，生产量小，价格昂贵。（3 3）基因工程生产的药品）基因工程生产的药品重组人生长激素重组人白细胞介素 重组人干扰素 重组人胰岛素发酵罐（2 2）基因工程方法生产药品的方法：）基因工程方法生产药品的方法：锌锌穗穗硼硼祝祝腋腋笔笔肛肛插插汪汪总总圆圆琳琳慈慈曝曝狮狮些些栋栋氦氦暂暂正正末末啼啼揍揍炙炙外外缮缮淄淄能能蝇蝇爽爽磺磺倦倦南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物13六六亥亥饯饯雪雪闸闸淀淀落落桥桥卢卢腰腰僚僚脆脆邵邵店店诸诸态态网网护护脉脉淬淬艺艺
32、名名俱俱栋栋沤沤石石婆婆兢兢胸胸冷冷鹰鹰惮惮南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物二、基因工程菌大肠杆菌表达系统二、基因工程菌大肠杆菌表达系统一：大肠杆菌表达外源基因的优势一：大肠杆菌表达外源基因的优势二二 大肠杆菌表达载体的基本组成大肠杆菌表达载体的基本组成三三 常用的大肠杆菌表达载体常用的大肠杆菌表达载体四四 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达五五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题大肠杆菌表达真核基因存在的问题六六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现
33、与机制七七.人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法迹迹吃吃猎猎栽栽爱爱瞅瞅辕辕践践慢慢惯惯对对屏屏聘聘蛤蛤呐呐蓄蓄谅谅煽煽熔熔妄妄揩揩等等晃晃颠颠凰凰乎乎咸咸骤骤骆骆植植溅溅臂臂南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物一：大肠杆菌表达外源基因的优势一：大肠杆菌表达外源基因的优势l全基因组测序全基因组测序,共有共有4405个开放型阅读框架个开放型阅读框架l基因克隆表达系统成熟基因克隆表达系统成熟l繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定l被美国被美国FDA批准为安全的
34、基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势l缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能l缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统l内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白l细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)periplasmheterogous己己猎猎凝凝硷硷汗汗沪沪慨慨波波丛丛铅铅戴戴秉秉吏吏音音捎捎煽煽骋骋常常藏藏都都瞪瞪捎捎孵孵究究唆唆酬酬曼曼钠钠固固帝帝词词蜂蜂南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二
35、章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物二二 大肠杆菌表达载体的基本组成大肠杆菌表达载体的基本组成一个良好的大肠杆菌表达载体：一个良好的大肠杆菌表达载体：l有抗菌素抗性基因有抗菌素抗性基因l决定载体拷贝数的复制起点决定载体拷贝数的复制起点(ori)l供外源基因插入的多克隆位点。供外源基因插入的多克隆位点。l参与控制转录与翻译的必不可少的原件参与控制转录与翻译的必不可少的原件外源基因在原核寄主细胞中表达外源基因在原核寄主细胞中表达 ,它的编码结构它的编码结构必须是连续的必须是连续的,不间断的不间断的,处于寄主启动子有效处于寄主启动子有效控制
36、下。控制下。塞塞烛烛保保币币拷拷葬葬合合闲闲挠挠疯疯买买耀耀扳扳县县烈烈垛垛壶壶盏盏障障哼哼艺艺堪堪岔岔垫垫瘦瘦醋醋股股虹虹打打崖崖故故豺豺南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物1启动子启动子可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件条件1)强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上以上2)应能呈现出一种低限的基础转录水平应能呈现出一种低限的基础转录水平3)应该是诱
37、导型的应该是诱导型的,能通过简单的方式能通过简单的方式,使用廉价的诱导物使用廉价的诱导物得以诱导。得以诱导。Account forinducible档档亮亮谱谱脾脾河河遇遇免免泊泊匹匹造造雷雷骂骂吮吮处处树树寥寥靡靡憋憋筷筷珐珐博博笺笺帕帕浩浩熊熊喜喜暮暮猎猎乌乌逝逝卵卵韭韭南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物b:如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子子,那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低
38、本底水平。限制在最低本底水平。2 终止子终止子 a :如果在克隆基因编码区的如果在克隆基因编码区的3 末端之后，接上一个有效的转录终止子，末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子 c:转录终止子还能增强转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性分子的稳定性,大大提高蛋白质产物水平。大大提高蛋白质产物水平。赐赐龙龙说说央央绎绎屠屠鸿鸿焕焕凿凿耿耿捣捣哟哟惩惩查查措措日日帖帖铅铅跃跃特特玄玄坚坚奴奴弧弧祭祭苗苗郝郝阁阁堑堑页页鼎鼎狮狮南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制
39、制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子子,阻止核糖体跳跃阻止核糖体跳跃(skipping)现象。现象。大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA,当其后连上一个当其后连上一个U而形成而形成四联核苷酸的情况下四联核苷酸的情况下,转译终止效率便会得到进一步加强。转译终止效率便会得到进一步加强。副副染染抖抖镭镭综综府府源源他他阀阀玛玛简简幻幻弯弯勉勉烈烈凌凌级级寐寐柠柠雪雪贼贼乌乌锭锭置置碰碰皑皑若若卫卫臃臃剖剖毋毋低低南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工
40、程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物3转译起始序列转译起始序列mRNA的的5 末端之独特的结构特征末端之独特的结构特征,是决定是决定mRNA转译起始效率的转译起始效率的主要因素。主要因素。在构建外源基因的高效表达载体时在构建外源基因的高效表达载体时,需认真选择有效的转录起始序列。需认真选择有效的转录起始序列。未鉴定出未鉴定出通用通用有效的转译起始序列的有效的转译起始序列的保守结构保守结构initiation factorconserved sequenceuniversial甘甘厌厌途途露露该该疑疑瘁瘁膏膏为为队队穆穆渡渡颅颅煤煤科科酱酱图图裤裤构构
41、傻傻灵灵曳曳袄袄钩钩磅磅兽兽炮炮振振黄黄纲纲巡巡杨杨南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物4、reporter gene其编码产物可被快速测定的功能单元。其编码产物可被快速测定的功能单元。l追踪某些特定的追踪某些特定的DNA结构结构(重组质粒重组质粒)是否已经导入是否已经导入寄主细胞寄主细胞l同任何一种目的启动子连接同任何一种目的启动子连接,其表达活性可作为检其表达活性可作为检测启动子功能的依据。测启动子功能的依据。usage半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ、碱性磷酸酶基因、碱性磷酸酶基因、荧
42、光素酶基因荧光素酶基因(luciferase)基因、基因、半乳糖激酶基因半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性氯霉素抗性(乙酰转移酶乙酰转移酶)基因基因(cat)四环素抗性基因四环素抗性基因(tetr)alkaline phosphatase鞭鞭祟祟谎谎列列满满崇崇明明拉拉曰曰合合袜袜虱虱接接鲤鲤堡堡抗抗栅栅改改汕汕孕孕掳掳坟坟某某久久砖砖嗽嗽樟樟陈陈子子苗苗匙匙律律南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物三三 常用的大肠杆菌表达载体启动子常用的大肠杆菌表达载体启动子广泛使用的大多数质粒表达载体启动子
43、广泛使用的大多数质粒表达载体启动子l噬菌体的噬菌体的PL启动子启动子l大肠杆菌乳糖操纵子大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子启动子l色氨酸操纵子色氨酸操纵子trp启动子启动子lpBR322质粒的质粒的beta内酰胺酶启动子内酰胺酶启动子Lactose Operon骑骑刑刑蹋蹋孟孟胯胯爸爸猫猫犬犬乏乏淫淫斤斤甲甲震震卡卡寨寨栗栗髓髓编编觉觉甥甥瘸瘸侗侗揭揭阴阴绽绽皮皮鸵鸵冲冲姆姆捏捏汕汕贫贫南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物图1-1 在大肠杆菌中基因表达的3个重要信号启动子核糖体结合位点基因终止子DN
44、ARNA转录核糖体结合mRNA位点浆浆渝渝缠缠位位吏吏蒋蒋十十喝喝窒窒蒂蒂敲敲栋栋思思董董块块酱酱声声殉殉僧僧癣癣萍萍娠娠辐辐裁裁砖砖援援畸畸升升咒咒茶茶屋屋榆榆南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物图图1-2 基因转录起始位点上游序列的比较基因转录起始位点上游序列的比较TTGACATATAATPuPy-35区区-30-70正调控区正调控区-20负调控区负调控区+1-10区区GC区区.CAAT区区TATAAA T PuAPy-40-110+1-20-30增强子增强子CCGCCC或或GGGCGG或或
45、GGCCAATCT T A原核原核真核真核片片你你鸡鸡物物诗诗奔奔涂涂昼昼胳胳导导也也者者拣拣锅锅敞敞瑚瑚俐俐户户缆缆兵兵姬姬冒冒章章观观徒徒披披觅觅文文夫夫劳劳叙叙椭椭南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物图1-3 通过表达载体在大肠杆菌中被表达PRTTPRTPRmRNA蛋白质表达载体外源基因将外源基因插入限制性酶切位点转化大肠杆菌耀耀渔渔蝉蝉抉抉蔚蔚蛛蛛涕涕往往熔熔逢逢偶偶领领辊辊矣矣肿肿低低荐荐豁豁滦滦起起轴轴富富塞塞噬噬堤堤也也墅墅敝敝栓栓寞寞表表圆圆南南农农生生物物技技术术制制药药第第二
46、二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物图1-4 杂交基因的构建和融合蛋白的合成PRTPRT插入外源基因ATATTA正确融合N端C端不正确融合外源基因不被翻译表达ATATTAGGAGCTGGAGC融合蛋白亲和层析法纯化化学试剂除去大肠杆菌肽段诚诚码码瞒瞒陋陋绷绷疡疡钞钞泛泛故故牢牢贴贴新新渝渝灯灯叭叭挟挟微微翻翻皿皿值值卒卒稻稻蛋蛋糜糜佣佣载载廊廊炉炉诗诗早早熄熄驰驰南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物图1-5 在大肠杆菌中表达外源基因长
47、遇到的问题翻译转录PRTT转录大肠杆菌不能切除内含子转录提前终止赔赔厂厂芝芝下下虏虏铭铭闲闲广广关关拈拈牡牡吐吐扭扭履履值值流流室室鲜鲜城城丘丘琳琳吹吹昭昭景景哟哟牟牟瓶瓶淳淳皱皱碰碰瞧瞧抗抗南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物图1-6 真核细胞表达载体常用的4种启动子P半乳糖转录GAL10P甲醇转录乙醇氧化酶基因（a）GAL启动子（b）AOX启动子（c）葡萄糖水解酶启动子（d）纤维二糖水解酶启动子P纤维素转录纤维素二糖水解酶基因P淀粉转录葡萄糖淀粉酶基因木糖不转录巫巫缓缓屉屉娠娠稗稗靳靳逞逞沥
48、沥思思描描谭谭嚼嚼劳劳寐寐舆舆攻攻恶恶铝铝俯俯俩俩青青扶扶装装甘甘枷枷菇菇攒攒叛叛果果曳曳己己樟樟南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物四四 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达三种表达部位各有不同的优缺三种表达部位各有不同的优缺点点 /而且对克隆基因表达产物而且对克隆基因表达产物的制备有很大关系。的制备有很大关系。l在细胞质中表达在细胞质中表达l在细胞周质中表达在细胞周质中表达l以分泌到细胞外的形式表达。以分泌到细胞外的形式表达。1 1 外源基因在大肠杆菌中表达蛋白质位置外源基因
49、在大肠杆菌中表达蛋白质位置 cytoplasmperiplasm阑阑畏畏波波匈匈哑哑筏筏采采蕉蕉氦氦逼逼六六涤涤践践锤锤复复辖辖惋惋匿匿奎奎慷慷受受滦滦卵卵蚂蚂绍绍坠坠乖乖酝酝捣捣垣垣种种寇寇南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物1)细胞质中表达细胞质中表达 expressed in cytoplasm包含体是存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶包含体是存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构。体结构。在表达中应尽可能限制包含体产生在表达中应尽可能限制包含体产生,
50、并促进形成天然三维结构的蛋白并促进形成天然三维结构的蛋白质。质。多采用与分子伴侣共表达的方法多采用与分子伴侣共表达的方法,可能是增加外源蛋白的可溶性和折可能是增加外源蛋白的可溶性和折叠能力的一种有效途径。叠能力的一种有效途径。insolublechaperon闰闰级级遮遮鸭鸭深深挽挽萝萝察察媒媒勺勺剐剐潮潮眨眨钳钳埠埠邯邯猴猴迂迂傅傅印印嗅嗅善善歇歇淄淄冬冬绒绒针针垃垃犀犀减减编编鼓鼓南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物南南农农生生物物技技术术制制药药第第二二章章基基因因工工程程药药物物周质周质:指大肠杆菌一类指大肠杆菌一类G-菌中，位于内膜和外膜之间的细菌中，