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1、酵母核糖核酸的分离及组分鉴定酵母核糖核酸的分离及组分鉴定目的与要求目的与要求1.了解稀碱法提取了解稀碱法提取RNA的原理、方法的原理、方法2.2.掌握核酸中掌握核酸中三大组分的鉴定方法三大组分的鉴定方法原原 理理v核糖核酸核糖核酸RNARNA：从细胞核和细胞质中分离出来的：从细胞核和细胞质中分离出来的化学物质。化学物质。在蛋白质合成和其他生化反应中起着重要作在蛋白质合成和其他生化反应中起着重要作用，用，RNARNA的结构和的结构和DNADNA的结构类似，都是由核苷酸的结构类似，都是由核苷酸按照一定顺序排列成的长链。按照一定顺序排列成的长链。RNA RNA可以分为信使可以分为信使RNARNA、转
2、运、转运RNARNA、核糖体、核糖体RNARNA以及其他类型的以及其他类型的RNARNA。磷酸磷酸碱基碱基戊糖戊糖酵母菌单细胞真菌酵母菌单细胞真菌酵母中主要成分是酵母中主要成分是10.0%)10.0%)，DNADNA%)%)。总总RNARNA的提取的提取:采用稀碱裂解法，乙醇沉淀采用稀碱裂解法，乙醇沉淀RNA,RNA,洗涤除洗涤除杂质；杂质；RNARNA组分鉴定组分鉴定:硫酸可使硫酸可使RNARNA水解，再分别鉴定水解，再分别鉴定1.1.核糖的鉴定核糖的鉴定苔黑酚苔黑酚(3,5(3,5二羟基甲苯二羟基甲苯)法法墨绿色墨绿色 2.2.碱基的鉴定碱基的鉴定嘌呤碱嘌呤碱嘌呤碱嘌呤碱+过量浓氨水过量浓
3、氨水+AgNOAgNO3 3 絮状嘌呤银化合物絮状嘌呤银化合物 3.3.磷酸的测定磷酸的测定定磷法定磷法(NHNH4 4)2 2MoOMoO4 4+H+H2 2SOSO4 4 H H2 2MoOMoO4 4+(NH+(NH4 4)2 2SOSO4 4 H H3 3POPO4 4+12H+12H2 2MoOMoO4 4 H H3 3P(MoP(Mo3 3O O1010)4 4+12H+12H2 2O+12HO+12H2 2O O H H3 3P(MoP(Mo3 3O O1010)4 4 Mo Mo2 2O O3 3MoOMoO3 3(钼蓝）钼蓝）试剂和器材试剂和器材 试试 剂：剂：M NaOHM
4、 NaOH；酸性乙醇溶液；酸性乙醇溶液,95%95%乙醇乙醇硫酸；硫酸；浓氨水，硝酸银；浓氨水，硝酸银；三氯化铁浓盐溶液三氯化铁浓盐溶液 ,苔黑酚乙醇；苔黑酚乙醇；定磷试剂定磷试剂 器器 材材 研钵，天平；研钵，天平；沸水浴，沸水浴，低速台式离心机。低速台式离心机。材材 料料 干酵母干酵母 一一.提取步骤改动提取步骤改动：1.1.5 5g g酵母中加入酵母中加入30 ml 0.04M NaOH30 ml 0.04M NaOH，在研钵中研磨均在研钵中研磨均匀，转入匀，转入大试管大试管，沸水浴，沸水浴20 20 minmin，30003000转离心转离心1010minmin，取上清，弃沉淀。取上清
5、，弃沉淀。2.2.上清液上清液慢慢慢慢倾入倾入10 10 ml ml 酸性乙醇中，边加边搅，静酸性乙醇中，边加边搅，静置沉淀置沉淀RNARNA后，后，30003000转离心转离心 3 3minmin，弃上清，取沉弃上清，取沉淀。淀。3.3.将沉淀用将沉淀用95%95%乙醇洗乙醇洗两次两次，约约3 3毫升毫升/管管，用于除去，用于除去表面杂质。表面杂质。第一次将沉淀捣散后再第一次将沉淀捣散后再30003000转离心转离心3 3minmin；第；第二次将沉淀捣散过滤，旨在将沉淀誊出来，放在二次将沉淀捣散过滤，旨在将沉淀誊出来，放在滤纸上凉干，称量。（滤纸上凉干，称量。（差减法称量，滤纸应提前差减法
6、称量，滤纸应提前称好称好）4.4.将所有提取物转移到小三角瓶将所有提取物转移到小三角瓶/大试管中，加大试管中，加适量适量硫酸进行水解，再分别鉴定组份。硫酸进行水解，再分别鉴定组份。二二.鉴定鉴定 1.1.鉴定磷组分可适当增加，效果更好。鉴定磷组分可适当增加，效果更好。2.2.氨水过量太多也会使沉淀消失；先加硝酸银后加氨水过量太多也会使沉淀消失；先加硝酸银后加氨水效果明显。氨水效果明显。n苔黑酚显色的特异性较差，凡戊糖都有此反应。苔黑酚显色的特异性较差，凡戊糖都有此反应。n准微量准微量DNADNA无影响，较多无影响，较多DNADNA存在，亦有干扰。存在，亦有干扰。离心注意事项：离心注意事项：1.1.样品倒入玻璃离心管样品倒入玻璃离心管不能太满；不能太满；2.2.离心前玻璃离心管（离心前玻璃离心管（套上塑料管套套上塑料管套）放在天平上）放在天平上平衡好；平衡好；3.3.离心机中离心机中对称对称放置；放置；4.4.接通电源前确认接通电源前确认速度旋钮是否归零速度旋钮是否归零，调节定时旋，调节定时旋钮设定时间，按开始键开始离心，缓慢调节速度钮设定时间，按开始键开始离心，缓慢调节速度至实际需要速度。至实际需要速度。思考题思考题1.为什么测定嘌呤碱而不是嘧啶碱？为什么测定嘌呤碱而不是嘧啶碱？2.为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？