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1、酵母核糖核酸的分离及组分鉴定酵母核糖核酸的分离及组分鉴定一、目的：一、目的：1.了解核酸的组分了解核酸的组分;2.掌握鉴定核酸组分的方法。掌握鉴定核酸组分的方法。二、原理：二、原理：酵母核酸中酵母核酸中RNA的含量较多。的含量较多。RNA可溶于碱溶液，可溶于碱溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到沉淀，由此即得到RNA的粗制品。的粗制品。核糖核酸含有核糖，嘌呤碱，嘧啶碱和磷酸各组分。核糖核酸含有核糖，嘌呤碱，嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出
2、上述组分的存在。的存在。1.乳乳钵钵2.150毫升毫升锥锥形瓶形瓶3.水浴水浴 4.量筒量筒5.吸管，滴管吸管，滴管6.试试管及管及试试管架管架7.烧烧杯，漏斗杯，漏斗8.离心机离心机酵母核糖核酸的分离及组分鉴定酵母核糖核酸的分离及组分鉴定三三、器材器材：1.0.04mol/L 氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 1000ml2.酸性乙醇溶液酸性乙醇溶液 500ml3.95%乙醇乙醇 1000ml4.乙醚乙醚 500ml5.3当量当量/升硫酸升硫酸 200ml6.浓氨水浓氨水 50ml7.0.1mol/L硝酸银溶液硝酸银溶液 50ml8.三氯化铁浓盐酸溶液三氯化铁浓盐酸溶液 80ml9.苔黑酚乙醇溶液苔
3、黑酚乙醇溶液 10ml10.酵母粉酵母粉四，试剂和材料：酵母核糖核酸的分离及组分鉴定酵母核糖核酸的分离及组分鉴定四、试剂与材料：四、试剂与材料：酵母核糖核酸的分离及组分鉴定酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 11.定磷试剂定磷试剂 50ml （1）17%硫酸：将硫酸：将17毫升浓硫酸（比重毫升浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到）缓缓加入到83毫升水中。毫升水中。（2）2.5%钼酸铵溶液：钼酸铵溶液：2.5g钼酸氨溶于钼酸氨溶于100ml水中。水中。（3）10%抗坏血酸溶液：抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于抗坏血酸溶于100ml水中，贮存棕色瓶保存。水中，贮存棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或
4、棕色则失效，需要纯化抗坏血酸。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效，需要纯化抗坏血酸。临用时将上述临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。种溶液与水按如下比例混合。17%硫酸：硫酸：2.5%钼酸铵溶液：钼酸铵溶液：10%抗坏血酸溶液：水抗坏血酸溶液：水=1：1：1：2（V:V）四、试剂与材料：四、试剂与材料：酵母核糖核酸的分离及组分鉴定酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 将将7.5g酵母酵母悬悬浮于浮于45毫升毫升0.04mol/L氢氢氧化氧化钠钠溶液中，并在乳溶液中，并在乳钵钵中中研磨均匀。将研磨均匀。将悬悬浮液浮液转转移至移至150ml锥锥形瓶中。在沸水浴上加形瓶中。在沸水浴上加热热30分
5、分钟钟后，后，冷却。离心（冷却。离心（3000转转/分）分）15分分钟钟将上清液将上清液缓缓倾缓缓倾入入15毫升酸性乙醇溶毫升酸性乙醇溶液中。注意要一液中。注意要一边搅边搅拌一拌一边缓缓倾边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀后，离心（入。待核糖核酸沉淀后，离心（3000转转/分）分）3分分钟钟。弃去清液。用。弃去清液。用95%乙醇洗乙醇洗涤涤沉淀沉淀2次，乙次，乙醚醚洗洗涤涤沉淀沉淀1次次后，沉淀在空气中干燥后，沉淀在空气中干燥。将提取的核酸，加入将提取的核酸，加入3当量当量/升的硫酸升的硫酸5ml，在沸水浴中加，在沸水浴中加热热10分分钟钟制成水解液并制成水解液并进进行行组组分的分的鉴鉴定。定。五，操
6、作方法：五、操作方法：五、操作方法：酵母核糖核酸的分离酵母核糖核酸的分离酵母核糖核酸的分离及组分鉴定酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 1.嘌嘌呤碱：呤碱：取水解液取水解液1ml加入加入过过量量浓浓氨水，然后加入氨水，然后加入约约1ml 1mol/L的硝酸的硝酸银银溶液，溶液，观观察有无察有无嘌嘌呤碱的呤碱的银银化合物的沉淀。化合物的沉淀。2.核糖：取核糖：取1支支试试管加入水解液管加入水解液1ml，三，三氯氯化化铁浓盐铁浓盐酸溶液酸溶液2毫升和毫升和苔黑酚乙醇溶液苔黑酚乙醇溶液0.2毫升。放沸水浴中毫升。放沸水浴中10分分钟钟。注意溶液是否。注意溶液是否变变成墨成墨绿绿色，色，说说明核糖的存在。明
7、核糖的存在。3.磷酸：取一支磷酸：取一支试试管，加入水解液管，加入水解液1ml和定磷和定磷试剂试剂1ml。在水浴中加。在水浴中加热热，观观察溶液是否察溶液是否变变成成蓝蓝色，色，说说明磷酸是否存在。明磷酸是否存在。五、操作方法：五、操作方法：酵母核糖核酸的组分鉴定酵母核糖核酸的组分鉴定酵母核糖核酸的分离及组分鉴定酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 (一）一）RNARNA的提取：的提取：酵母粉酵母粉7.57.5g g(减半减半)加加0.20.2NaOHNaOH4545mlml（减半）（减半）研磨均研磨均匀匀 悬浮液移至锥形瓶（悬浮液移至锥形瓶（100ml100ml）沸水浴沸水浴3030分分 离心离心1
8、515分（分（30003000转分）转分）取上请液取上请液 将将上请液缓缓倾上请液缓缓倾入入30mL30mL酸性乙醇溶液中，边加边搅拌，待核酸完全沉酸性乙醇溶液中，边加边搅拌，待核酸完全沉淀后淀后 离心取沉淀物离心取沉淀物（由于时间短，不做洗和抽，此（由于时间短，不做洗和抽，此沉淀物即为沉淀物即为RNARNA粗品，可做组分鉴定用）粗品，可做组分鉴定用）（二）（二）RNARNA的水解：的水解：按实验指导做（但不称按实验指导做（但不称RNARNA粗品）粗品）（三）（三）RNARNA组分鉴定：组分鉴定：按实验指导做（注意加量和高温按实验指导做（注意加量和高温水浴）水浴）操作方法（可两人合作、量减半）
9、操作方法（可两人合作、量减半）离心机离心机的的使用使用方法方法1 接通电源接通电源2 平衡平衡离心样品离心样品3.加入样品加入样品,关盖关盖4 设置时间设置时间5调节转速调节转速6.关机关机,开盖开盖,取出样品取出样品1 1离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。2 2离心管必须仔细平衡。离心管必须仔细平衡。3 3机内若不清洁，离心管要封口。机内若不清洁，离心管要封口。4 4必须慢启动，然后加速。必须慢启动，然后加速。5 5离心时不准开盖。离心时不准开盖。6 6不准用手刹车。不准用手刹车。使用离心机使用离心机的的注意事注意事项项实验报告：按常规实验报告：按常规