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1、第二章、基因工程制药第二章、基因工程制药第一节、概述第一节、概述 现代生物技术是一项与医药产业相互结合极为密切的高技术。1982年，第一个基因重组产品人胰岛素在美国问世。基因工程药物主要是医用活性蛋白和多肽类：基因工程药物主要是医用活性蛋白和多肽类：免疫蛋白、细胞因子、激素、酶类等免疫蛋白、细胞因子、激素、酶类等 优点优点:大量生产、应用临床、大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足深入研究、扩大应用、改造不足 。基因工程技术生产药品的优点：基因工程技术生产药品的优点：a.a.可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的保障
2、；白质，为临床使用提供有效的保障；b.b.可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；的应用范围；c.c.利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源 性生理活性物质；性生理活性物质；d.d.内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；e.e.利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛利用
3、基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。选来源。第二节、基因工程药物生产的过程第二节、基因工程药物生产的过程基因工程技术基因工程技术：将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程细菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。噬菌体遗传学噬菌体遗传学限制酶的发现限制酶的发现质粒载体质粒载体细菌抗药性遗传学细菌抗药性遗传学噬菌体载体噬菌体载体DNA合成与修复合成与修复细菌基因细菌基因调节研究调节研究外源外源DNA插入载体插入载体动物病毒学动物病毒学细菌表达载体细菌表达载体构建基因文库构建基因文库哺乳动物表哺乳动物表达载体达载体大规模的
4、蛋白合成大规模的蛋白合成克隆特定克隆特定的基因的基因制备探制备探针针反转录病毒反转录病毒和反转录酶和反转录酶mRNA结构与结构与代谢的研究代谢的研究 寡核苷酸合成寡核苷酸合成蛋白序列分析蛋白序列分析小鼠胚胎学小鼠胚胎学插入生殖细胞插入生殖细胞定点突变改定点突变改变基因结构变基因结构功能分析功能分析序列分析序列分析 DNA序序列分析列分析RNA序序列分析列分析基因工程的诞生与及其相关学科的关系基因工程药物制药的主要程序目的基因的克隆，目的基因的克隆，构建构建DNADNA重组体，重组体，DNADNA重组体转入宿主菌，重组体转入宿主菌，构建工程菌，构建工程菌，工程菌发酵，工程菌发酵，表达产物的分离纯
5、化，表达产物的分离纯化，产品的检验等。产品的检验等。基因工程药物的制备流程 基因工程药物生产的基本过程基因工程药物生产的基本过程 基因工程药物的生产分为基因工程药物的生产分为上游上游和和下游下游两两个阶段个阶段 上游阶段上游阶段：主要是分离主要是分离目的基因目的基因、构建、构建工程菌工程菌(细胞细胞)。下游阶段下游阶段：从工程菌的大量培养一直从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制到产品的分离纯化和质量控制。基因工程药物的上游技术：基因工程药物的上游技术：1 1、基因克隆载体、基因克隆载体:质粒载体，质粒载体，2 2、重组、重组DNADNA技术的有关工具酶及其应用技术的有关工具酶及其应
6、用 3 3、核酸制备技术：制备纯净、高质量的、核酸制备技术：制备纯净、高质量的 载体载体DNADNA和和待克隆的待克隆的 核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作。连接等分子克隆操作。三、目的基因的获得三、目的基因的获得问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什么不能进行直接分离？的目的基因，为什么不能进行直接分离？目的基因的获取途径：目的基因的获取途径：1 1、逆转录法、逆转录法 逆转录法就是分离纯化目的基因的逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNAmRNA，再，再反转录成反转录成cDN
7、AcDNA，然后进行，然后进行cDNAcDNA 克隆表达。克隆表达。（1 1）、）、mRNA purificationmRNA purification（mRNAmRNA 纯化）纯化）a.a.细胞内细胞内RNARNA的组成和含量的组成和含量:DNA:95%DNA:95%核内，核内，5 5细胞器细胞器 RNARNA：7575细胞质，细胞质，10%10%核内，核内，15%15%细胞器细胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%;rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5%mRNA1-5%b.b.真核细胞真核细胞mRNA mRNA 的特点及分离纯化方法。的特点及分离纯化方法。3
8、 3-polyA-polyA（20-250AAA20-250AAA）-oligo(dToligo(dT)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT AAAAA AAAAAOligo(dT)纤维素纤维素Poly(A)-Oligo(dT)100mM NaCl洗脱rRNA/tRNA10mM Tris1mM EDTAPoly(A)mRNATotal RNA纤维素柱纯化纤维素柱纯化Poly(A)mRNAPoly(A)mRNA 流程图流程图（2 2）、）、cDNAcDNA第一链的合成：一次好的逆转第一链的合成：一次好的逆转录反应可使录反应可使oligo(dToligo(dT)选出的选出的mRNAmR
9、NA有有5 530%30%被被拷贝。拷贝。（3 3）、）、cDNAcDNA第二链的合成；第二链的合成；反应在反应在DNADNA聚合酶聚合酶I I催化下完成催化下完成(4)、cDNA cloning；质粒DNA：expression vector pUC ，pBR322噬菌体DNA:gt11,gt11等。基因工程基本过程：基因工程基本过程：双重旋转对称的结构双重旋转对称的结构或称回文序列或称回文序列(palindrome)(palindrome)。(5)(5)、将重组体导入、将重组体导入host cellhost cell(6)(6)、cDNAcDNA library identificatio
10、n library identification（cDNAcDNA 文库的鉴定）文库的鉴定）(7)(7)、目的、目的cDNAcDNA 克隆的分离和鉴定（限制酶图谱的绘克隆的分离和鉴定（限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。）转录方向、转录起始点等。）2 2、反转录、反转录聚合酶链反应法聚合酶链反应法mRNAmRNA经反转录合成经反转录合成cDNAcDNA第一链，不需要再第一链，不需要再合成合成cDNAcDNA链，用于重组、克隆。链，用于重组、克隆。3 3、化学合成法、化学合成法 较小的蛋白质和多肽的编码基
11、因可以用较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。人工化学合成法获得。化学合成法有个先化学合成法有个先决条件是：决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出再按相应的密码子推导出DNADNA的碱基系列。的碱基系列。方法方法：合成目的基因：合成目的基因DNADNA不同部位的不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的端形成粘性末端的DNADNA双链片段，然后将双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接这些双
12、链片段按正确的次序进行退火连接成较长的成较长的DNADNA片段，再用连接酶连接成完片段，再用连接酶连接成完整的基因。整的基因。人工化学合成基因的限制人工化学合成基因的限制：a.a.不能合成太长的基因。最长不能合成太长的基因。最长50-60bp.50-60bp.只只适用于克隆小分子肽的基因。适用于克隆小分子肽的基因。b.b.人工合成基因时，遗传密码的简并会为人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难，选择密码子带来很大困难，如用氨基酸顺如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完然基因不完 全一致，易造成中性突变。全一致，易造成中性
13、突变。c.c.费用太高。费用太高。筛选基因的其他方法筛选基因的其他方法1 1 编码序列富集法编码序列富集法2 2 岛屿获救岛屿获救PCRPCR法法*CpGCpG岛岛 CpGCpG岛（岛（CpGCpG islandsislands）是指）是指DNADNA上一个区域，上一个区域，此区域含有大量相联的胞嘧啶（此区域含有大量相联的胞嘧啶（C C）、）、鸟鸟嘌呤嘌呤（G G），以及使两者相连的磷酸酯键（），以及使两者相连的磷酸酯键（p p）。哺乳）。哺乳类基因中的类基因中的启启动子上，含有约动子上，含有约40%40%的的CpGCpG岛（人类岛（人类约约70%70%）。一般）。一般CpGCpG岛的长度约岛
14、的长度约300300到到30003000个碱基对个碱基对（bpbp）。）。常用的正式定义是指一个至少含有常用的正式定义是指一个至少含有200bp200bp的区域，的区域，其中其中GCGC所佔比例超过所佔比例超过50%50%，且，且CpGCpG的观察值预的观察值预测值比例必须高於测值比例必须高於0.60.6。*持家基因持家基因(house-keeping gene)(house-keeping gene)*AluAlu序列序列 AluAlu重复序列是哺乳动物基因组中重复序列是哺乳动物基因组中SINESINE家族的家族的一员，约有一员，约有5050万份拷贝。也就是说平均万份拷贝。也就是说平均4 4
15、6 kb6 kb中中就有一个就有一个AluAlu序列。由于这种序列。由于这种DNADNA序列中有限制性序列中有限制性内切核酸酶内切核酸酶AluAlu工的识别序列工的识别序列AGCTAGCT，所以称为，所以称为AluAlu重复序列。重复序列。3 3 动物杂交法动物杂交法4 4 功能克隆法功能克隆法依赖于基因表达产物和生物学功能的基因克隆法。依赖于基因表达产物和生物学功能的基因克隆法。5 5 构建构建cDNAcDNA文库文库6 6 差异显示技术差异显示技术第四节、第四节、基因表达 基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程转录、翻译以及所有加工过程。基因高效表达基因高效表达
16、是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。产物。进行基因表达研究的主要问题进行基因表达研究的主要问题是目的是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。纯化。因此，建立最佳的基因表达体因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。系，是基因表达设计的关键。1 1、宿主细胞的选择 （1 1）、宿主细胞的基本要求）、
17、宿主细胞的基本要求：容易获得较高浓度的细胞；容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；不致病、不产生内毒素；发热量低，需氧低，适当的发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行代谢调控；容易进行容易进行DNADNA技术操作；技术操作；产物的产量、产率高，产物的产量、产率高，且易提取纯化。且易提取纯化。宿主细胞的宿主细胞的 分类分类 原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；杆菌、链霉菌等；真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺
18、乳动物细胞。乳动物细胞。(1)(1)、原核细胞、原核细胞 a:a:大肠杆菌：表达产物的形式大肠杆菌：表达产物的形式,细胞内不溶细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。会带来完全不同的杂质。、大肠杆菌中的表达不存在信号、大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故产品多为胞内产物，提肽，故产品多为胞内产物，提 取时需取时需破碎细胞，此时细胞质内其他蛋白也破碎细胞，此时细胞质内其他蛋白也释放出来，因而造成
19、提取困难。释放出来，因而造成提取困难。、由于分泌能力不足，真核蛋白、由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体质常形成不溶性的包含体(inclusion(inclusion body)body)，表达产物必须在下游处理过程，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性。物活性。包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞 内凝集，形成无活性的固体颗粒。内凝集，形成无活性的固体颗粒。特点特点:、在大肠杆菌中表达在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰不存在翻译后修饰作用作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此，故对蛋白质产物不能糖基化
20、，因此，只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白质，在应用上受到有生物功能的真核蛋白质，在应用上受到一定的限制。一定的限制。由于翻译常从甲硫氨酸的由于翻译常从甲硫氨酸的AUGAUG密码子密码子开始，故目的蛋白质的开始，故目的蛋白质的N N端常多余一个端常多余一个甲硫甲硫氨酸残基氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌，容易引起免疫反应。大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。酶而破坏目的蛋白质。b:b:枯草芽孢杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产枯草芽孢杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌
21、到培养液中，不形成包含体。该物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很菌也不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此，它的应用也受到限制。降解，因此，它的应用也受到限制。C:C:链霉菌链霉菌：重要的工业微生物。特点是重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。有糖基化能力，可做理想的受体菌。(2)真核细胞a:酵母酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养
22、，繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成功。功。b:b:丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖译后加工
23、，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的（如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。发酵和后处理工艺。*哺乳动物细胞哺乳动物细胞 由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或 类似于天然产物。类似于天然产物。但动物细胞生产慢，生产率低，但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用
24、高，培养液浓度较稀。而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。虽然从理论上讲，各种微生物都可以用于基因虽然从理论上讲，各种微生物都可以用于基因表达，但由于克隆载体、表达，但由于克隆载体、DNADNA导入方法以及遗传导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌仍然背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。是大肠杆菌和酿酒酵母。2 2、大肠杆菌体系中的基因表达、大肠杆菌体系中的基因表达（1 1）表达载体）表达载体真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件：真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件：载体能够独立复制。载体本身是一个复制子，载体能够独立复制。载体本身是
25、一个复制子，具有复制起点。具有复制起点。严谨型：严谨型：1-31-3个拷贝个拷贝 松弛型：可达松弛型：可达30003000个个应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。利于外源基因的克隆鉴定和筛选。应具有很强的启动子，能为大肠杆菌应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNARNA聚合聚合酶所识别。酶所识别。应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。导时才能进行转录。应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的产生的mRNAmRNA较为稳
26、定。较为稳定。所产生的所产生的mRNAmRNA必须具有翻译的起始信号必须具有翻译的起始信号 AUG AUG和和SDSD序列，以便转录后顺利翻译。序列，以便转录后顺利翻译。质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB8及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。常用表达载体常用表达载体-质粒质粒pBV220pBV220的结构的结构pBV2
27、20pBV220系统国内使用最多的载体系统国内使用最多的载体,其组成其组成:来源于来源于pUC8pUC8多克隆位点多克隆位点核糖体核糖体rrnBrrnB基因终止信号基因终止信号pBR322pBR322第第4225422537353735位位pUC18pUC18第第20662066680680位位噬菌体噬菌体cIts857cIts857抑制子基因及抑制子基因及P PR R启动子启动子pRC23pRC23的的P PL L启动子及启动子及SDSD序列序列cIts857cIts857抑制子基因抑制子基因P PL L启动子同在一个载体上，启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较可以转
28、化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。低的宿主细胞，使表达产物不易降解。SDSD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始ATGATG的外源基因，可表达非融合蛋白；的外源基因，可表达非融合蛋白；pBV220系统优点：系统优点：SD序列（序列（Shine-Dalgarnosequence）：）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序中用于结合原核生物核糖体的序列。列。SD序列在细菌序列在细菌mRNA起始密码子起始密码子AUG上游上游10个碱基左右处，有一段富个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列含嘌呤的碱基序列（5AGGAGG3），能与细菌），
29、能与细菌16SrRNA3端识别，帮助从起始端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。处开始翻译。强的转录终止信号可防止出现强的转录终止信号可防止出现“通读通读”现现象，有利于质粒象，有利于质粒-宿主系统的稳定；宿主系统的稳定；整个质粒仅为整个质粒仅为3.66kb3.66kb，有利于增加其拷贝数，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因；及容量，可以插入大片段外源基因；PRPR和和PLPL启动子串联，可以增强启动作用；启动子串联，可以增强启动作用；本系统宿主菌可以是大肠杆菌本系统宿主菌可以是大肠杆菌HB101HB101、JM103JM103、C600C600，质粒拷贝数较多，因此小量简，质粒拷
30、贝数较多，因此小量简便快速提取即可满足需要。便快速提取即可满足需要。本系统为温度诱导，外源基因表达量可达本系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的细胞总蛋白的20%20%30%30%；产物以包含体形式存在产物以包含体形式存在,不易降解不易降解,均一性好；均一性好；pBG-2pBG-2是由是由pBV220pBV220系统衍生的便于产物纯系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。化的融合表达载体。该质粒在该质粒在PRPLPRPL启动子下游插入启动子下游插入proteinGproteinG的的IgGFcIgGFc结合区基因片段结合区基因片段180180个碱基对，下游是个碱基对，下游是多克隆位点，引
31、入剪切融合蛋白具有与多克隆位点，引入剪切融合蛋白具有与IgGIgG结合的活性，可用亲和层析。简化下游工艺。结合的活性，可用亲和层析。简化下游工艺。融合表达质粒融合表达质粒pBG-2pBG-2的结构的结构(2)pET(2)pET系统系统 插入基因的转录和翻译系统来源于插入基因的转录和翻译系统来源于T7T7噬菌体。噬菌体。表达由位于宿主细胞染色体上的表达由位于宿主细胞染色体上的T7-RNAT7-RNA上宿主细上宿主细胞染色体上的胞染色体上的T7-RNAT7-RNA聚合酶控制，聚合酶控制，T7-RNAT7-RNA聚合酶聚合酶启动子为启动子为lacUV5,lacUV5,由由IPTGIPTG诱导。诱导。
32、表达载体表达载体 pET-5a pET-5a 是典型的是典型的 pETpET 载体，载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入其组成是在载体的基本结构的基础上加入了了 T7 T7 噬菌体启动子序列及其下游的几个酶噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。大肠杆菌中 T7 启动子表达调控模式图。Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因
33、结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。pETpET系统多克隆位点上有系统多克隆位点上有NdeINdeI或或NcoNco I I单一单一切点，切开的粘黏末端后三位为切点，切开的粘黏末端后三位为ATGATG，可直接，可直接插入插入ATGATG的外源基因。的
34、外源基因。不带不带ATGATG的外源基因，质粒切开以后以的外源基因，质粒切开以后以KlenowKlenow酶补平，再与外源基因连接，进行表达。酶补平，再与外源基因连接，进行表达。影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于：单个细胞产量取决于：外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数 外源基因的表达效率外源基因的表达效率 启动子的强弱启动子的强弱常用的强启动子包括常用的强启动子包括lac、trp、tac、PL、bla 核糖体接合位点的有效性核糖体接合位点的有效
35、性 SDSD序列和起始密码序列和起始密码ATGATG的间距的间距 密码子组成密码子组成 表达产物的稳定性表达产物的稳定性 细胞代谢负荷细胞代谢负荷 工程菌的培养条件工程菌的培养条件真核基因在大真核基因在大 肠杆菌中的表达形式肠杆菌中的表达形式 以融合蛋白的形式表达药物基因以融合蛋白的形式表达药物基因 以以原核多肽原核多肽和和真核蛋白真核蛋白结合在一起称融合蛋白。结合在一起称融合蛋白。优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；定，易实现高效表达；缺点：只能作抗原用。缺点：只能作抗原用。以非融合蛋白的形式表达药物基因以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融
36、合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的白的mRNAmRNA的的AUGAUG为起始，在其氨基端为起始，在其氨基端不含细菌多肽序不含细菌多肽序列列。优点：保持原有蛋白活性；优点：保持原有蛋白活性；缺点：易被蛋白酶破坏。缺点：易被蛋白酶破坏。分泌型表达药物基因分泌型表达药物基因 外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下游。外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下游。常用的信号肽有常用的信号肽有碱性磷酸酶信号肽，膜外周质碱性磷酸酶信号肽，膜外周质蛋白信号肽，霍乱弧菌毒素蛋白信号肽，霍乱弧菌毒素B B亚单位等。亚单位等。优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸优点
37、：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸 残基；残基；缺点：产量不高，缺点：产量不高，信号肽不被切割。信号肽不被切割。三、酵母中的基因表达三、酵母中的基因表达 表达载体表达载体 酵母载体可以携带外源基因在酵母细胞内保酵母载体可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代存和复制，并随酵母分裂传递到子代DNADNA和和RNARNA单位。单位。根据载体中来自酵母的复制序列可分四类：根据载体中来自酵母的复制序列可分四类：YepYep类（类（yeast yeast episomalepisomal plasmid plasmid，酵母附加体质粒）酵母附加体质粒）YRpYRp类（类（yeast
38、 replication plasmidyeast replication plasmid，酵母复制型质粒）酵母复制型质粒）YCpYCp类（类（yeast yeast centromericcentromeric plasmid plasmid，酵母着丝粒质粒）酵母着丝粒质粒）YIpYIp类（类（yeast integrative plasmidyeast integrative plasmid，酵母整合型质粒）酵母整合型质粒）2 2、克隆载体克隆载体 向酵母载体中引入大肠杆菌质粒向酵母载体中引入大肠杆菌质粒pBR322pBR322的的oriori部分和部分和AmprAmpr或或TetrTet
39、r部分，构成部分，构成的载体同时带有细菌和酵母的复制原点和选的载体同时带有细菌和酵母的复制原点和选择标记。择标记。3 3、表达载体、表达载体 普通表达载体：方便引入外源序列普通表达载体：方便引入外源序列 精确表达载体：精确表达载体：影响目的基因影响目的基因在酵母菌中表达的因素在酵母菌中表达的因素外源基因的拷贝数（剂量）外源基因的拷贝数（剂量）外源基因的表达效率外源基因的表达效率 启动子启动子分泌信号的效率分泌信号的效率终止序列的影响终止序列的影响外源蛋白的糖基化外源蛋白的糖基化宿主菌株的影响宿主菌株的影响 菌体生长力强菌体生长力强 菌体内源蛋白酶要较弱菌体内源蛋白酶要较弱 菌体性能稳定菌体性能
40、稳定 分泌能力强分泌能力强*动物细胞中的基因表达动物细胞中的基因表达 外源基因的表达产物可由重组转化的细胞外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人工控制，分泌到培养液中，培养液成分完全由人工控制，从而使产物纯化变得容易。基因产物是糖基化从而使产物纯化变得容易。基因产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生长慢，单位体积的生产率但动物细胞生长慢，单位体积的生产率低，培养条件苛刻，费用高。目前用于表达外低，培养条件苛刻，费用高。目前用于表达外源基因的细胞均为传代细胞。源基因的细胞均为传代细胞。表达体系表达体系 产产 物物 产生部位产生
41、部位 培养方式培养方式 提提 纯纯 产物活性产物活性 潜在危潜在危性性大肠杆菌大肠杆菌 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 一般一般 对原核好对原核好 不大不大 融合蛋白质融合蛋白质 部分高产部分高产 对真核差对真核差 酵酵 母母 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 菌体内菌体内 真核的接近真核的接近 不大不大 糖基化蛋白糖基化蛋白 外分泌外分泌 可高产可高产 稍复杂稍复杂 天然产物天然产物 哺乳动物哺乳动物 完完 整整 外分泌外分泌 较难成本高较难成本高 简单简单 可达天然可达天然 需注意需注意 糖基化蛋白糖基化蛋白 可高产可高产 产物产物 致癌致癌主要基因工程表达体系比
42、较主要基因工程表达体系比较表达系统表达系统O-糖基化糖基化寡聚甘露糖寡聚甘露糖高甘露糖高甘露糖复合体复合体大肠杆菌大肠杆菌0000酿酒酵母酿酒酵母0 昆虫昆虫Sf90仓鼠仓鼠CHO0仓鼠仓鼠BHK0鼠杂交瘤鼠杂交瘤0鼠骨髓瘤鼠骨髓瘤0C1270J558L0人淋巴细胞人淋巴细胞00Namalwa0人鼠杂交瘤人鼠杂交瘤0大肠杆菌大肠杆菌酵母酵母哺乳动物细胞哺乳动物细胞产物浓度产物浓度高高高高低低分子量分子量低低高高高高二硫键二硫键有限有限不受限制不受限制不受限制不受限制分泌分泌无无有或无有或无有有形式形式包涵体包涵体单链，天然单链，天然单链，天然单链，天然折叠折叠不正确不正确正确正确正确正确糖基化
43、糖基化无无可能可能完全完全逆转录病毒逆转录病毒无无无无可能可能热原热原可能可能无无无无培养特点培养特点容易容易容易容易较难，成本高较难，成本高分离纯化分离纯化复杂复杂复杂复杂简单简单五、基因工程菌五、基因工程菌生长代谢的特点生长代谢的特点1 1、菌体生长于能量的关系、菌体生长于能量的关系 碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的会产生乙酸，导致培养基的pHpH值下降，从而影值下降，从而影响菌体的生
44、长。适当提高响菌体的生长。适当提高pHpH，可减少乙酸的抑，可减少乙酸的抑制作用制作用 分批培养中选择不同的碳源，连续培养中分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。产生。2 2、菌体生长和前体供应的关系、菌体生长和前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。能使菌体比生长率提高
45、，蛋白合成增加。基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低。低。质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（5656拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。高拷贝质粒的工程菌（高拷贝质粒的工程菌（240240拷贝）中，生长拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，
46、从而产生量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧严紧反应反应”有关。有关。“严紧反应严紧反应”：是当氨酰是当氨酰tRNAtRNA不足时不足时,核糖体在密码子上停留核糖体在密码子上停留,并合成被称为并合成被称为魔点魔点的的ppGppppGpp的结果。的结果。ppGppppGpp(ppGppppGpp也叫也叫 鸟苷四磷酸鸟苷四磷酸(3;5(3;5各自连各自连接两个磷酸接两个磷酸),),其中代表其中代表P P磷酸磷酸,G,G代表鸟苷代表鸟苷.鸟苷也就鸟苷也就是鸟嘌呤核苷是鸟嘌呤核苷 )是一个重要的调控分子。它通过影是一个重要的调控分子。它通过影响响RNARNA链的延深过程减少转录。链的延深过程减少转
47、录。它的浓度增加会导致在合成它的浓度增加会导致在合成mRNAmRNA和和rRNArRNA时时RNARNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNARNA链延链延长速度减慢，使游离的长速度减慢，使游离的RNARNA聚合酶浓度降低，聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如严紧控制的启动子如rRNArRNA等的转录减少。等的转录减少。也可能也可能ppGppppGpp是通过干扰是通过干扰RNARNA聚合酶与聚合酶与PLPL启启动子专一识别反应。动子专一识别反应。1 1、质粒不稳定性、质粒不稳定性a a、分裂不稳定：、分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含指工程菌分裂时出现一定比例
48、不含质粒子代菌的现象。质粒子代菌的现象。(常见常见)b、结构不稳定：、结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。致工程菌性能的改变。工程菌的质粒不稳定因素：工程菌的质粒不稳定因素：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；二是二是这两种菌这两种菌的比生长速率差异的大小。的比生长速率差异的大小。六、六、基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法样品样品不含抗性标记抗生素不含抗性标记抗生素 平平 板板 培培 养基养基10-12h10-12h100100个菌落
49、个菌落含抗性标记抗生素含抗性标记抗生素平平 板板 培培 养养 基基 10-12h10-12h统计生长菌落数统计生长菌落数重复三次重复三次,计算比值计算比值 (稳定性稳定性stability)stability)对同一工程菌，通过控制不同的比生长速率可以改变对同一工程菌，通过控制不同的比生长速率可以改变质粒的拷贝数：含质粒的拷贝数：含低拷贝质粒的工程菌低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子产生不含质粒子代菌的频率较大，增加质粒拷贝数能提高质粒的稳定性；代菌的频率较大，增加质粒拷贝数能提高质粒的稳定性；含含高拷贝质粒高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量
50、外源质粒的存在使含质粒菌的工程菌的较低，但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产比生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，对质粒的稳生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，对质粒的稳定性不利。定性不利。二、提高质粒稳定性的方法二、提高质粒稳定性的方法1 1、选择合适的宿主菌、选择合适的宿主菌2 2、选择合适的载体、选择合适的载体3 3、选选择压力、选选择压力4 4、分阶段控制培养、分阶段控制培养5 5、控制培养条件、控制培养条件6 6、固定化、固定化第七节第七节 基因工程菌中试基因工程菌中试 基因工程菌