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1、第三节第三节 基因工程制药生产的基本过程基因工程制药生产的基本过程一、工具酶的分离纯化一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源三、外源DNADNA和目的基因的分离和获得和目的基因的分离和获得四、外源四、外源DNADNA与载体与载体DNADNA的切割与连接的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点七、基因工程菌中试七、基因工程菌中试八、基因工程菌的扩增和发酵生产八、基因工程菌的扩增和发酵生产九、基因工程药物的分离和纯化技术九、基因工程药物的分离和纯化技术十、变性蛋
2、白的复性十、变性蛋白的复性十一、基因工程药物的质量控制十一、基因工程药物的质量控制十二、基因工程药物的制造实例十二、基因工程药物的制造实例五、宿主细胞的选择和基因导入操作五、宿主细胞的选择和基因导入操作 体外重组的体外重组的DNADNA分子分子，如果不引入到宿主细胞，则无法显，如果不引入到宿主细胞，则无法显示其生命力，而只是表现出示其生命力，而只是表现出纯粹的试剂性质纯粹的试剂性质。随着时间的。随着时间的推移而推移而逐渐失活逐渐失活。（一）宿主细胞的选择（一）宿主细胞的选择（二）具体的转移技术（二）具体的转移技术（三）大肠杆菌中的基因导入和表达（三）大肠杆菌中的基因导入和表达（四）酵母菌中的基
3、因导入和表达（四）酵母菌中的基因导入和表达（五）动物细胞中的基因导入和表达（五）动物细胞中的基因导入和表达（一）宿主细胞的选择（一）宿主细胞的选择1 1、宿主细胞应满足的条件、宿主细胞应满足的条件2 2、宿主细胞的类型、宿主细胞的类型1 1、宿主细胞应满足的条件、宿主细胞应满足的条件（1 1）容易获得较高浓度的细胞。）容易获得较高浓度的细胞。（2 2）能够利用廉价原料进行生产。）能够利用廉价原料进行生产。（3 3）不致病。不致病。（4 4）不产生内毒素不产生内毒素。（5 5）发热量低。）发热量低。（6 6）需氧低。）需氧低。（7 7）具有一定的细胞形态。）具有一定的细胞形态。（8 8）需有适当
4、的发酵浓度。）需有适当的发酵浓度。（9 9）容易进行代谢调控。容易进行代谢调控。（1010）容易进行容易进行DNADNA重组技术操作。重组技术操作。（1111）产物的产量稳定、产率高。产物的产量稳定、产率高。（1212）产物容易提取和纯化。产物容易提取和纯化。2 2、宿主细胞的类型、宿主细胞的类型 原核细胞类：原核细胞类：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。真核细胞类真核细胞类：酵母菌、丝状真菌、动物细胞、昆虫细：酵母菌、丝状真菌、动物细胞、昆虫细 胞和植物细胞。胞和植物细胞。（1 1）大肠杆菌）大肠杆菌（2 2）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌（3 3）链霉菌）链霉菌（
5、4 4）酵母菌）酵母菌（5 5）丝状真菌）丝状真菌（6 6）动物细胞）动物细胞（1 1）大肠杆菌）大肠杆菌优点：优点：（1 1）生长迅速、大规模发酵经济生长迅速、大规模发酵经济。（2 2）分子遗传结构清楚、操作简单分子遗传结构清楚、操作简单。（3 3）基因工程研究中采用最多的表达体系。基因工程研究中采用最多的表达体系。缺点：缺点：（1 1）表达产物多为）表达产物多为胞内物质胞内物质，提取时需破碎细胞。，提取时需破碎细胞。（2 2）细胞破碎时，细胞质内的其它蛋白质也会释放出）细胞破碎时，细胞质内的其它蛋白质也会释放出 来，形成杂质。给提取带来困难。来，形成杂质。给提取带来困难。（3 3）所表达的
6、真核蛋白质在其体内常形成）所表达的真核蛋白质在其体内常形成包含体包含体，在，在提取后必须经过变性、复性处理才能恢复生物活性。提取后必须经过变性、复性处理才能恢复生物活性。（4 4）大肠杆菌中不存在翻译后修饰系统，）大肠杆菌中不存在翻译后修饰系统，不能不能对蛋白对蛋白产物进行产物进行糖基化及磷酸化糖基化及磷酸化等修饰。等修饰。（5 5）大肠杆菌内的）大肠杆菌内的蛋白酶蛋白酶会对目的蛋白造成破坏。会对目的蛋白造成破坏。（6 6）大肠杆菌会）大肠杆菌会产生内毒素产生内毒素，难去除。，难去除。至至2004年，年，FDA共批准了大肠杆菌表达的基共批准了大肠杆菌表达的基因重组生物技术药物因重组生物技术药物
7、18种种：重组人甲状旁腺激素、胰岛素、生物激素、重组人甲状旁腺激素、胰岛素、生物激素、白介素、干扰素等主要为细胞因子类药物。白介素、干扰素等主要为细胞因子类药物。（2 2）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌优点：优点：（1 1）分泌能力很强分泌能力很强，可以将蛋白质产物，可以将蛋白质产物直接分直接分泌到培养液中泌到培养液中。（2 2）不会形成包含体不会形成包含体。缺点：缺点：（1 1）不能使蛋白质产物糖基化不能使蛋白质产物糖基化。（2 2）枯草芽孢杆菌具有很强的）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶胞外蛋白酶分泌分泌系统，常常对蛋白质产物造成系统，常常对蛋白质产物造成破坏破坏。（3 3）链霉菌）链霉菌优点
8、：优点：（1 1）不致病，）不致病，（2 2）使用）使用安全安全，（3 3）分泌分泌能力强，能力强，（4 4）可将培养产物直接分泌到培养液中，）可将培养产物直接分泌到培养液中，（5 5）具有）具有糖基化糖基化能力能力 近年来，作为外源基因表达体系，正日益受到人近年来，作为外源基因表达体系，正日益受到人们的重视。们的重视。（4 4）酵母菌）酵母菌 酿酒酵母酿酒酵母研究最为透彻。干扰素和乙肝表面抗原基因在研究最为透彻。干扰素和乙肝表面抗原基因在酵母菌中进行克隆和表达。酵母菌中进行克隆和表达。优点：优点：（1 1）是研究基因表达调控）是研究基因表达调控最有效最有效的单细胞真核生物，的单细胞真核生物，
9、（2 2）其基因组小、繁殖迅速、可以利用廉价材料进行）其基因组小、繁殖迅速、可以利用廉价材料进行大规模培养，大规模培养，（3 3）无毒性，）无毒性，（4 4）基因工程操作简单，）基因工程操作简单，（5 5）表达的蛋白质产物能够直接）表达的蛋白质产物能够直接分泌分泌出细胞外，出细胞外，（6 6）能够对蛋白质产物）能够对蛋白质产物进行糖基化进行糖基化，（7 7）真核基因在酵母中表达良好。）真核基因在酵母中表达良好。至至2004年，年，FDA共批准了酵母表达的基因重共批准了酵母表达的基因重组生物技术药物组生物技术药物8种种：胰高血糖素、巨细胞集落刺激因子、乙肝疫胰高血糖素、巨细胞集落刺激因子、乙肝疫
10、苗、胰岛素（苗、胰岛素（Novolin）、水蛭素等。）、水蛭素等。虽然酵母表达系统表达的蛋白质有糖基化修虽然酵母表达系统表达的蛋白质有糖基化修饰，但是饰，但是糖链结构和组成与天然糖蛋白相差糖链结构和组成与天然糖蛋白相差甚远，甚远，对于那些糖链极大影响生物活性的蛋对于那些糖链极大影响生物活性的蛋白质，如白质，如EPO、治疗性抗体等，仍不能用酵、治疗性抗体等，仍不能用酵母表达系统表达。母表达系统表达。（5 5）丝状真菌）丝状真菌 曲霉被认为一种安全菌株、并且已经对它形成了曲霉被认为一种安全菌株、并且已经对它形成了成熟的发酵和后处理工艺。成熟的发酵和后处理工艺。n优点：优点：（1 1）有很强的）有很
11、强的蛋白质分泌能力蛋白质分泌能力，（2 2）能正确地进行）能正确地进行翻译后的加工翻译后的加工，如进行，如进行糖基化糖基化、肽剪切。肽剪切。（6 6）动物细胞）动物细胞优点：优点：（1 1）表达产物可以）表达产物可以分泌分泌到培养液中，到培养液中，（2 2）培养液成份完全由人所控制，）培养液成份完全由人所控制，（3 3）所分泌的基因产物）所分泌的基因产物接近于天然产物接近于天然产物，（4 4）产物容易得到提纯。）产物容易得到提纯。缺点：缺点：（1 1）生产）生产慢慢、（2 2）生产率）生产率低低、（3 3）培养条件苛刻、费用）培养条件苛刻、费用高高，（4 4）培养液浓度较）培养液浓度较稀稀。至
12、至2004年，年，FDA共批准了哺乳动物细胞表达共批准了哺乳动物细胞表达的基因重组生物技术药物的基因重组生物技术药物53种，其中激素类种，其中激素类5种，酶种，酶7种，细胞因子种，细胞因子7种，凝血因子种，凝血因子5种，种，治疗性抗体治疗性抗体17种种。表达体系表达体系 产产 物物 产生部位产生部位 培养方式培养方式 提提 纯纯 产物活性产物活性 潜在危性潜在危性大肠杆菌大肠杆菌 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 一般一般 对原核好对原核好 不大不大 融合蛋白质融合蛋白质 部分高产部分高产 对真核差对真核差 酵酵 母母 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 菌体内菌体内 真
13、核的接近真核的接近 不大不大 糖基化蛋白糖基化蛋白 外分泌外分泌 可高产可高产 稍复杂稍复杂 天然产物天然产物 哺乳动物哺乳动物 完完 整整 外分泌外分泌 较难成本高较难成本高 简单简单 可达天然可达天然 需注意需注意 糖基化蛋白糖基化蛋白 可高产可高产 产物产物 致癌致癌主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较（二）具体的转移技术（二）具体的转移技术1 1、转化作用、转化作用2 2、转导作用、转导作用1 1、转化作用、转化作用（1 1）基本概念）基本概念（2 2）转化作用的特性）转化作用的特性（3 3）感受态细胞）感受态细胞（4 4）人工感受态细胞）人工感受态细胞（5 5）转化程序）
14、转化程序（6 6）影响转化的因素）影响转化的因素（1 1）基本概念）基本概念转化转化(transformation)：以质粒为载体构建的重组以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞分子导入原核细胞的过程的过程.（2 2）转化作用的特性）转化作用的特性（1 1）是自然界经常发生的现象之一。）是自然界经常发生的现象之一。（2 2）转化作用的）转化作用的前提条件前提条件是宿主细胞必须转是宿主细胞必须转变为变为感受态细胞感受态细胞。（3 3）转化作用的先决条件是要获得携带目的）转化作用的先决条件是要获得携带目的基因的重组基因的重组DNADNA分子。分子。（3 3）感受态细胞）感受态细胞感受态感受态
15、(competent)(competent):指细胞在一定的生理状指细胞在一定的生理状态可摄取外源性遗传物质经体内重组成为染色态可摄取外源性遗传物质经体内重组成为染色体中的一部分体中的一部分,导致受体细胞某些遗传性状的导致受体细胞某些遗传性状的改变。改变。（4 4）人工感受态细胞）人工感受态细胞在基因工程中，宿主细胞经过人工处理，最后在基因工程中，宿主细胞经过人工处理，最后成为感受态细胞，称为人工感受态细胞。成为感受态细胞，称为人工感受态细胞。所有所有生物细胞均可处理成人工感受态细胞。生物细胞均可处理成人工感受态细胞。制备人工感受态细胞的方法：制备人工感受态细胞的方法：（1）将）将对数生长期细
16、胞对数生长期细胞于低温、于低温、低渗的低渗的CaCl2溶液中处理，就可成为感受态细胞。溶液中处理，就可成为感受态细胞。（2）用）用MgCl2、CsCl、LiCl、或者是多价阳、或者是多价阳离子离子DETE-Sephadex处理，改变细胞膜结构，处理，改变细胞膜结构，也能成为感受态细胞。也能成为感受态细胞。55转转化化程程序序 大肠杆菌大肠杆菌E.coli培养至培养至对数生长期对数生长期取取20ml，悬浮于，悬浮于0.1MCaCl2离心，收集沉淀的原生质球。离心，收集沉淀的原生质球。再悬浮于再悬浮于0.1MCaCl2加入加入2-3ug重组的重组的DNA，混匀，混匀0放置放置30min42，90s
17、冰浴冰浴5min离心，收集沉淀的细胞离心，收集沉淀的细胞将细胞涂于选择性培养基上，进行培养将细胞涂于选择性培养基上，进行培养根据菌落特性，筛选出根据菌落特性，筛选出基因工程菌基因工程菌（6 6）影响转化的因素）影响转化的因素 重组重组DNA转化率很低，在转化率很低，在0.1%左右。影响因素：左右。影响因素：（1）宿主的）宿主的限制酶限制酶对外源性重组对外源性重组DNA的限制作的限制作用，会大大降低转化率，用，会大大降低转化率，（2）宿主细胞的）宿主细胞的人工感受态人工感受态形成率，会影响转化形成率，会影响转化率，率，（3）重组）重组DNA的构型的构型与转化率有一定的关系，与转化率有一定的关系，
18、环状环状DNA的转化率要比的转化率要比线性线性DNA高出高出10-100倍，倍，（4）外源基因与宿主）外源基因与宿主DNA和同源性越高，其转和同源性越高，其转化率也越高。化率也越高。（5）重组）重组DNA的的浓度浓度越高、其转化率也越高，越高、其转化率也越高，DNA的的纯度纯度越高、其转化率也越高。越高、其转化率也越高。转化过程总结示意图2 2、转导作用、转导作用（1 1）基本概念）基本概念（2 2）转导条件）转导条件（3 3）转导程序）转导程序（4 4）转导作用分类）转导作用分类（1 1）基本概念）基本概念 自然界中，通过噬菌体或者病毒自然界中，通过噬菌体或者病毒的感染作用，将一个细胞的遗传
19、的感染作用，将一个细胞的遗传信息传递到另一个细胞的过程，信息传递到另一个细胞的过程，称为称为转导（转导（transductiontransduction）。感受态细胞吸收以噬菌体、病毒感受态细胞吸收以噬菌体、病毒为载体的重组为载体的重组DNADNA的过程称为的过程称为转染转染(transfection)(transfection)。也属于转导作。也属于转导作用。用。自然界许多温和噬菌体都具有转自然界许多温和噬菌体都具有转导功能。导功能。（2 2）转导条件）转导条件 体外体外重组的重组的DNADNA，要通过，要通过转导转导途径进入宿主途径进入宿主细胞，必须经过细胞，必须经过蛋白质包装蛋白质包装的
20、环节，的环节，DNA+DNA+噬菌体头部蛋白噬菌体头部蛋白 +噬菌体尾部蛋白噬菌体尾部蛋白形成形成完整的噬菌体颗粒完整的噬菌体颗粒，才具有，才具有感染感染能力。能力。（3 3）转导程序）转导程序AA、蛋白质体外包装程序、蛋白质体外包装程序BB、转导程序、转导程序AA、蛋白质体外包装程序、蛋白质体外包装程序蛋白质的体外包装是通过蛋白质的体外包装是通过互补作用互补作用实现的。实现的。噬菌体的噬菌体的D基因基因、E基因基因是是表达蛋白质的主要基因。表达蛋白质的主要基因。（1 1）D D基因所表达的蛋白质占基因所表达的蛋白质占20%20%、D D基因突变，在基因突变，在宿主体内产生大量头部蛋白。宿主体
21、内产生大量头部蛋白。（2 2）E E基因所表达的蛋白质占基因所表达的蛋白质占78%78%、E E基因突变，在基因突变，在宿主体内产生大量头尾蛋白。宿主体内产生大量头尾蛋白。BB、转导程序、转导程序 用于制备包装蛋白质的宿主细胞用于制备包装蛋白质的宿主细胞-cI857-cI857大大肠杆菌肠杆菌E.coliE.coli、BHB2690BHB2690、BHB2688BHB2688。D D基因突变型宿主基因突变型宿主BHB2690BHB2690培养、并且进行溶菌处理，培养、并且进行溶菌处理，提提取取DNA-dDNA-d+外源性目的基因外源性目的基因DNADNA+E E基因突变型宿主基因突变型宿主BH
22、B2688BHB2688培培养、并且进行溶菌处理，养、并且进行溶菌处理，提取提取DNA-eDNA-e 温育温育,包装成完整的包装成完整的外源基因外源基因-噬菌体重组颗粒噬菌体重组颗粒。（具。（具有再感染能力）有再感染能力）去感染大肠杆菌去感染大肠杆菌E.coliE.coli完成转导完成转导（4 4）转导作用分类）转导作用分类 （1 1）限制性转导作用）限制性转导作用-由由温和的噬菌体或者病温和的噬菌体或者病毒毒DNADNA为载体为载体所构成的重组所构成的重组DNADNA，经过体外包装，经过体外包装，形成完整的噬菌体或者病毒颗粒，所进行的转导形成完整的噬菌体或者病毒颗粒，所进行的转导作用称为作用
23、称为限制性转导限制性转导。（2 2）广义性转导作用）广义性转导作用-任意任意DNADNA片段片段，或者重组，或者重组的的DNADNA，经过体外包装成噬菌体颗粒，所进行的转，经过体外包装成噬菌体颗粒，所进行的转导作用称为广义性转导。导作用称为广义性转导。3 3、脂质体介导的融合作用、脂质体介导的融合作用（1 1）定义）定义（2 2）脂质体的特性）脂质体的特性（3 3）脂质体介导融合的步骤）脂质体介导融合的步骤（4 4）脂质体介导的应用）脂质体介导的应用（1 1）定义）定义 将重组的将重组的DNADNA分子包埋于分子包埋于脂质体微囊之中，通过脂质体微囊之中，通过脂质体微囊与宿主细胞脂质体微囊与宿主
24、细胞的融合作用，而将外源的融合作用，而将外源性目的基因转移到宿主性目的基因转移到宿主细胞内的过程称为细胞内的过程称为脂质脂质体介导的融合作用体介导的融合作用。（2 2）脂质体的特性）脂质体的特性脂质体：脂质体：人工构建的由磷脂双分子层组成的膜状人工构建的由磷脂双分子层组成的膜状结构。结构。原理：受体细胞的细胞膜表面带负电荷，脂质体原理：受体细胞的细胞膜表面带负电荷，脂质体颗颗粒带正电荷，利用引力作用，把粒带正电荷，利用引力作用，把DNA、mRNA及单链及单链RNA等导入细胞内等导入细胞内主要适用于真核细胞主要适用于真核细胞,可对基因进行瞬时表达和可对基因进行瞬时表达和稳定表达。稳定表达。（3
25、3）脂质体介导融合的步骤）脂质体介导融合的步骤分为分为2 2步：步：（A A）人工脂质体的制备）人工脂质体的制备（B B）脂质体与宿主细胞的融合）脂质体与宿主细胞的融合（A A）人工脂质体的制备）人工脂质体的制备在含有在含有重组重组DNADNA分子的水溶液中分子的水溶液中 +磷脂磷脂 +吐温吐温8080（乳化剂）（乳化剂）通过激烈搅拌或者超声波处理，将磷脂分散到水溶液之中通过激烈搅拌或者超声波处理，将磷脂分散到水溶液之中再经过静置，磷脂分子群聚形成液晶态脂质双层薄膜再经过静置，磷脂分子群聚形成液晶态脂质双层薄膜将将DNADNA包埋在薄膜之中形成包埋在薄膜之中形成微囊微囊。就是。就是人工脂质体人
26、工脂质体。（B B）脂质体与宿）脂质体与宿主细胞的融合主细胞的融合 将将脂质体微囊脂质体微囊与与宿主细宿主细胞胞混合，在混合，在PEGPEG、或者在、或者在其它其它促融剂促融剂的作用下，的作用下，经过一定条件就会产生经过一定条件就会产生融合作用，最终将重组融合作用，最终将重组DNADNA导入到宿主细胞之中。导入到宿主细胞之中。（4 4）脂质体介导的应用）脂质体介导的应用 对于一些微生物如对于一些微生物如放线菌细胞放线菌细胞，由于无法形成感，由于无法形成感受态，也就不能通过转化作用导入外源性受态，也就不能通过转化作用导入外源性DNADNA。但是，通过脂质体介导方法，就能实现脂质体与但是，通过脂质
27、体介导方法，就能实现脂质体与放线菌细胞之间的融合，来获得放线菌细胞之间的融合，来获得基因工程放线菌基因工程放线菌。n脂质体脂质体2000:Invitrogen,规格规格0.75ml/1.5ml报价报价1700元元/2900元元4 4、显微镜注射技术、显微镜注射技术 在特定的显微镜下，用在特定的显微镜下，用特制的特制的玻璃微管玻璃微管，将，将重组的重组的DNADNA直接注直接注射到宿主细胞内的方法。射到宿主细胞内的方法。显微镜注射技术是一种直接、显微镜注射技术是一种直接、简单、而又准确、可靠的简单、而又准确、可靠的DNADNA机机械转移技术。械转移技术。主要用于真核生物主要用于真核生物 是一种全
28、新的基因导入技术，它把是一种全新的基因导入技术，它把DNADNA包被在包被在金或钨的微粒中金或钨的微粒中，然后由基因枪将此包被颗，然后由基因枪将此包被颗粒转移到原位组织、细胞或细胞器中，是目粒转移到原位组织、细胞或细胞器中，是目前国际上最先进的基因导入技术。前国际上最先进的基因导入技术。基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、细菌及小型动物的转基因。具有快速、简便、细菌及小型动物的转基因。具有快速、简便、安全、高效的特点。安全、高效的特点。5 5、基因枪注射技术、基因枪注射技术基因枪注射技术基因枪注射技术利用脉冲电场提高细胞膜的利用脉冲电场提高细胞膜的利用脉
29、冲电场提高细胞膜的利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源通透性，从而使外源通透性，从而使外源通透性，从而使外源DNADNA转转转转移至细胞中。此法简单、效移至细胞中。此法简单、效移至细胞中。此法简单、效移至细胞中。此法简单、效率较高，率较高，率较高，率较高，几乎所有细胞都可几乎所有细胞都可几乎所有细胞都可几乎所有细胞都可用此技术用此技术用此技术用此技术，此方法转染的，此方法转染的，此方法转染的，此方法转染的DNADNA不仅是线性的，还可是不仅是线性的，还可是不仅是线性的，还可是不仅是线性的，还可是环状的。环状的。环状的。环状的。条件：电压：条件：电压：条件：电压：条件：电压：3003006
30、00V600V维持时间：维持时间：维持时间：维持时间：2020100ms100ms温度：温度：温度：温度：0 06 6、电穿孔技术、电穿孔技术7 7、磷酸钙、磷酸钙DNADNA共沉淀法基因转移技术共沉淀法基因转移技术此法受此法受此法受此法受二价金属离子能促进二价金属离子能促进二价金属离子能促进二价金属离子能促进细胞吸收外源细胞吸收外源细胞吸收外源细胞吸收外源DNADNA的启发而的启发而的启发而的启发而发展起来的。当核酸以发展起来的。当核酸以发展起来的。当核酸以发展起来的。当核酸以磷酸磷酸磷酸磷酸钙钙钙钙DNADNA共沉淀物共沉淀物共沉淀物共沉淀物的形式在的形式在的形式在的形式在时，细胞摄取时，
31、细胞摄取时，细胞摄取时，细胞摄取DNADNA的能力显的能力显的能力显的能力显著加强。但著加强。但著加强。但著加强。但转移效率较低转移效率较低转移效率较低转移效率较低，仅有仅有仅有仅有1%5%1%5%的外源的外源的外源的外源DNADNA可可可可进入受体细胞核中，约有进入受体细胞核中，约有进入受体细胞核中，约有进入受体细胞核中，约有1%DNA1%DNA可在细胞中稳定表可在细胞中稳定表可在细胞中稳定表可在细胞中稳定表达。达。达。达。8 8、病毒介导的生物、病毒介导的生物学方法学方法带有外源基因的逆转录带有外源基因的逆转录病毒或病毒或DNADNA病毒在包装细病毒在包装细胞内可形成完整的病毒胞内可形成完
32、整的病毒颗粒，并被释放到培养颗粒，并被释放到培养基中，感染基中，感染哺乳动物细哺乳动物细胞胞，能有效实现基因转，能有效实现基因转移。移。（三）大肠杆菌中的基因导入和表达（三）大肠杆菌中的基因导入和表达1 1、真核基因导入大肠杆菌所用的、真核基因导入大肠杆菌所用的载体载体2 2、真核基因导入大肠杆菌的具体、真核基因导入大肠杆菌的具体方式方式3 3、影响真核基因导入大肠杆菌的、影响真核基因导入大肠杆菌的因素因素1 1、真核基因导入大肠杆菌所用的载体、真核基因导入大肠杆菌所用的载体（1）pBV220（2）pETpBV220侯云德侯云德分子病毒学家分子病毒学家中国工中国工程院院士程院院士1.分离了我国
33、副流感病毒分离了我国副流感病毒、型型2.研制出包括研制出包括1b、2a、2b、等亚型的基因工程干扰素系等亚型的基因工程干扰素系列产品列产品3.成功组建原核高效表达载体成功组建原核高效表达载体pBV220系列系列及及pBV320系列系列通用型高效表达载体通用型高效表达载体 （1）pBV220 已经成功用于表达已经成功用于表达IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、LFNa、IFNr、TNF、G-CSF、GM-CSF等多种细胞等多种细胞因子。因子。AA、结构、结构 BB、优点、优点AA、结构、结构 pBV220共共3665bp。共由。共由6个部份组成：个部份组成：（1）pUC8的的MCS
34、（2）核糖体）核糖体rrnB终止信号终止信号（3）pBR322的第的第4252-3735位位（4）pUC-18的第的第2066-680位位（5）噬菌体噬菌体cIts抑制基因抑制基因+PR启动子启动子（6）pRC-23的的PL启动子启动子+SD序列序列。质粒质粒pBV220的结构框的结构框 ori-复制起始点复制起始点clts857-抑制子基因抑制子基因，在，在31时，时，其基因产物具有其基因产物具有阻抑阻抑PL活性，当温活性，当温度升高时，这种阻抑活性就丧失，度升高时，这种阻抑活性就丧失，PL开始指导合成开始指导合成mRNA。PR-启动子启动子1PL-启动子启动子2BglII、EcoRI、Sm
35、aI、BamHI、SalI、HindIII、PstI-限制酶切位限制酶切位点形成点形成多克隆区域多克隆区域，在此插入外源性，在此插入外源性目的基因。目的基因。RrnB-核糖体终止基因（核糖体终止基因（终止子终止子）PvuI-青霉素抗性基因青霉素抗性基因Ampr。BB、优点、优点（1 1）可转化任何菌株可转化任何菌株（2 2）能）能防止出现防止出现“通读通读”现象现象（3 3）质粒分子量很小，有利于）质粒分子量很小，有利于增加其拷贝数量增加其拷贝数量（4 4）能插入大片段的外源基因能插入大片段的外源基因（2 2）pET pET被认为是最有潜力的系统。来源于被认为是最有潜力的系统。来源于T7噬菌体
36、噬菌体。A、克隆宿主克隆宿主可用大肠杆菌可用大肠杆菌K12的的HB101、JM103等等细胞。细胞。pET克隆到宿主体内之后，不会造成宿主的克隆到宿主体内之后，不会造成宿主的细胞损伤。细胞损伤。B、表达受宿主细胞的、表达受宿主细胞的T7RNA聚合酶控制。聚合酶控制。表达宿表达宿主主为为BL21、DE30。表达菌在。表达菌在LB培养基、或在培养基、或在M9培养基中生长良好。培养基中生长良好。C、表达产物可以用金属络合物的方式进行分离，能、表达产物可以用金属络合物的方式进行分离，能够达到高纯度、高收率。够达到高纯度、高收率。MCSpET32a(+)以以T7lac作为作为启动子；启动子；pET32a
37、(+)还带有还带有T7.Tag和和His-Tag融合标融合标签签，此类标签可用于检，此类标签可用于检测和纯化相关目的蛋白；测和纯化相关目的蛋白；pET32a(+)上与目的基上与目的基因共表达的因共表达的硫氧还蛋白硫氧还蛋白可以促进二硫键形成，可以促进二硫键形成，增加目的蛋白可溶性，增加目的蛋白可溶性，便于分离纯化。便于分离纯化。2 2、真核基因导入大肠杆菌具体方式、真核基因导入大肠杆菌具体方式共有3种种方式（1 1）融合蛋白）融合蛋白（2 2）非融合蛋白）非融合蛋白（3 3）分泌型表达蛋白）分泌型表达蛋白（1 1）融合蛋白）融合蛋白AA、定义、定义BB、优缺点、优缺点CC、改进措施、改进措施D
38、D、融合蛋白的具体表达方式、融合蛋白的具体表达方式AA、定义、定义 是指产生的蛋白质同时含有是指产生的蛋白质同时含有细菌蛋白细菌蛋白+目的目的蛋白蛋白。融合蛋白的融合蛋白的氨基酸氨基酸端由大肠杆菌端由大肠杆菌原核基因原核基因编码编码、而、而羧基端羧基端则由则由真核基因编码真核基因编码。最终表达出来的蛋白质最终表达出来的蛋白质=1=1条原核多肽条原核多肽+1+1条真条真核多肽，称为融合蛋白。核多肽，称为融合蛋白。BB、优缺点、优缺点优点：优点：（1 1）蛋白质在细菌体内比较）蛋白质在细菌体内比较稳定稳定，不易被，不易被细菌的酶类所降解，细菌的酶类所降解，（2 2）容易实现）容易实现高效表达，高效
39、表达，（3 3）基因操作简便。）基因操作简便。缺点：缺点：由于蛋白质中含有细菌蛋白，会影响真核由于蛋白质中含有细菌蛋白，会影响真核蛋白的蛋白的免疫原性免疫原性，只能用作抗原，只能用作抗原,不能作为不能作为人体注射用药。人体注射用药。CC、改进措施、改进措施（1 1）在细菌蛋白和目的蛋白间加入）在细菌蛋白和目的蛋白间加入Ile-Glu-Ile-Glu-Gly-ArgGly-Arg，可被人体内的可被人体内的凝血因子凝血因子XaXa识别而切识别而切开。在体外，采用特异的蛋白酶（凝血因子开。在体外，采用特异的蛋白酶（凝血因子X X、胶原酶、肠激肽酶）对融合蛋白进行降解。胶原酶、肠激肽酶）对融合蛋白进行
40、降解。（2 2）在细菌蛋白和目的蛋白间加入）在细菌蛋白和目的蛋白间加入MetMet，CNBrCNBr可专一性识别可专一性识别MetMet并并切开切开，形成原核多肽，形成原核多肽+真真核蛋白质分子，从而获得具有生物活性的天核蛋白质分子，从而获得具有生物活性的天然真核蛋白质分子。然真核蛋白质分子。DD、融合蛋白的具体表达方式、融合蛋白的具体表达方式 融合基因融合基因-融合蛋白融合蛋白 基因结构为基因结构为“原核启动子原核启动子原核原核SDSD序列序列原原核结构基因片段核结构基因片段真核结构基因序列真核结构基因序列原核原核终止密码子终止密码子”（D1D1）融合表达载体的构建融合表达载体的构建（D2D
41、2）常用的融合蛋白（原核细菌表达的蛋白质）常用的融合蛋白（原核细菌表达的蛋白质）（D3D3）融合蛋白的融合蛋白的切除方法切除方法关键：关键：v融合蛋白与外源蛋白的融合蛋白与外源蛋白的阅读框阅读框要对齐要对齐v两个蛋白的结合位点的设计很重要，应便于下一步两个蛋白的结合位点的设计很重要，应便于下一步切除融合蛋白的操作。切除融合蛋白的操作。（D1D1）融合表达载体的构建融合表达载体的构建（D2D2）常用的融合蛋白（原核细菌表达蛋白质）常用的融合蛋白（原核细菌表达蛋白质）（D3）受体蛋白的受体蛋白的切除方法切除方法v化学断裂法：化学断裂法：溴化氰溴化氰（CNBr）-Met-（切点）（切点）-AAv酶促
42、断裂法：酶促断裂法：凝血因子凝血因子Xa，有蛋白酶活性，识别序，有蛋白酶活性，识别序列列:IleGluGlyArg-（切点）（切点）-AA（2 2）非融合蛋白）非融合蛋白A、定义、定义B、优缺点、优缺点C、具体表达方式、具体表达方式AA、定义、定义 非融合蛋白表达非融合蛋白表达方式是指工程菌大肠杆菌方式是指工程菌大肠杆菌进行蛋白质进行蛋白质翻译时翻译时，是以，是以真核生物真核生物的的mRNA的的AUG为为翻译起始点翻译起始点，最后表达出，最后表达出的蛋白质中的蛋白质中不含细菌蛋白不含细菌蛋白。非融合蛋白表达方式也称为非融合蛋白表达方式也称为包涵体型外源包涵体型外源蛋白的表达蛋白的表达。BB、优
43、缺点、优缺点优点优点-非融合蛋白能够较好地保持真核非融合蛋白能够较好地保持真核蛋白质的蛋白质的生物活性。生物活性。缺点：缺点：（1 1）容易被细菌体内的）容易被细菌体内的蛋白酶所破坏，蛋白酶所破坏，（2 2）非融合蛋白的）非融合蛋白的氨基端氨基端常常带有常常带有甲甲硫氨酸硫氨酸，在人体内用药时常常引起人体，在人体内用药时常常引起人体的的免疫反应。免疫反应。CC、非融合蛋白的具体表达方式、非融合蛋白的具体表达方式非融合蛋白表达方式可分为非融合蛋白表达方式可分为2 2种种：（C1C1）非融合基因）非融合基因非融合蛋白非融合蛋白（C2C2）融合基因）融合基因非融合蛋白非融合蛋白（C1C1）非融合基因
44、）非融合基因非融合蛋白非融合蛋白 基因结构为基因结构为“原核启动子原核启动子原核原核SD序列序列ATG真核结构基因序列真核结构基因序列原核终止密码子原核终止密码子”要求要求1 1：SD序列和序列和ATG之间的距离要合适，相差之间的距离要合适，相差2-3个碱基，其表达效率就大受影响。个碱基，其表达效率就大受影响。要求要求2 2：ATG和真核结构基因序列之间必须加接和真核结构基因序列之间必须加接人工接头，以保证人工接头，以保证ATG之后的真核基因不发生之后的真核基因不发生通读框架的改变。通读框架的改变。（C2C2）融合基因）融合基因非融合蛋白非融合蛋白 基因结构为基因结构为“原核启动子原核启动子原
45、核原核SD序列序列原核原核ATGTGATG（真核基因起始（真核基因起始结构）结构）真核结构基因序列真核结构基因序列原核终止原核终止密码子密码子”这一方式能够这一方式能够提高表达效率提高表达效率。（3 3）分泌型表达蛋白）分泌型表达蛋白A、定义、定义B、分泌蛋白表达的原理图示、分泌蛋白表达的原理图示C、常用的大肠杆菌信号肽、常用的大肠杆菌信号肽D、优缺点、优缺点A、定义定义 分泌型表达蛋白分泌型表达蛋白是利用是利用大肠杆菌的信号肽基大肠杆菌的信号肽基因因来构建分泌型表达系统，将外源基因接在来构建分泌型表达系统，将外源基因接在信号肽基因后，当表达的目的蛋白跟随着信信号肽基因后，当表达的目的蛋白跟随
46、着信号肽来到细胞周质，被号肽来到细胞周质，被细胞周质细胞周质中的中的信号肽信号肽酶酶识别而切除识别而切除,从而释放有生物活性的蛋白质。从而释放有生物活性的蛋白质。基因结构为基因结构为“原核启动子原核启动子原核原核SD序列序列原原核结构基因片段核结构基因片段细菌信号肽基因细菌信号肽基因真核结真核结构基因序列构基因序列原核终止密码子原核终止密码子”。BB、分泌蛋白表达的原理图示、分泌蛋白表达的原理图示C、常用的大肠杆菌信号肽常用的大肠杆菌信号肽碱性磷酸酶信号肽（碱性磷酸酶信号肽（phoA）膜外周质蛋白质信号肽（膜外周质蛋白质信号肽（OmpA）霍乱弧菌毒素霍乱弧菌毒素B亚单位（亚单位（CTXB）DD
47、、优缺点、优缺点优点：优点：（1 1）表达时没有活性的蛋白质，通过信号）表达时没有活性的蛋白质，通过信号肽切割，能产生有肽切割，能产生有生物活性的蛋白质生物活性的蛋白质，（2 2）分泌的蛋白质产物由于经过切割，不）分泌的蛋白质产物由于经过切割，不含起始密码含起始密码ATGATG所编码的甲硫氨酸，所编码的甲硫氨酸，不会引不会引起人体的免疫反应。起人体的免疫反应。缺点：缺点：（1 1）产量不高，）产量不高，（2 2）信号肽不进行切割或不能定点切割。）信号肽不进行切割或不能定点切割。3 3、影响真核基因在大肠杆菌表达的因素、影响真核基因在大肠杆菌表达的因素（1 1）外源基因的拷贝数量）外源基因的拷贝
48、数量（2 2）影响转录水平的因素）影响转录水平的因素 在目的基因上游，必须安装一个适当的在目的基因上游，必须安装一个适当的启启动子动子。常见的启动子有。常见的启动子有laclac、trptrp、tactac、blabla等。等。（3 3）影响翻译水平的因素）影响翻译水平的因素核糖体结合位点的有效性直接影响基因产物核糖体结合位点的有效性直接影响基因产物的表达。的表达。SDSD序列和真核基因起始密码序列和真核基因起始密码ATGATG间的间距，间的间距，会影响基因产物的表达。会影响基因产物的表达。mRNAmRNA的二级结构，特别是的二级结构，特别是5 5端的二级结构。端的二级结构。mRNAmRNA的
49、稳定性，通常它的半衰期为几秒的稳定性，通常它的半衰期为几秒-25min.25min.密码子偏爱性是影响翻译效率的重要因素。密码子偏爱性是影响翻译效率的重要因素。(4)(4)影响蛋白质水平的因素影响蛋白质水平的因素 表达产物的稳定性表达产物的稳定性 蛋白酶蛋白酶 降解降解 表达的蛋白质表达的蛋白质 蛋白质分子量越小，表达产物越不稳定蛋白质分子量越小，表达产物越不稳定 解决方案：解决方案：A A构建融合蛋白构建融合蛋白 B B利用信号肽利用信号肽 C C位点特异突变位点特异突变(p77(p77为例为例)D D蛋白酶缺陷型大肠杆菌蛋白酶缺陷型大肠杆菌细胞代谢负荷细胞代谢负荷减轻宿主细胞代谢负荷：减轻
50、宿主细胞代谢负荷：A A 细胞生长和外源基因表达分开细胞生长和外源基因表达分开B B 细胞生长与重组质粒复制分开细胞生长与重组质粒复制分开（5 5）工程菌的培养条件）工程菌的培养条件 温度温度 诱导剂浓度诱导剂浓度 诱导时间诱导时间（四）酵母菌中基因导入和表达（四）酵母菌中基因导入和表达 酵母菌的表达系统包括酵母菌的表达系统包括-载体，启载体，启动子等控制序列，宿主细胞。动子等控制序列，宿主细胞。1 1、载体、载体2 2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素、影响目的基因在酵母菌中表达的因素1 1、载体、载体（1 1）定义）定义（2 2）类别）类别（3 3）克隆载体）克隆载体（4 4）表达载体）表