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1、关于基因操作的主要技术原理第1页，讲稿共112张，创作于星期日第一节第一节 核酸的分离与纯化核酸的分离与纯化n核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的方式存在的 n真核生物95%DNA存在于细胞核内，5%在细胞器 n75%的RNA存在于细胞质，10%在核内，15%在细胞器 nrRNA（8085%），tRNA及核内小分子RNA（1015%），mRNA（15%）第2页，讲稿共112张，创作于星期日一、核酸分离提取的原则一、核酸分离提取的原则1.保证核酸一级结构的完整性保证核酸一级结构的完整性2.排除其它分子的污染排除其它分子的污染n核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过
2、高浓度的金属离子n将其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染降到最低 n排除其它核酸分子的污染第3页，讲稿共112张，创作于星期日核酸提取的基本要求核酸提取的基本要求 n尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏n减少化学因素对核酸的降解（过酸、过碱）n减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力、高温）n防止核酸的生物降解第4页，讲稿共112张，创作于星期日提取核酸的一般程序提取核酸的一般程序:破碎细胞 去除与核酸结合的蛋白质及多糖等 去除其它核酸分子 沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质 纯化核酸 核酸的质量评估（电泳、D260/OD280，酶切）第5页，讲稿共112张，创作
3、于星期日二、质粒二、质粒载体的分离与纯化载体的分离与纯化 关关键键：如如何何使使质质粒粒DNA与与宿宿主主染染色色体体DNA分开分开 依依据据：质质粒粒DNA比比染染色色体体DNA小小得得多多，在在DNA提提取取过过程程中中，染染色色体体DNA断断裂裂成成片片段段(线线状状)，而而质质粒粒DNA仍仍保保持持超超螺旋构型螺旋构型 第6页，讲稿共112张，创作于星期日变性法提取质粒变性法提取质粒DNA的原理的原理 在变性条件（碱性或高温)下，线状染色体DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。当变性条件恢复时，质粒DNA迅速复性恢复天然
4、构型，染色体DNA难以复性，交联形成不溶性网状结构，与变性的蛋白质和RNA缠绕在一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于上清液中。第7页，讲稿共112张，创作于星期日碱变性法提取质粒碱变性法提取质粒DNA的步骤的步骤收集细胞沉淀加入溶液I(50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mMEDTA,45mg/mL溶菌酶）加入溶液II(0.2MNaOH,1%SDS)加入溶液III(3MNaAcpH4.8)离心除去沉淀，得含质粒DNA的上清液苯酚抽提去除蛋白质乙醇沉淀收集质粒DNA在强碱性环境中暴露时间过长，cccDNA可发生不可逆变性第8页，讲稿共112张，创作于星期日关键：关键：尽可能地保持
5、其高分子量尽可能地保持其高分子量细菌细菌 33004200kb 酵母酵母 15,000 kb果蝇果蝇 1.65x105 kb 人人 3x106 kb植物植物 2x1051x108 kb 天花病毒天花病毒 288 kb痘病毒痘病毒 196 kb三、染色体三、染色体DNA的分离纯化的分离纯化第9页，讲稿共112张，创作于星期日CsCl密度梯度离心密度梯度离心原理：原理：nCsCl介质密度为1.7g/cm3，超速离心后形成11.9052g/cm3的密度梯度nEB（溴化乙锭）可嵌入DNA两条链的碱基对之间，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应第10页，讲稿共112张，创作于星期日n线性或开环DNA分子，因
6、其具有游离的末端而易于解旋，故可结合相当大量的EB直到达到饱和n具有ccc结构的质粒DNA由于负超螺旋的存在阻止DNA解链，因而只能结合很少的EBnDNA分子中结合EB越多，其浮力密度越小，因而形成不同的浮力密度得以区分第11页，讲稿共112张，创作于星期日质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法：用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬的缓冲液悬的缓冲液悬的缓冲液悬浮菌体浮菌体浮菌体浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞加溶菌酶裂解细菌细胞加溶菌酶裂解细菌细胞加溶
7、菌酶裂解细菌细胞壁壁壁壁 加加加加CsClCsCl和溴乙锭和溴乙锭和溴乙锭和溴乙锭超速离心过夜超速离心过夜超速离心过夜超速离心过夜在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取cccDNAcccDNA稀释沉淀稀释沉淀稀释沉淀稀释沉淀cccDNAcccDNAproteinsproteinsocDNAocDNAL-DNAL-DNAcccDNAcccDNARNAsRNAs第12页，讲稿共112张，创作于星期日 关键：关键：防止内外源防止内外源RNase的作用的作用四、四、RNA的分离与纯化的分离与纯化第13页，讲稿共112张，创作于星期日RNase的特点：n抗酸抗碱,具很广pH作用范围n抗
8、高温严寒(065均具活性，100也不能使之完全失活）n抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性）n酶活性不需要辅助因子n存在范围广第14页，讲稿共112张，创作于星期日解决办法：解决办法：外源RNase：高温（干热180，4hrs），焦碳酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者带手套 内源RNase：高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等 第15页，讲稿共112张，创作于星期日五、五、核酸的浓缩与贮存核酸的浓缩与贮存n沉沉淀淀是核酸浓缩最常用的方法，其最大的优点是通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液及重新调节核酸在溶液中的浓度，可去除
9、溶液中某些可溶性的盐离子与杂质，在一定程度上纯化核酸n沉淀DNA的最常用方法是在DNA溶液中加入1/10体积的3MNaAc（或KAc）和2倍体积的乙醇，放置1530min，离心收集DNA沉淀，倒去上清液，加入70%的乙醇洗涤沉淀，去除残余的盐，再离心收集沉淀。第16页，讲稿共112张，创作于星期日 贮存贮存nDNA：溶于TE中，放置于4、-20、-70nRNA：溶于0.3MNaAc(pH5.2)或ddH2O中，-70长期保存可以沉淀形式贮存于乙醇中，-20第17页，讲稿共112张，创作于星期日六、核酸的质量评估方法六、核酸的质量评估方法n核酸浓度的测定核酸浓度的测定 ds-DNA：1 OD26
10、050g/ml ss-DNA&RNA：1 OD26040g/ml 单链寡核苷酸：单链寡核苷酸：1 OD26020g/ml 第18页，讲稿共112张，创作于星期日n核酸纯度的测定核酸纯度的测定DNA：A260/A280=1.8 若1.8，说明RNA未除尽 1.6，蛋白质或酚未除尽RNA：A260/A280=2.0 2.0，蛋白质或酚未除尽 第19页，讲稿共112张，创作于星期日第二节第二节 凝胶电泳凝胶电泳一、核酸电泳的基本原理一、核酸电泳的基本原理 核酸分子中的磷酸基团带负电荷，在电场中将向正极移动，通过凝胶的分子筛作用可以将不同大小和构型的核酸分子分离，分子量小的DNA，具有较紧密的构型，在
11、凝胶中移动快；反之，分子量大的DNA移动慢第20页，讲稿共112张，创作于星期日琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力片段的能力 凝凝胶胶类类型型及及浓浓度度 分分辨辨DNADNA片片段段的的大大小小范范围围（bpbp）0.3%琼脂糖琼脂糖 500001000 0.7%琼脂糖琼脂糖 200001000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6000 300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1000 100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 500 25 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50 1 DNARNADNA蛋白质蛋白质第21页，讲稿共112张，创作于星期日核酸电泳的染色剂和指示
12、剂核酸电泳的染色剂和指示剂n指示剂指示剂 在电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度 0.6%1%1.4%2%溴酚蓝溴酚蓝 1kb 0.6kb 0.2kb 0.15kb二甲苯青蓝二甲苯青蓝 2kb 1.6kb 第22页，讲稿共112张，创作于星期日n染色剂染色剂 溴化乙锭（溴化乙锭（EB）：嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外光下呈现橙色荧光 由于单链DNA、RNA中常存在自身配对的双链区，也可嵌入EB分子 EB是一种诱变剂，见光易分解第23页，讲稿共112张，创作于星期日n在常规电泳中，DNA移动距离与分子量有关：分子量小的移动快，反之则慢n大于20
13、kb的DNA大分子，其移动距离与分子量无关。因为这些DNA分子要通过胶孔时必须发生变形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨率也就消失了。三、脉冲场凝胶电泳三、脉冲场凝胶电泳第24页，讲稿共112张，创作于星期日n 在脉冲场凝胶电泳中，加在凝胶上至少有两个电场方向，使得DNA分子要不断地调整泳动方向，不同分子量大小的DNA分子用于改变泳动方向的时间不同，则可以得到分离脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE第25页，讲稿共112张，创作于星期日 PFGE工作原理工作原理nDNA松弛时间：大分子DNA改变形状和重新定向
14、所需的时间。这个时间与DNA分子量呈正相关（Tr）nDNA移动时间：DNA分子向前移动的时间（Tm）n电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（Tp）第26页，讲稿共112张，创作于星期日n分子量大的DNA分子所需的松弛时间长，分子量小的则短。n由于脉冲时间是一个人为的固定值，那么用于向前移动的时间则随分子量大小而变化。n分子量大的用于向前运动的时间少，移动距离就短，分子量小的用于向前运动的时间多，移动距离就长。第27页，讲稿共112张，创作于星期日nTp小小=Tm小小+Tr小小 Tp大大=Tm大大+Tr大大nTp小小=Tp大大 nTr小小 Tm大大 ，所以，所以，S小小 S大大 n显然，要使一个
15、显然，要使一个DNA样品中不同大小的样品中不同大小的DNA分分子分离，脉冲时间应选在最大子分离，脉冲时间应选在最大DNA分子所需的上分子所需的上限。限。第28页，讲稿共112张，创作于星期日第三节第三节 DNA序列分析序列分析 1.双脱氧核苷酸链终止法双脱氧核苷酸链终止法Dideoxy-terminationsequencingSanger法第29页，讲稿共112张，创作于星期日第30页，讲稿共112张，创作于星期日基本原理：基本原理：双双脱脱氧氧（2，3）-核核苷苷酸酸可可以以象象2-脱脱氧氧核核苷苷酸酸那那样样直直接接掺掺入入新新合合成成的的DNA链链中中，但但因因3 端端不不具具OH基基
16、，DNA链链合合成成至至此此中中断断。由由于于双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸在在每每个个DNA分分子子中中掺掺入入的的位位置置不不同同，故故可可根根据据不同长度的不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列片段测定出核苷酸序列第31页，讲稿共112张，创作于星期日过程过程：制备ss-DNA与引物退火分为4个反应系统每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸DNA聚合酶定序反应反应产物变性后电泳凝胶干燥放射自显影第32页，讲稿共112张，创作于星期日DNASequencingReactionsTheDNAsequencingrunissimilartothePCRrun.Theru
17、nmixincludesthetemplateDNA,Taqpolymerase,dNTPs,ddNTPs,andaprimer:asmallpieceofsingle-strandedDNA20-30ntlongthathybridizestoonestrandofthetemplateDNA.TherunisintitiatedbyheatinguntilthetwostrandsofDNAseparate,thentheprimersannealstothecomplementarytemplatestrand,andDNApolymeraseelongatestheprimer.第33
18、页，讲稿共112张，创作于星期日 4 different DNA synthesis reactions are run begin synthesis from specific priming point add components for DNA synthesis+specific ddNTP for each of the four reactionse.g.ddATPNo 3OH.第34页，讲稿共112张，创作于星期日ddCTPACCCTTGG第35页，讲稿共112张，创作于星期日MethodfromSaengerManualsequencingusesradiolabeledd
19、ATP(35-Sor33-P)tolabeltheDNA.ThesampleisthensplitintofourtubeseachwithanindividualddNTPpresent.Thesamplesarethensubjectedtoacrylamidegelelectrophoresisfollowedbyautoradiography.第36页，讲稿共112张，创作于星期日nDNA全自动测序全自动测序第37页，讲稿共112张，创作于星期日PuttingItAllTogetherUsinggelelectrophoresistoseparateeachDNAfragmenttha
20、tdiffersbyasinglenucleotidewillbandeachfluorescentlytaggedterminatingddNTPproducingasequencingread.Thegelisreadfromthebottomup,from5to3,fromsmallesttolargestDNAfragment.第38页，讲稿共112张，创作于星期日 屏幕显示的胶图第39页，讲稿共112张，创作于星期日RawAutomatedSequencingDataA5laneexampleofrawautomatedsequencingdata.Green:ddATPRed:dd
21、TTPYellow:ddGTPBlue:ddCTP第40页，讲稿共112张，创作于星期日Sanger：荧光检测第41页，讲稿共112张，创作于星期日 377测序仪人类基因组计划测序的主力机型测序的主要设备第42页，讲稿共112张，创作于星期日上样走电泳编写样品清单第43页，讲稿共112张，创作于星期日全自动的测序仪器：MegaBace第44页，讲稿共112张，创作于星期日 华大基因研究中心华大基因研究中心(北京北京)承担了人类承担了人类3号染色体短臂上的约号染色体短臂上的约3000万对碱基的测序任万对碱基的测序任务，使中国成为继美、英、日、德、法之后第六个加入务，使中国成为继美、英、日、德、法
22、之后第六个加入国际测国际测序俱乐部序俱乐部的国家。的国家。中心已建成了基因组学、蛋白质组学、生物信息学研中心已建成了基因组学、蛋白质组学、生物信息学研究及产业化平台，拥有究及产业化平台，拥有ABI 377-96 平板测序仪平板测序仪11台，台，MegaBACE1000 毛细管测序仪毛细管测序仪70台台。第45页，讲稿共112张，创作于星期日TADA!2001 The HGP consortium publishes its working draft in Nature(15 February),and Celera publishes its draft in Science(16 Febr
23、uary).第46页，讲稿共112张，创作于星期日2.Maxam-Gilbert化学法 原理：原理：DNA链上的不同碱基可以和碱链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反应，然后发生基修饰剂发生反应，然后发生12个个碱基的脱落或取代，最后发生链断裂，碱基的脱落或取代，最后发生链断裂，不同位置断裂的不同位置断裂的DNA分子经凝胶电泳分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列就可确定其核苷酸序列第47页，讲稿共112张，创作于星期日4 4种反应体系中，化学试剂特异断裂种反应体系中，化学试剂特异断裂DNADNA机制机制nG反应：反应：硫酸二甲脂使鸟嘌呤硫酸二甲脂使鸟嘌呤N7甲基化甲基化nAG反应：反应：甲酸使嘌呤
24、环上的氮质子化导致糖苷键被甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，使嘌呤环被吡啶取代削弱，使嘌呤环被吡啶取代nC+T反应反应：肼能裂解嘧啶环，进而导致其脱落肼能裂解嘧啶环，进而导致其脱落nC反应：反应：在一定浓度的在一定浓度的NaCl条件下，肼只对胞嘧啶起作条件下，肼只对胞嘧啶起作用用第48页，讲稿共112张，创作于星期日第49页，讲稿共112张，创作于星期日第50页，讲稿共112张，创作于星期日第51页，讲稿共112张，创作于星期日n化学法测序的一大优点是不需要模板，化学法测序的一大优点是不需要模板，引物和引物和DNA聚合酶。待测聚合酶。待测DNA链的链的检测用检测用32P末端标记末端标记
25、第52页，讲稿共112张，创作于星期日作作 业业 A solution contains double-stranded DNA fragments of size 3 kb,6 kb,9 kb,and 12 kb.They are separated in an electrophoresis gel.In the diagram of the gel at the right,match the fragment sizes with the correct bands.第53页，讲稿共112张，创作于星期日 A cloned fragment of DNA was sequenced b
26、y using the dideoxy method.A part of the autoradiogram of the sequencing gel is represented herenDeduce the nucleotide sequence of the DNA nucleotide chain synthesized from the primer.Label the 5 and 3 endsnDeduce the nucleotide sequence of the DNA nucleotide chain used as the template strand.Label
27、the 5 and 3 endsnWrite the nucleotide sequence of the DNA double helix(label the 5 and 3 ends)第54页，讲稿共112张，创作于星期日第四节第四节 分子杂交技术分子杂交技术第55页，讲稿共112张，创作于星期日核酸杂交nSouthern印迹杂交（Southernblotting）nNorthern印迹杂交（Northernblotting）nWestern印迹杂交（Westernblotting）第56页，讲稿共112张，创作于星期日 Southern杂交杂交 Southern杂交是指以杂交是指以Sou
28、thern名字命名的名字命名的DNA转移杂交技术，用于特定转移杂交技术，用于特定DNA序列的检测，包括基因组特定序列的检测，包括基因组特定DNA序列的定位，相关片段的同源性测定、从序列的定位，相关片段的同源性测定、从cDNA库、基库、基因组文库中筛选目的基因等。用一种或多种限制性内切酶因组文库中筛选目的基因等。用一种或多种限制性内切酶对基因组对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测用已知核苷酸片段
29、加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。该技术已成为分子生待测样品中是否存在互补的核酸序列。该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。物学中一类重要的检测手段。第57页，讲稿共112张，创作于星期日Southern印迹杂交的用途n确定在克隆片段中基因编码区的大小和位置n确定克隆片段在基因组中的拷贝数第58页，讲稿共112张，创作于星期日Southernblotting第59页，讲稿共112张，创作于星期日Southernblotting第60页，讲稿共112张，创作于星期日第61页，讲稿共112张，创作于星期日第62页，讲稿共112张，创作于星期日Norther
30、nBlottingn相对相对Southern blotting命名的，与命名的，与Southern blotting不同的是，它检不同的是，它检测的对象是测的对象是RNA分子。分子。第63页，讲稿共112张，创作于星期日第64页，讲稿共112张，创作于星期日第65页，讲稿共112张，创作于星期日WesternBlottingn杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质从杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质从SDS-PAGE中转移到一固相支持物中转移到一固相支持物上，通过与附着于固相支持物上的靶上，通过与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异反应进行蛋白所呈现的抗原抗体特异反应进行检测检测n主要用于基因的
31、表达产物蛋白质的检测第66页，讲稿共112张，创作于星期日第67页，讲稿共112张，创作于星期日第68页，讲稿共112张，创作于星期日 第五节第五节 PCR技术技术第69页，讲稿共112张，创作于星期日一、一、PCR技术的基本原理技术的基本原理Polymerase chain reaction,PCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应 AmethodforamplifyingspecificDNAsegmentsthatexploitscertainfeaturesofDNAreplication.第70页，讲稿共112张，创作于星期日n一个一个DNA经经n次扩增后次扩增后,一个一个DNA分子分子可
32、变为可变为2n 理论上经过理论上经过30次循环，靶次循环，靶DNA得到得到109倍的扩增，实际是倍的扩增，实际是1067倍的扩增倍的扩增nDNA扩增需要对待扩增的扩增需要对待扩增的DNA序列有序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物为已知，以便合成寡核苷酸引物 第71页，讲稿共112张，创作于星期日二、二、PCR反应的各种组份及作用反应的各种组份及作用第72页，讲稿共112张，创作于星期日一个标准的一个标准的PCR反应体系（反应体系（50100 l）n 50mmol/LKCln10mmol/LTris-HCl（pH=8.4）n1.5
33、mmol/LMgCl2n100g/ml明胶或牛血清白蛋白（BSA）n2个引物，各0.25mol/LndNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP）各200mol/Ln模板DNA（人基因组DNA）0.11gnTaqDNA聚合酶2U第73页，讲稿共112张，创作于星期日nDenaturation94,0.5minnPrimerannealing55,1.5mionnExtension72,1min30cycles变性（模板）退火（引物与模板）延伸（新合成DNA链）第74页，讲稿共112张，创作于星期日1.模板模板DNAn用于用于PCR扩增的模板扩增的模板DNA通常是从细胞中提取通常是从细胞中提
34、取的染色体的染色体DNA，它们并不需要高度纯化。，它们并不需要高度纯化。n待扩增的靶待扩增的靶DNA的长度在的长度在3kb以下是以下是PCR的有的有效扩增范围，效扩增范围，采用经改造的采用经改造的Taq DNA聚合酶可聚合酶可扩增出扩增出40 kb的的DNA 片段片段。第75页，讲稿共112张，创作于星期日2.引物引物nPCR引物是与待扩增的目的引物是与待扩增的目的DNA两端序列互补两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段的人工合成的寡核苷酸片段n引物的长度通常为引物的长度通常为1730个核苷酸个核苷酸 引物太短，可能同非靶DNA杂交，得出非预期的扩增产物；引物太长，引物与模板的结合效率降低，影响
35、扩增效率。第76页，讲稿共112张，创作于星期日v如8nt的引物，平均每48=65536bp就会有一个结合位点，在全长为3109bp的人类基因组中，大约有43000个可能的结合位点，不能得到单一的特异性扩增产物。v如为17nt的引物，出现几率为417=17,179,869,184bp，长度超过人类基因组长度的5倍，故在人类基因组中只可能有一个结合位点。v但引物不是越长越好，过长的引物同模板DNA的杂交效率反而下降，从而降低PCR反应的效率。第77页，讲稿共112张，创作于星期日n简并引物简并引物 是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间只有一个或数个核苷酸的差异。如根据氨基酸序列推测出的核苷
36、酸序列。第78页，讲稿共112张，创作于星期日n引物与复性温度引物与复性温度n引物与模板结合的特异性与复性温度有密切关系引物与模板结合的特异性与复性温度有密切关系 当复性温度偏低时，引物与模板配对出现错配碱当复性温度偏低时，引物与模板配对出现错配碱基，导致一些不需要的基，导致一些不需要的DNA片段被扩增片段被扩增 复性温度过高，引物与模板不能配对复性温度过高，引物与模板不能配对n复性温度常与引物的长度和碱基组成有直接关系，复性温度常与引物的长度和碱基组成有直接关系，引物越长或引物越长或GC含量较高，退火的温度可以高些，含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些反之则低些 Tm=4(GC)2(AT
37、)12 below第79页，讲稿共112张，创作于星期日n引物设计的一般原则引物设计的一般原则:Correspondwiththesequencesflankingthetargetregiononthetemplatemolecule.第80页，讲稿共112张，创作于星期日n引物的长度常为1730nGC含量为40%60%nTm值高于55n两条引物间配对碱基数小于5个n引物自身配对(特别是在引物的3端)形成的茎环结构,茎的碱基配对数不大于3通常采用计算机辅助设计通常采用计算机辅助设计第81页，讲稿共112张，创作于星期日3.dNTPn浓度为20200mol/L，4种dNTP以等摩尔浓度配制n浓
38、度过高，加快反应速度，但可增加碱基的错误掺入率和成本n浓度过低，反应速度下降，提高实验的精确性第82页，讲稿共112张，创作于星期日4.Taq DNA聚合酶聚合酶 基基本本特特点点:Taq DNA聚聚合合酶酶是是从从一一种种极极度度嗜嗜热水生栖热菌热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得中分离纯化而得n具有DNA聚合酶活性、53外切酶活性、逆转录酶活性n最适反应温度为80n最适pH8.0和最佳反缓冲液TrisHCln最佳二价阳离子Mg2+（10mM）n具良好的热稳定性：在90下连续反应30分钟仍有70%的酶活第83页，讲稿共112张，创作于星期日 扩增产物的可靠性扩增产物的可靠性:n评估DNA聚合酶
39、的一个重要指标是它复制DNA的可靠性，即掺入错误碱基的频率n天然复制的DNA分子中错误掺入率为10-9n在体外实验中，Klenow片段的错误掺入率为10-4，TaqDNA聚合酶的错误掺入率为510-3，而T4聚合酶的错误掺入率为10-7n在克隆基因时，应采用高保真的在克隆基因时，应采用高保真的Taq DNA聚合聚合酶（酶（Pfu）（）（3-5 exonuclease)第84页，讲稿共112张，创作于星期日5.PCR反应的平台期反应的平台期 反反应应底底物物和和产产物物在在DNA扩扩增增中中不不断断发发生生变变化化，最最终终将将会会导导致致聚聚合合反反应应进进入入平平台台期期，出出现现平平台台期
40、期的的原原因因可能有：可能有：后期循环酶浓度或聚合时间不足；后期循环酶浓度或聚合时间不足；引物耗尽；引物耗尽；dNTP耗尽；耗尽；产产物物浓浓度度过过高高，以以致致ds-DNA解解链链后后又又迅迅速速退退火火，不不能与引物结合。能与引物结合。第85页，讲稿共112张，创作于星期日三、PCR产物的鉴定nGelelectrophoresisofPCRproductsnCloningofPCRproductsnSequencingofPCRproducts第86页，讲稿共112张，创作于星期日CloningPCRproductsnTaqDNApolymerasetendstoaddanadditio
41、nalnucleotide,usuallyA,totheendofeachstranditsynthesizes.第87页，讲稿共112张，创作于星期日nDesignprimersthatcontainrestrictionsites第88页，讲稿共112张，创作于星期日第六节第六节 DNA芯片技术芯片技术第89页，讲稿共112张，创作于星期日DNA芯片或微阵列技术(DNAchipormicroarray)nDNA芯片（或基因芯片）芯片（或基因芯片）是将许多特定的DNA寡核苷酸或DNA片段（称为探针）固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交分析，利用碱基互补配对原理进行
42、杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以及用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面第90页，讲稿共112张，创作于星期日基因芯片第91页，讲稿共112张，创作于星期日基因芯片是基因功能研究领域的一次革命基因芯片是基因功能研究领域的一次革命n与其他的基因检测技术相比，基因芯片技术最大的特征在于能同时定量或定性地检测成千上万的基因信息n基因芯片技术具有微型化、自动化和网络化等特点，是典型的多学科高技术交叉的结晶第92页，讲稿共112张，创作于星期日19911991年世界第一块原位合成寡核苷酸芯年世界第一块原位合成寡核苷酸芯片在美国片在
43、美国AffymetrixAffymetrix诞生诞生19951995年世界第一块年世界第一块cDNAcDNA芯片在斯坦福大学芯片在斯坦福大学实验室诞生实验室诞生 -Science.1995,270:467-470-Science.1995,270:467-470基因芯片的历史基因芯片的历史8080年代末期科学家提出杂交法测序的思想，年代末期科学家提出杂交法测序的思想，也就是寡核苷酸芯片的基本原理也就是寡核苷酸芯片的基本原理第93页，讲稿共112张，创作于星期日基因芯片技术流程基因芯片技术流程 制备方法及点样仪器制备方法及点样仪器探针的制备：探针的制备：标记方法标记方法杂交：杂交：杂交液、杂交温
44、度、杂交液、杂交温度、洗涤条件的选择洗涤条件的选择 扫描仪扫描仪:激光激光 CCD分析软件的开发分析软件的开发基因芯片的制备基因芯片的制备杂交杂交检测检测数据分析数据分析第94页，讲稿共112张，创作于星期日基因芯片实验原理基因芯片实验原理一、基因芯片原理及制备方法n原位合成：寡核苷酸芯片n直接点样：寡核苷酸芯片和cDNA芯片第95页，讲稿共112张，创作于星期日1.原位合成法n在固相介质表面特定区域合成已知序列的寡核苷酸的一类技术的总称n采用光导化学合成和照相平板印刷技术合成寡核苷酸芯片第96页，讲稿共112张，创作于星期日2.直接点样芯片已知基因序列通过在液相中化学合成，或通过PCR技术扩
45、增，或克隆的基因组片段，经纯化及定量分析后，由点样机器人将靶基因序列直接点到预先经过化学修饰的基片上；然后将未结合的靶基因从基片上洗掉，就得到基因芯片第97页，讲稿共112张，创作于星期日MicroarrayRobot第98页，讲稿共112张，创作于星期日3.原位合成法与直接点样法的比较原位合成法原位合成法直接点样法直接点样法直接从DNA数据库得到信息进行寡核苷酸合成预先制备cDNA样品并进行合成芯片个体之间差异小差异大密度高，400000/1.6cm264500/6.5cm2合成寡核苷酸长度有限，特异性差靶基因检测特异性高靶基因检测特异性高 成本高成本低第99页，讲稿共112张，创作于星期日
46、数据分析、寻找差异表达的基因数据分析、寻找差异表达的基因Cy3标记标记A组织组织Cy5标记标记B组织组织混合探针混合探针以两种波长的激光扫描以两种波长的激光扫描杂交杂交AB第100页，讲稿共112张，创作于星期日1.实验样本的制备常用的基因芯片实验样本是mRNA(cDNA)n直接从组织或细胞中提取的mRNAn利用PCR技术扩增出的cDNA第101页，讲稿共112张，创作于星期日2.探针的标记-荧光标记用花青素(cyanin)Cy3,Cy5进行双色荧光标记,其激发和发射波长分别是550/570,649/670当用mRNA作模板时,常用反转录方法进行直接标记第102页，讲稿共112张，创作于星期日
47、3.芯片杂交第103页，讲稿共112张，创作于星期日HowDNAMicroarraysWorkATGCAATTGACTGCAGTCGTGGTCTGATT A A G T C GGene TEF4:A G T CTAAGTCG第104页，讲稿共112张，创作于星期日第105页，讲稿共112张，创作于星期日图像与数据处理n扫描仪扫描仪n激光共聚焦扫描激光共聚焦扫描光源：特定波长的光光源：特定波长的光激发面积：激发面积：100平方微米平方微米如：如：ScanArray 3000nCCD(电荷耦合摄像芯片扫描仪电荷耦合摄像芯片扫描仪)光源：连续波长的光（如弧光灯）光源：连续波长的光（如弧光灯）同时对整
48、张芯片表面进行扫描同时对整张芯片表面进行扫描第106页，讲稿共112张，创作于星期日第107页，讲稿共112张，创作于星期日DNAMicroarrayImageReference cDNAExperimental cDNAUpregulatedDownregulatedGene GTF4第108页，讲稿共112张，创作于星期日基因芯片基因芯片芯片测序芯片测序芯片测序芯片测序药物研究药物研究药物研究药物研究基因图绘制基因图绘制基因图绘制基因图绘制农林业农林业农林业农林业表达分析表达分析表达分析表达分析突变检测突变检测突变检测突变检测军事、司法军事、司法军事、司法军事、司法疾病诊断疾病诊断疾病诊断疾病诊断.基因芯片的应用第109页，讲稿共112张，创作于星期日肝肝 癌癌 相相 关关 基基 因因 的的 研研 究究Seemovie第110页，讲稿共112张，创作于星期日拟拟 南南 芥芥 对对 病病 源源 菌菌 防防 御御 反反 应应第111页，讲稿共112张，创作于星期日感谢大家观看第112页，讲稿共112张，创作于星期日