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1、第四章基因工程的主第四章基因工程的主要技术及其原理要技术及其原理第一页，本课件共有95页n聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术nDNADNA序列分析序列分析nDNADNA与蛋白质互作分析与蛋白质互作分析第二页，本课件共有95页第四节第四节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCR技术的发现：技术的发现：1985年年Kary Mullis及其及其Cetus公司的同事们，公司的同事们，首次用首次用大肠杆菌大肠杆菌DNA 聚合酶聚合酶I的的Klenow片段体外扩增出哺乳片段体外扩增出哺乳动物基因片段动物基因片段。他们因此获得他们因此获得1993年诺贝尔生理学和医学奖。年诺贝尔生理学和医学奖。第三页，本课件
2、共有95页一、一、PCR技术原理技术原理PCR（聚合酶链式反应）：（聚合酶链式反应）：在有在有DNA单链、引物、单链、引物、4种种dNTP和和DNA聚合酶的情况下，聚合酶的情况下，当引物与单链的互补区结合后，在当引物与单链的互补区结合后，在DNA聚合酶的催化作用聚合酶的催化作用下即可进行下即可进行DNA单链的单链的5-3合成反应。合成反应。第四页，本课件共有95页3553TaqTaqTaq酶按照酶按照53方向合成方向合成DNA第五页，本课件共有95页（一）（一）PCR技术的基本过程技术的基本过程 变性：变性：加热使双链加热使双链DNA变为单链变为单链。一般为。一般为94 30s即可；即可；退火
3、退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链。：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链。一般在一般在50-60 之间之间。退火温度越高，产物的特异性。退火温度越高，产物的特异性越高；越高；延伸延伸：耐热：耐热DNA聚合酶按聚合酶按53方向催化以引物为方向催化以引物为起始点的延伸反应。起始点的延伸反应。一般为一般为72 延伸，延伸，1kb用用1min；第六页，本课件共有95页指指数数增增长长变性变性退火退火延伸延伸第七页，本课件共有95页二、PCR反应体系（一）缓冲液（一）缓冲液在在PCR体系中体系中Buffer通常采用通常采用10mmol/LTris-HCl（pH8.3-9.0），），其中的二价阳
4、离子（通常为其中的二价阳离子（通常为Mg2+）可以激活可以激活DNA聚合酶聚合酶的活性中心，的活性中心，Mg2+的浓度可影响的浓度可影响PCR扩增产物的特异扩增产物的特异性。性。其中的其中的K+（50mmol/L）利于引物与模板的退火。利于引物与模板的退火。明胶或血清白蛋白及去污剂明胶或血清白蛋白及去污剂（Tween20）起到对）起到对TaqDNA聚合酶的稳定作用。聚合酶的稳定作用。第八页，本课件共有95页（二）模板（二）模板理论上讲一个理论上讲一个DNA 分子也能扩出。分子也能扩出。一一般般来来说说，用用ng级级的的克克隆隆DNA，g水水平平的的染染色色体体DNA，102-105拷贝的拷贝的
5、DNA片段。片段。但但是是，模模板板量量不不可可太太多多，太太多多容容易易出出现现非非特特异异扩增。扩增。第九页，本课件共有95页（三）四种脱氧核苷酸的混合物（三）四种脱氧核苷酸的混合物(dNTP)工作浓度一般为工作浓度一般为20-200mol/L。浓度太高不好。浓度太高不好。连连续续几几次次PCR 扩扩增增时时要要注注意意补补充充四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸的混合物。酸的混合物。第十页，本课件共有95页（四）（四）耐热的耐热的DNA聚合酶聚合酶1.Taq DNA聚合酶：聚合酶：从耐热的嗜热水生菌中分离出来。从耐热的嗜热水生菌中分离出来。扩增速度高，约扩增速度高，约1kb/min。因无校对功能，
6、错掺比例为因无校对功能，错掺比例为1/20000左右左右；2.Tth聚合酶：聚合酶：来自嗜热细菌，来自嗜热细菌，95 半衰期只有半衰期只有20min。第十一页，本课件共有95页3.Vent DNA 聚合酶聚合酶来自嗜热高温球菌（来自嗜热高温球菌（Thermococcus litoralis），是一种），是一种高保真的耐热高保真的耐热 DNA聚合酶聚合酶（35 核酸外切酶校读活性核酸外切酶校读活性），其保真度比，其保真度比 Taq DNA 聚合酶高聚合酶高 5 倍。倍。在在 95 温育温育 1 小时后，仍具小时后，仍具 90%以上的聚合酶活性。以上的聚合酶活性。第十二页，本课件共有95页4.Pf
7、u DNA 聚合酶聚合酶 来自激烈热球菌（来自激烈热球菌（Pyrococcus fariosus），保真性和热稳定性都比较高，），保真性和热稳定性都比较高，使用最广泛。使用最广泛。5.Pwo DNA 聚合酶聚合酶来自嗜热细菌（来自嗜热细菌（Pyrococcus coesei），），保真性和热稳定性都比较高，使用也比较多。保真性和热稳定性都比较高，使用也比较多。第十三页，本课件共有95页（五）引物（五）引物引物：引物：在在PCR反应中与待扩增的靶反应中与待扩增的靶DNA区区段两翼互补的寡聚核苷酸。段两翼互补的寡聚核苷酸。第十四页，本课件共有95页PCR引物设计应考虑的几个问题：引物设计应考虑的几
8、个问题：1.引引物物长长度度。一一般般1630个个核核苷苷酸酸，最最佳佳为为2024bp。引引物物过过短短会会使使PCR的特异性降低。的特异性降低。2.引引物物中中G+C的的含含量量 在在4060%左左右右。设设计计引引物物时时要要考考虑虑3端端和和5端端 引物具有相似的引物具有相似的Tm值。值。3.两个引物之间不应发生互补。互补不应大于两个引物之间不应发生互补。互补不应大于2bp。4.引物内部避免形成次级结构，尤其发卡结构。引物自身连续互补碱引物内部避免形成次级结构，尤其发卡结构。引物自身连续互补碱基不能大于基不能大于3bp。第十五页，本课件共有95页5.引引物物的的延延伸伸从从3端端开开始
9、始，3端端不不能能进进行行任任何何修修饰饰，3端端的的最最佳佳碱基选择是碱基选择是G和和C。6.引引物物的的5端端可可以以修修饰饰，如如附附加加限限制制酶酶位位点点，引引入入突突变变位位点点，用用生生物物素，荧光物质，地高辛标记。素，荧光物质，地高辛标记。7.引引物物3 端端不不要要终终止止于于编编码码区区域域密密码码子子的的第第3位位，因因密密码码子子的的第第3位易发生简并，影响扩增特异性和效率。位易发生简并，影响扩增特异性和效率。第十六页，本课件共有95页 三、三、实时定量实时定量PCR技术技术 (Real time Quantitative PCR)第十七页，本课件共有95页与普通与普通
10、PCR的区别的区别n普通普通PCR技术：技术：在在PCR结束后对结束后对终点产物终点产物进行定量分析。进行定量分析。n实时定量实时定量PCR技术：技术：实时检测实时检测PCR扩增，在扩增的扩增，在扩增的指数期指数期对对模板中特模板中特定基因定基因进行定量。进行定量。第十八页，本课件共有95页n1.实时定量实时定量PCR原理原理n实时定量实时定量PCR技术：技术：在在PCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光信号积累，利用荧光信号积累实时监测实时监测整个整个PCR进程，最后通过标准曲线对进程，最后通过标准曲线对模板中特定基模板中特定基因因进行定量分析的方法。进行定量分析的方法。
11、第十九页，本课件共有95页n荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光扩增曲线可以分成三个阶段：（1 1）荧光背景信号阶段：）荧光背景信号阶段：扩增的荧光信号被荧光背景信号扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。所掩盖。（2 2）荧光信号指数扩增阶段：荧光信号指数扩增阶段：PCRPCR产物量的对数值与起始产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以定量分析。模板量之间存在线性关系，可以定量分析。（3 3）平台期：）平台期：扩增产物不再呈指数级增加。扩增产物不再呈指数级增加。第二十页，本课件共有95页实时荧光定量实时荧光定量PCR的计算步骤：的计算步骤：n（1）临界点选择（）临界点选择（荧光阈值荧光阈值
12、）n可以设定在指数扩增阶段任意位置上，一般设置可以设定在指数扩增阶段任意位置上，一般设置为为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。倍。n（2）临界点循环数）临界点循环数n反应管内的荧光信号到达反应管内的荧光信号到达设定的域值时设定的域值时所经历的所经历的循环数循环数，被称为被称为 CT 值。值。第二十一页，本课件共有95页第二十二页，本课件共有95页n（2）标准曲线的绘制）标准曲线的绘制起始拷贝数的对数起始拷贝数的对数CT值值第二十三页，本课件共有95页2.荧光探针和荧光染料荧光探针和荧光染料探针类：探针类：TaqMan荧光探针荧光探针非探针类：非探针类：
13、SYBR 荧光染料荧光染料 第二十四页，本课件共有95页(1)TaqMan荧光探针第二十五页，本课件共有95页TaqMan作用机理第二十六页，本课件共有95页TaqMan法优缺点第二十七页，本课件共有95页（2）SYBR荧光染料法第二十八页，本课件共有95页SYBR Green法优缺点n优点:n对DNA模板没有选择性n适用于任何DNAn使用方便-不必设计复杂探针n非常灵敏n便宜第二十九页，本课件共有95页n绝对定量绝对定量(Absolute Quantification，AQ)病原体检测病原体检测 转基因食品检测转基因食品检测 基因表达研究基因表达研究n相对定量相对定量(Relative Qu
14、antification，RQ)基因在不同组织中的表达差异基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核药物疗效考核 耐药性研究耐药性研究实时荧光定量实时荧光定量PCR的应用：的应用：第三十页，本课件共有95页荧光定量荧光定量PCR仪仪 品牌：品牌：凯杰杰产品品类别：PCR扩增增仪规格型号：格型号：ROTOR-GENE Q参考价格：参考价格：￥560000元元经销商：商：南京翔宇医南京翔宇医疗设备有限公司有限公司产地：地：德国德国第三十一页，本课件共有95页 第五节第五节 DNA序列分析序列分析第三十二页，本课件共有95页DNADNA序序列列测测定定，是是指指DNADNA一一级级结结构构的的测测定定
15、，即即DNADNA分分子子中中核核苷酸的排列顺序的测定。苷酸的排列顺序的测定。第三十三页，本课件共有95页DNADNA测序技术是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶测序技术是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立和发展起来的。电泳技术的基础上建立和发展起来的。该该凝胶含凝胶含6%8%6%8%丙烯酰胺，具有分离丙烯酰胺，具有分离DNADNA片段的片段的分子筛效应分子筛效应,能分离仅有一个碱基差别能分离仅有一个碱基差别,而长度而长度达达300500300500个碱基的寡核苷酸片段。个碱基的寡核苷酸片段。第三十四页，本课件共有95页基本原理：基本原理：首首先先，对对待待测测DNA片片段段进进行行单
16、单侧侧末末端端的的放放射射性性核素标记。核素标记。其其次次，标标记记后后的的DNA分分成成4份份，分分别别用用不不同同的的化化学学试试剂剂处处理理，使使DNA片片段段分分别别于于某某一一种种或或某某一一类类碱碱基基处处断断裂裂，结结果果可可产产生生4种种起起始始于于放放射射性性标标记末端的不同长度的标记分子。记末端的不同长度的标记分子。一、一、MaxamGilbert 化学降解法化学降解法 1977年发明。第三十五页，本课件共有95页11Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化学降解法测序的常用化学化学降解法测序的常用化学试剂：试剂：碱基体系 化学修饰 试剂 化学反应 断裂部位
17、GA+GC+TCA Cdimethyl sulphate（硫酸二甲酯）Piperidine formate（哌啶 甲酸）,pH2.0hydrazine（肼，联氨NH2.NH2）hydrazine+NaCl（1.5M）90C,NaOH（1.2M）甲基化脱嘌呤打开嘧啶环打开胞嘧啶环断裂反应GG和AC和TCA和C第三十六页，本课件共有95页最最后后，将将反反应应混混合合物物经经PAGEPAGE凝凝胶胶电电泳泳按按大大小小分分离离，放放射射自自显显影影后后，便便可可根根据据X X光光片片底底板板上上所所显显现现的的相相应应谱谱带带，直直接接读读出出待待测测DNADNA片片段段的的核核苷酸顺序。苷酸顺序
18、。第三十七页，本课件共有95页第三十八页，本课件共有95页第三十九页，本课件共有95页Maxam-GilberMaxam-Gilber法法 所所 能能 测测 定定 的的 长长 度度 要要 比比SangerSanger法法短短一一些些，它它对对放放射射性性标标记记末末端端250250个个核苷酸以内的核苷酸以内的DNADNA序列效果最佳。序列效果最佳。第四十页，本课件共有95页随随着着M13 M13 噬噬菌菌体体和和噬噬菌菌粒粒载载体体的的发发展展，双双脱脱氧氧链链终终止止法法如如今今远远比比Maxam-GilbertMaxam-Gilbert法应用得广泛。法应用得广泛。由由于于SangerSan
19、ger法法既既简简便便又又快快速速，因因此此是是现现今的最佳选择方案。今的最佳选择方案。第四十一页，本课件共有95页二、二、Sanger双脱氧链双脱氧链终止法终止法 第四十二页，本课件共有95页1958年 和 1980年诺贝尔化学奖获得者英国生物化学家弗雷德时里克桑格第四十三页，本课件共有95页基本原理：基本原理：（1）通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3-OH末端的单链寡核苷 酸 引 物，4种 dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。新新掺掺入入的的脱脱氧氧核核苷苷酸酸5-P5-P与与前前一一核核苷苷酸酸的的3-OH3-OH以磷酸二脂键相连。以磷酸二脂键相连
20、。第四十四页，本课件共有95页第四十五页，本课件共有95页（2 2）如如果果加加入入一一种种特特殊殊核核苷苷酸酸，双双脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸（ddNTPddNTP），它它的的戊戊糖糖的的22、3-3-碳原子上均无碳原子上均无-OH-OH。它它具具有有5-P5-P能能与与前前一一核核苷苷酸酸的的3-OH3-OH以以磷磷酸酸二二脂脂键键相相连连，但但因因不不具具有有3-OH3-OH，故故不不能能同同后后续续的的dNTPdNTP相相连连，于于是是DNADNA链链的的合合成成就就此终止。此终止。第四十六页，本课件共有95页 脱氧核苷酸及双脱氧核苷酸结构比较脱氧核苷酸及双脱氧核苷酸结构比较第四十七
21、页，本课件共有95页（3 3）在）在4 4个反应管中同时加入模板、放射性标个反应管中同时加入模板、放射性标记的引物、记的引物、DNADNA聚合酶、聚合酶、4 4种种dNTPdNTP，分别加，分别加入入4 4种不同的种不同的ddNTPddNTP。这样各反应体系中即可形成一种全部具有相这样各反应体系中即可形成一种全部具有相同的同的5-5-引物端和一种以引物端和一种以ddNTPddNTP残基为残基为33端端结尾的一系列长短不一片段。结尾的一系列长短不一片段。第四十八页，本课件共有95页DNA模板模板 ATTGCAGTCGAC生成的新链生成的新链 TAACGTCAGCTG T管：管：C管：管：TAAC
22、GTCAGCT TAACGTCAGC TAACGT TAACGTC T TAAC G管：管：A管：管：TAACGTCAGCTG TAACGTCA TAACGTCAG TAA TAACG TA 第四十九页，本课件共有95页（4 4）将制得的四组混合物全部平行地点加在变）将制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳。性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳。（5 5）由于各产物均带有放射性标记，从而制得）由于各产物均带有放射性标记，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得接读得DNADNA的碱基序列。的碱基序列。第五十页，本课件
23、共有95页 TAACGTCAGCT TAACGTCAGCTGGTAACGTCAGCTTAACGTCAGCTAACGTCAGTAACGTCATAACGTC TAACGTTAACGTAACTAATA T 第五十一页，本课件共有95页三、三、DNADNA的序列分析的自动化的序列分析的自动化第五十二页，本课件共有95页DNADNA测测序序的的自自动动化化是是在在SangerSanger的的双双脱脱氧氧链链末末端端终终止止法法的的基基础础上上，由由美美国国应应用用生生物物系系统统公公司司进进一一步步发发展展起起来来的的激激光光测测序序法法，其其基基本本原原理理与与末末端端终终止止法法一一样样，都都是是通
24、通过过ddNTPddNTP竞争性的终止新合成的竞争性的终止新合成的DNADNA链链。第五十三页，本课件共有95页（1 1）在在进进行行测测序序反反应应时时，4 4个个反反应应管管中中，每每管管含含有有4 4种种dNTPdNTP、4 4种种四四色色荧荧光光染染料料标标记记的的ddNTP。DNADNA聚聚合合酶酶催催化化合合成成新新链链时时，由由于于ddNTPddNTP终终止止合合成成反反应应而而形形成成不不同同长长度度的的片片段段，而而每每种种ddNTPddNTP终终止止合合成成的的片片段段则则带带有有一一种种特特定定的荧光染料。的荧光染料。第五十四页，本课件共有95页（2 2）在在反反应应结结
25、束束后后，将将4 4个个反反应应管管的的产产物物混混合合在在一一起起，在在聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶的的一一个个点点样样槽槽里里电电泳泳，所所有有片片段段之之间间的的大大小小仅仅相相差差一一个核苷酸，它们按大小不同向下泳动。个核苷酸，它们按大小不同向下泳动。第五十五页，本课件共有95页（3 3）测测序序仪仪的的专专用用激激光光扫扫描描镜镜头头实实时时扫扫描描不不同同大大小小的的DNADNA片片段段在在相相应应时时间间通通过过垂垂直直电电泳泳胶胶读读数数区区时时发发射射的的荧荧光光，将将不不同同大大小小DNADNA片片段段发发射射的的荧荧光光实实时时地地传传递递给给计计算算机机测测序序数数据实
26、时收集软件。据实时收集软件。第五十六页，本课件共有95页第五十七页，本课件共有95页第五十八页，本课件共有95页第七节第七节 DNA和蛋白质互作分析和蛋白质互作分析一、酵母杂交系统一、酵母杂交系统 1.酵母双杂交系统的原理酵母双杂交系统的原理90年代，纽约大学的年代，纽约大学的S.Field等建立。等建立。第五十九页，本课件共有95页有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质用的蛋白质酵母双杂交系统的原理酵母双杂交系统的原理许多真核生物的许多真核生物的转录激活因子转录激活因子都是由两个都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立在结构上可以分开的、功能
27、上也相互独立的的结构域结构域组成。组成。（1）结构域（结构域（Domain）合作）合作酵母双杂交系统的作用酵母双杂交系统的作用第六十页，本课件共有95页啤酒酵母的半乳糖苷酶基因转录激活因子啤酒酵母的半乳糖苷酶基因转录激活因子GAL4，天然的天然的Gal4分子是由一条由分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。个氨基酸残基组成的多肽链。DNA binding domainActive domainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录机转录机GAL4效应基因效应基因结合结合结合结合激活转录激活转录只要只要DNA 结合功能区（结合功能区（BD）与转录激活功
28、能区）与转录激活功能区（AD）靠近就能够表现转录激活活性。）靠近就能够表现转录激活活性。实验发现：实验发现：转录表达转录表达第六十一页，本课件共有95页（2）拆开）拆开 DomainDNA binding domainActive domain上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录机转录机GAL4效应基因效应基因结合结合用重组用重组DNA技术把技术把GAL4的两个的两个Domain分开，分开，就就丧失丧失了激活效应基因的能力。了激活效应基因的能力。不能转录不能转录第六十二页，本课件共有95页（3）重组重组Domain用重组用重组DNA技术把这两个技术把这两个Domain分别与两分别与两个不同
29、的多肽连接。个不同的多肽连接。Active domain蛋白蛋白A蛋白蛋白BDNA binding domain在体内，蛋白在体内，蛋白A与蛋白与蛋白B是否能结合。是否能结合。通过效应基因是否被激活来检查：通过效应基因是否被激活来检查：（4）观察报告基因表达）观察报告基因表达第六十三页，本课件共有95页上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录机转录机GAL4效应基因效应基因蛋白蛋白ADNA binding domain转录激活转录激活domain蛋白蛋白BGAL4的的BD domain与与AD Domain也不能也不能靠近靠近，所以仍然不能启动效应基因的转，所以仍然不能启动效应基因的转录。录。
30、不能转录不能转录a.如果蛋白如果蛋白A与蛋白与蛋白B不能相互结合不能相互结合第六十四页，本课件共有95页上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录机转录机GAL4效应基因效应基因蛋白蛋白ADNA binding domain转录激活转录激活domain蛋白蛋白B激活转录激活转录GAL4的的BD domain与与AD Domain也能也能靠近靠近，所以能启动效应基因的转录。，所以能启动效应基因的转录。转录表达转录表达b.如果蛋白如果蛋白A与蛋白与蛋白B能相互结合能相互结合第六十五页，本课件共有95页双杂交原理双杂交原理X基因和基因和Y基因产基因产基因产基因产物的相互结合，导物的相互结合，导物的相互
31、结合，导物的相互结合，导致致致致reporter gene表表表表达。达。达。达。ADAD第六十六页，本课件共有95页酵母双杂交的试验过程：酵母双杂交的试验过程：第六十七页，本课件共有95页1、构建双杂交体系的宿主菌、构建双杂交体系的宿主菌 删除基因组中的内源野生型删除基因组中的内源野生型GAL4基因基因使酵母菌使酵母菌只能利用载体表达的只能利用载体表达的GAL4蛋白。蛋白。如：如：HF7c（组氨酸缺陷）；（组氨酸缺陷）；SFY526等菌株。等菌株。构建报告基因（构建报告基因（reporter gene）GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在在组
32、氨酸缺乏培养基组氨酸缺乏培养基上。上。基因组中基因组中引入的报告基因引入的报告基因his，并已去除相应转录因子基并已去除相应转录因子基因，加入因，加入 Gal4效应基因的效应基因的UAS。第六十八页，本课件共有95页 穿梭质粒（穿梭质粒（shuttle plasmid）2、构建双杂交体系的穿梭质粒、构建双杂交体系的穿梭质粒既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。中复制和表达的质粒。双杂交体系需要两种穿梭质粒双杂交体系需要两种穿梭质粒分别携带分别携带已知的靶蛋白基因已知的靶蛋白基因和携带和携带未知未知基因基因序列。序列。第六十九页，本课件共有95页
33、靶基因按正确的读码结构和取向克隆在靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的的BD之后。之后。（1）BD-plasmidP:ADH1启动子。启动子。T:ADH1终止子。终止子。筛选标志：筛选标志：TRP核定位信号是核定位信号是GAL4本身的一部分本身的一部分ADH：Alcohol dehydrogenase第七十页，本课件共有95页（2）AD-plasmid外源基因按正确阅读框克隆到外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的的AD片断之后。片断之后。P:ADHI启动子。启动子。T:ADHI终止子。终止子。筛选标志：筛选标志：LEU2核定位信号是核定位信号是SV40SV40的的T T抗原的抗原的序列
34、序列第七十一页，本课件共有95页3、转化、转化 和筛选和筛选（1）把蛋白把蛋白A插入到插入到BD质粒上（质粒上（pGBT9）（2）把蛋白）把蛋白B插入到插入到AD质粒上（质粒上（pGAD424）（3）两种重组质粒共同转化酵母菌（）两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c）报告基因：报告基因：HIS（合成组氨酸）（合成组氨酸）（4）筛选观察）筛选观察第七十二页，本课件共有95页a.存活选择存活选择在缺少在缺少亮氨酸（亮氨酸（LEU）和色氨酸（）和色氨酸（TRP）培养培养基上筛选基上筛选双载体双载体转化子。转化子。双载体转化才能合成双载体转化才能合成亮氨酸和色氨酸亮氨酸和色氨酸，菌体存活。菌体存活。T
35、rp-Leu-第七十三页，本课件共有95页在缺少在缺少组氨酸（组氨酸（HIS）、亮氨酸（）、亮氨酸（LEU）和色）和色氨酸（氨酸（TRP）的培养基上筛选蛋白的培养基上筛选蛋白A和蛋白和蛋白B能相互作用的双载体转化子。能相互作用的双载体转化子。b.蛋白结合选择蛋白结合选择His-Trp-Leu-第七十四页，本课件共有95页酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统的应用1.1.鉴定已知蛋白之间是否相互作用。鉴定已知蛋白之间是否相互作用。2.2.从从cDNAcDNA文库中筛选编码和已知靶蛋白特异作用的克隆，文库中筛选编码和已知靶蛋白特异作用的克隆，发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。发现新的蛋白质和蛋白质的新
36、功能。3.3.用于用于药药物的物的筛选筛选中。中。4.4.应应用双向用双向杂杂交系交系统鉴统鉴定不同突定不同突变变子与靶蛋白的反子与靶蛋白的反应应能力。能力。5.5.在在细细胞内研究抗原和抗体的相互作用。胞内研究抗原和抗体的相互作用。第七十五页，本课件共有95页酵母双杂交系统存在的问题酵母双杂交系统存在的问题1.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细 胞核内，而许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后胞核内，而许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后的修饰如磷酸化和二硫键形成等，这些反应在核内的修饰如磷酸化和二硫键形成等，这些反应在核内是无法进行的是无法进行的.2.假
37、阳性，由于某些蛋白质本身具有转录激活作用假阳性，由于某些蛋白质本身具有转录激活作用.第七十六页，本课件共有95页2.酵母单杂交系统酵母单杂交系统第七十七页，本课件共有95页 1993年，由年，由Wang和和Reed等创立发展出一种研究蛋白等创立发展出一种研究蛋白质和质和DNA相互作用的实验体系。相互作用的实验体系。第七十八页，本课件共有95页 在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-XBD-X蛋白质杂交体，而用特异的蛋白质杂交体，而用特异的DNADNA序列取代序列取代DNAGal4DNAGal4结合位点。结合位点。第七十九页，本
38、课件共有95页第八十页，本课件共有95页酵母单杂交系统原理酵母单杂交系统原理 将将已知的已知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子（特定顺式作用原件构建到最基本启动子（Pmin）上游，）上游，把报告基因连接到把报告基因连接到Pmin下游下游 编码编码待测待测转录因子转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（与已知酵母转录激活结构域（AD）融）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用原件结合，合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用原件结合，就能激活就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达启动子，使报告基因得到表达.第八十一页，本课件共有95页顺式元件顺式元件顺式元件P
39、min报告基因转录因子AD 转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告，使报告基因表达，若连接如基因表达，若连接如3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。识别和结合效率。第八十二页，本课件共有95页 质粒：诱饵质粒pHIS2，文库质粒为pGATD7-rec2 诱饵质粒上连接有目标靶序列，最小启动子和报告基因诱饵质粒上连接有目标靶序列，最小启动子和报告基因 文库质粒则和反转录得到的真核生物文库质粒则和反转录得到的真核生物cDNA连接，可以表达连接，可以表达AD杂合蛋白杂合蛋白 酵母菌株：Y18
40、7 GAL4基因是缺失型的基因是缺失型的 质粒和菌株基本流程基本流程:第八十三页，本课件共有95页报告基因 常用的酵母单杂交体系基本选用HIS3或者LacZ作为报告基因，在大部分实验中报告基因都位于质粒DNA上 第八十四页，本课件共有95页流程:1.筛选含有报告质粒的酵母细胞 具体过程为：合成靶序列；将靶序列插入pHIS2载体的多克隆位点；一般为将0.1mg pHIS2质粒用EcoR和Sac进行完全双酶切，T4连接酶连接，靶序列：pHIS2质粒=5：1的比例进行 酵母转化；选用乙酸锂法 消除报告基因在酵母细胞中的本底表达；将插入目标元件的pHIS2质粒转化Y187酵母后，在不同浓度的3-AT的
41、SD/-His/-Trp平板进行培养，获得能抑制组氨酸渗漏的最低3-AT浓度，一般不超过45mmol/L第八十五页，本课件共有95页2.构建表达文库 将样品经过一定处理之后（如胁迫）后，提取mRNA，经过反转录获得cDNA。一个获取水稻金属应答转录因子的引物：CDS：5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3 SMART：5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3 第八十六页，本课件共有95页3.文库质粒转化酵母细胞 重组pGATD7-rec2质粒表达AD杂合蛋白，转化完毕后将菌液均匀涂布于SD/-His/-Le
42、u/-Trp+最低抑制本底HIS泄露浓度3-AT平板上，30培养2-7天，获取阳性克隆第八十七页，本课件共有95页4.阳性克隆的鉴定 用3-AT抗性检测，即提高3-AT浓度，以排除假阳性，取第3步获得的阳性克隆，充分悬浮于200LTE溶液，涂布于含60mmol/L3-AT+SD/-His/-Leu/-Trp选择性培养基上，只有真正的阳性克隆才能在这种条件下生长第八十八页，本课件共有95页5.其他 得到的阳性酵母细胞都应当注意保存；从阳性克隆酵母中抽提文库质粒，转化大肠杆菌进行大量克隆，最后进行测序和序列比对等后续工作第八十九页，本课件共有95页南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院
43、12/6/2022南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院90从从拟拟南南芥芥cDNA文文库库中中 筛筛选选与与顺顺式式元元 件件DRE结结合的合的 转录因子示意图。转录因子示意图。酵母单杂交的基本原酵母单杂交的基本原理示意图理示意图第九十页，本课件共有95页优点 简单易行，无需分离纯化蛋白，酵母菌属于真真核生物，杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象克服了体外研究时蛋白通常处于非自然构象的缺点，因而灵敏性很高第九十一页，本课件共有95页缺点 有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报道基因的转录，因而存在假阳
44、性结果。如果酵母表达的AD杂合蛋白对细胞有毒性或者融合蛋白在宿主细胞内不能稳定的表达，或者融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于细胞核内，从而产生假阴性的结果。第九十二页，本课件共有95页酵母单杂交系统应用 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面。Chew et al（1999）应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TF、EAR2和NURR1等蛋白质是GRIK5基因的内含子结合蛋白。第九十三页，本课件共有95页二、凝胶阻滞试验二、凝胶阻滞试验是用于研究是用于研究DNA与蛋白质相互作用的与蛋白质相互作用的一种特殊一种特殊的凝胶电泳技术
45、。的凝胶电泳技术。第九十四页，本课件共有95页凝胶阻滞实验的基本原理图凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的放射性标记的放射性标记的放射性标记的DNADNADNADNA由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质B B B B结合，于是在凝胶结合，于是在凝胶结合，于是在凝胶结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带A AC CB B放射自显放射自显放射自显放射自显影影影影*凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳放射性标记的放射性标记的放射性标记的放射性标记的DNADNADNADNA细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物蛋白质与蛋白质与蛋白质与蛋白质与DNADNA结结结结合合合合*B BDNA-DNA-蛋白质结蛋白质结蛋白质结蛋白质结合物电泳迁移缓合物电泳迁移缓合物电泳迁移缓合物电泳迁移缓慢慢慢慢滞后带表明滞后带表明滞后带表明滞后带表明DNADNA与与与与蛋白质结合蛋白质结合蛋白质结合蛋白质结合第九十五页，本课件共有95页