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1、在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么第五节第五节 基因的化学合成基因的化学合成1基因化学合成的概况基因化学合成的概况随着基因工程的发展，需要定向地修改、设计生物基因组，随着基因工程的发展，需要定向地修改、设计生物基因组，快速合成快速合成DNA片段的方法显得十分重要。片段的方法显得十分重要。19571965年年H.G.科拉纳等人设计并合成了由科拉纳等人设计并合成了由一种、两种一种、两种或或3种脱氧核苷酸组成的重复顺序的脱氧寡核苷酸片段种脱氧核苷酸组成的重复顺序的脱氧寡核苷酸片段，并，并以此为模板用以此为模板用DNA聚合酶和聚合酶
2、和RNA聚合酶进一步复制和转录，聚合酶进一步复制和转录，得到了具有对应的互补顺序的长链人工信使核糖核酸得到了具有对应的互补顺序的长链人工信使核糖核酸(mRNA)，再用这种，再用这种人工人工mRNA在无细胞体系中进行蛋白质在无细胞体系中进行蛋白质合成合成。通过分析这样得到的多肽产物的氨基酸顺序和与模。通过分析这样得到的多肽产物的氨基酸顺序和与模板中核苷酸顺序的对应关系板中核苷酸顺序的对应关系破译了遗传密码破译了遗传密码。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么1977年年,坂仓等人首先坂仓等人首先合成了生长激素释放抑制因子的基因合成
3、了生长激素释放抑制因子的基因，并使之在，并使之在大肠杆菌中大肠杆菌中实现了表达实现了表达，得到了在大肠杆菌中原来并不存在的活性肽，得到了在大肠杆菌中原来并不存在的活性肽（十四肽）。（十四肽）。1979年，年，Khorana在在Science杂志上发表题为杂志上发表题为“一个基因的合成一个基因的合成”的论文，报的论文，报道了基因化学合成的成功事例。道了基因化学合成的成功事例。1981年中国生化学家王德宝等完成了年中国生化学家王德宝等完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的全合酵母丙氨酸转移核糖核酸的全合成工作成工作，这是第一个人工合成的具有全部生物活性的，这是第一个人工合成的具有全部生物活性的RNA分子。
4、分子。一系列多肽和蛋白质基因，如一系列多肽和蛋白质基因，如胰岛素、干扰素和生长激素胰岛素、干扰素和生长激素等等的基因相继被合成，并得到了很好的表达，使得这些原来只的基因相继被合成，并得到了很好的表达，使得这些原来只能从动物组织中得到的含量不多的蛋白质能以细菌发酵的办能从动物组织中得到的含量不多的蛋白质能以细菌发酵的办法大量生产。法大量生产。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么概念：概念：以核苷或单核苷酸为原料并且以核苷或单核苷酸为原料并且不依靠任何天然模板或引物不依靠任何天然模板或引物，采用，采用有机合成有机合成反应或酶促合成
5、反应反应或酶促合成反应进行的寡核苷酸或核酸大分子的合成。进行的寡核苷酸或核酸大分子的合成。核酸的人工合成核酸的人工合成在基因的化学合成中，首先要合成出有一定长度的、具有特定序列在基因的化学合成中，首先要合成出有一定长度的、具有特定序列结构的寡核苷酸片段，然后再通过结构的寡核苷酸片段，然后再通过DNA连接酶的作用，使他们按照连接酶的作用，使他们按照一定的顺序共价连接起来。一定的顺序共价连接起来。干扰素基因干扰素基因就采用此方法合成。就采用此方法合成。磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，及在后二者基础上发展，及在后二者基础上发展起来的起来的固相合成法和自动化法
6、固相合成法和自动化法。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么核酸合成包括化学合成和酶促合成两个方面核酸合成包括化学合成和酶促合成两个方面化学合成化学合成以核苷或单核苷酸为原料，完全用有机化学方以核苷或单核苷酸为原料，完全用有机化学方法来合成核酸。由于核苷酸是一个多官能团的化合物，因法来合成核酸。由于核苷酸是一个多官能团的化合物，因此此,在化学合成中在化学合成中,必须将不希望发生反应的基团保护起来。必须将不希望发生反应的基团保护起来。酶促合成酶促合成通过酶促反应可以把化学合成的小片段连接成通过酶促反应可以把化学合成的小片段连接成为
7、大片段，或是从已经合成的单链制成双链，它可以加快为大片段，或是从已经合成的单链制成双链，它可以加快合成工作的进展，使人工合成核酸大分子的目标得以顺利合成工作的进展，使人工合成核酸大分子的目标得以顺利地实现。地实现。大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶和连接酶和T4噬菌体噬菌体DNA连接酶是两种经连接酶是两种经常使用的常使用的DNA连接酶。连接酶。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么基本原理是将一个基本原理是将一个5端带有适当保护基的脱氧单核苷酸与端带有适当保护基的脱氧单核苷酸与另一个另一个3端带有适当保护基的脱氧单核苷酸偶联起来，形成
8、端带有适当保护基的脱氧单核苷酸偶联起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。2磷酸二酯法磷酸二酯法在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么由于以上反应是通过磷酸单酯和羟基缩合生成由于以上反应是通过磷酸单酯和羟基缩合生成3-5磷酸二酯，磷酸二酯，故称为磷酸二酯（合成）法。故称为磷酸二酯（合成）法。能合成长达能合成长达200bp的寡核苷酸片段的寡核苷酸片段但在磷酸二酯法中，由于产物为磷酸二酯，磷酸上所剩下的但在磷酸二酯法中，由于产物为磷酸二酯，磷酸上所剩下的OH基团，虽然化学活性较小基团，虽
9、然化学活性较小,但也能发生反应但也能发生反应,因此因此,当合成的当合成的寡核苷酸链逐渐增长时寡核苷酸链逐渐增长时,由这个磷酸由这个磷酸OH基团所带来的副反应也基团所带来的副反应也愈益严重，使合成产率急剧下降，目前这个方法已基本上被淘愈益严重，使合成产率急剧下降，目前这个方法已基本上被淘汰。汰。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么改进的办法之一是采用适当的保护基把磷酸上的改进的办法之一是采用适当的保护基把磷酸上的OH基团也保护基团也保护起来，再进行连接反应。即如图起来，再进行连接反应。即如图4所表示的那样，用甲核苷所表示的那样，
10、用甲核苷3-磷酸二酯（用磷酸二酯（用R5保护磷酸上的保护磷酸上的OH基团）同乙核苷的基团）同乙核苷的5-羟基反羟基反应生成磷酸三酯型的产物，这个方法称为磷酸三酯法。应生成磷酸三酯型的产物，这个方法称为磷酸三酯法。3磷酸三酯法磷酸三酯法在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么4亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法以保护的亚磷酰胺单体为原料，经以保护的亚磷酰胺单体为原料，经1-H-四氮唑活化后与羟基组分连接，先四氮唑活化后与羟基组分连接，先生成亚磷酸三酯，再氧化得到磷酸三生成亚磷酸三酯，再氧化得到磷酸三酯，称为亚磷酰胺法或亚磷酸三酯法。酯，称为亚
11、磷酰胺法或亚磷酸三酯法。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么4固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸在磷酸三酯法和亚磷酸三酯法基础上发展起来的固相合成法在磷酸三酯法和亚磷酸三酯法基础上发展起来的固相合成法,其其基本原理是将要合成的寡核苷酸链的基本原理是将要合成的寡核苷酸链的3末端核苷先固定在一个不末端核苷先固定在一个不溶性的高分子上面，然后再从此末端核苷开始，逐步接长，接溶性的高分子上面，然后再从此末端核苷开始，逐步接长，接长的链始终被固定在载体上，过量的未反应物和分解产物则通长的链始终被固定在载体上，过量的
12、未反应物和分解产物则通过过滤或洗涤除去，每接长一个经历一次循环。当整个链的增过过滤或洗涤除去，每接长一个经历一次循环。当整个链的增长达到所需要的长度后，再将寡核苷酸链从固相载体上切落下长达到所需要的长度后，再将寡核苷酸链从固相载体上切落下来并脱去保护基，经过分离纯化得到所需要的最后产物。来并脱去保护基，经过分离纯化得到所需要的最后产物。固相合成不仅可以缩短合成的时间固相合成不仅可以缩短合成的时间,提高总产率提高总产率,并且由于每一个并且由于每一个缩合循环都经过同样的操作步骤，因此可以采用自动控制手段。缩合循环都经过同样的操作步骤，因此可以采用自动控制手段。目前已经设计出多种型号的全自动或半自动
13、的合成机器，其每目前已经设计出多种型号的全自动或半自动的合成机器，其每一次的连接产率达到一次的连接产率达到9799，最快的每轮循环不到，最快的每轮循环不到10分钟，分钟，最长的合成片段可到最长的合成片段可到100核苷酸以上。核苷酸以上。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么原理是将所要合成的寡核苷酸链的原理是将所要合成的寡核苷酸链的3末端先以末端先以3-OH与一个不溶性载体，如与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠连接，然后依次从多孔玻璃珠连接，然后依次从3-5的方向将核苷酸单体加上去，所使用的的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单
14、体的活性官能团都是经过保护的，其中核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，其中5-OH用用4,4-二对甲氧基三二对甲氧基三苯基保护，苯基保护，3-端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH，用保护基封闭，用保护基封闭合成的一个循环周期分四个步骤：合成的一个循环周期分四个步骤：1、脱三苯甲基作用、脱三苯甲基作用用二氯乙酸或三氯乙酸处理，脱去核苷酸用二氯乙酸或三氯乙酸处理，脱去核苷酸1的的5-OH基团偶联的保护基团基团偶联的保护基团DMT2、偶联反应、偶联反应通过弱碱通过弱碱-四唑的催化反应，使第二个核苷酸同已附在固相载体上的核苷四唑的催化反应，使第二个核苷酸同已附在固相载体上的核
15、苷酸酸1的暴露的暴露5-OH缩合。缩合。3、封端反应、封端反应加入乙酸酐激发的乙酰化作用，把所有没有参与偶联反应的加入乙酸酐激发的乙酰化作用，把所有没有参与偶联反应的5-OH基团全基团全部封闭起来部封闭起来4、氧化作用、氧化作用利用碘液催化作用，把核苷酸利用碘液催化作用，把核苷酸1和和2间的间的3-5亚磷酸三酯键氧化为稳定的亚磷酸三酯键氧化为稳定的3-5磷酸三酯键磷酸三酯键反复重复以上步骤反复重复以上步骤在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么化学合成法优缺点化学合成法优缺点优点：准确性极高，合成速度较快缺点：合成的寡核苷酸链长度
16、短(不大于80个碱基)一般用于PCR引物、寡核苷酸探针、人工接头、较小基因的合成。对于超过该法合成范围的寡核苷酸链的合成，可采用分段合成法。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么用的基因组装方法主要有两种：用的基因组装方法主要有两种：第一种方法是将寡聚核苷酸激活，带上必要的第一种方法是将寡聚核苷酸激活，带上必要的5-磷酸基磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，再用的双链寡核苷酸片段，再用T4DNA连接酶将它们彼此连接成连接酶将它们彼此
17、连接成一个完整的基团或基团的一个大片段。一个完整的基团或基团的一个大片段。第二种方法是将两条具有互补第二种方法是将两条具有互补3末端的长的寡核苷酸片段末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链彼此退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌作为模板在大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链DNA片段，可经处理插入适当的载体上。片段，可经处理插入适当的载体上。目前，化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于目前，化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150-200bp，而绝大多数基因的大小超过了这个范围，因此，需要
18、将寡核，而绝大多数基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因苷酸适当连接组装成完整的基因5.用寡核苷酸片段组装基因的方法用寡核苷酸片段组装基因的方法在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么生物化学法生物化学法即在体外以目的DNA片段为模扳，利用酶学反应(Klenow酶或Taq酶)，在特异引物的引导下，合成特异的DNA片段。目前最常用的方法是PCR法。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并
19、未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么生物化学法生物化学法优缺点优点：合成基因效率高、速度快、特异性好。随着优点：合成基因效率高、速度快、特异性好。随着PCRPCR技术的发展，现在已能合成长达几十技术的发展，现在已能合成长达几十kbkb的的DNADNA片段。片段。缺点：产物中可能有缺点：产物中可能有1 1l0000-ll0000-l10001000的错配率，的错配率，也就是说，也就是说，PCRPCR产物中可能存在突变体，因此，通产物中可能存在突变体，因此，通过过PCRPCR克隆的基因，必须通过克隆的基因，必须通过DNADNA序列测定才能确序列测定才能确认。认。在日常生活中，随处都
20、可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么全基因合成全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的化学合成目的基因的前提条件是基因的DNADNA序列已知，有三种战略：序列已知，有三种战略：混合退火混合退火根据目的基因全序列，分别合成根据目的基因全序列，分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片段小片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 1 1、小片段粘接法、小片段粘接法：生化合成法的基本战略生化合成法的基本战略生化合成法的基本战略生化合成法的基本战略在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的
21、现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么全基因合成全基因合成2 2、补钉延长法：、补钉延长法：混合退火混合退火根据目的基因两条互补链全序列，分别合成根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-1512-15碱基碱基长的单链长的单链DNADNA小片段以及小片段以及20-3020-30碱基长的单链碱基长的单链DNADNA中片段中片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么全基因合成全基因合成3 3
22、、大片段酶促法：、大片段酶促法：混合退火根据目的基因的全序列，分别合成根据目的基因的全序列，分别合成40-5040-50碱基长的单链碱基长的单链DNADNA片段：片段：T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么全基因合成全基因合成上述三种方法各有利弊：上述三种方法各有利弊：生化合成生化合成DNADNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于生化合的单片段愈短，收率就愈高，但由于生化合成的份额较大，成本较高；成的份额较大，成本较高
23、；在在大片段酶促法大片段酶促法合成目的基因时，虽然生化合成的份额合成目的基因时，虽然生化合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为每聚合一个单体的产物收率为95%95%则合成则合成5050个碱基长的个碱基长的DNADNA单单链大片段的总收率只有链大片段的总收率只有7.7%7.7%在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么6.寡核苷酸化学合成的实际用途寡核苷酸化学合成的实际用途（1）作为合成基因的元件）作为合成基因的元件通过寡核苷酸的
24、合成，能构建出长达通过寡核苷酸的合成，能构建出长达2000bp的基因的全序列的基因的全序列（2）作为核苷酸序列分析的引物）作为核苷酸序列分析的引物寡核苷酸链可以同寡核苷酸链可以同DNA互补链杂交，因此可作为合成互补链杂交，因此可作为合成DNA互补链的引物互补链的引物（3）作为核酸分子杂交的探针）作为核酸分子杂交的探针根据蛋白质的氨基酸顺序，反推出基因编码区的可能的根据蛋白质的氨基酸顺序，反推出基因编码区的可能的DNA核苷酸序列，核苷酸序列，并据此合成出寡核苷酸混合物作探针，用以筛选特定基因并据此合成出寡核苷酸混合物作探针，用以筛选特定基因（4）用于基因定点诱变研究）用于基因定点诱变研究体外化学
25、合成一段带有预定突变序列的寡核苷酸片段体外化学合成一段带有预定突变序列的寡核苷酸片段（5）作为）作为PCR扩增反应的引物扩增反应的引物20个核苷酸左右的个核苷酸左右的PCR寡核苷酸引物寡核苷酸引物（6）作为重组）作为重组DNA连接构件连接构件制备重组制备重组DNA过程中常用到的连接构件衔接物和接头过程中常用到的连接构件衔接物和接头在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么DNA合成仪合成仪设计用于合成结构上类似设计用于合成结构上类似DNA或或RNA的寡核苷酸的自动化仪器。的寡核苷酸的自动化仪器。一般应用于固相合成法，每次将一个核苷酸
26、加到所接长的寡核苷酸链上，一般应用于固相合成法，每次将一个核苷酸加到所接长的寡核苷酸链上，加入每一个核苷酸都利用相同的化学反应与相应的嘌呤或嘧啶碱基衍生物加入每一个核苷酸都利用相同的化学反应与相应的嘌呤或嘧啶碱基衍生物作用。作用。所用化学反应和操作细节随不同的仪器而改变，最广泛应用的方法是所用化学反应和操作细节随不同的仪器而改变，最广泛应用的方法是DNA合成的磷酸酰胺法。合成的磷酸酰胺法。DNA合成仪的基本组成结构合成仪的基本组成结构(一)压力系统(二)试剂和溶剂储液瓶(三)压力管路及输送管路(四)亚磷酰胺瓶排气(五)输送阀块(六)辅助真空(七)柱子(八)路节流阀(九)废液和排气(十一)电池(
27、十二)控制器俄罗斯产，6万美元在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么原理是将所要合成的寡核苷酸链的原理是将所要合成的寡核苷酸链的3末端先以末端先以3-OH与一个不溶性载体，如与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠连接，然后依次从多孔玻璃珠连接，然后依次从3-5的方向将核苷酸单体加上去，所使用的的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，其中核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，其中5-OH用用4,4-二对甲氧基三二对甲氧基三苯基保护，苯基保护，3-端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH，
28、用保护基封闭，用保护基封闭合成的一个循环周期分四个步骤：合成的一个循环周期分四个步骤：1、脱三苯甲基作用、脱三苯甲基作用用二氯乙酸或三氯乙酸处理，脱去核苷酸用二氯乙酸或三氯乙酸处理，脱去核苷酸1的的5-OH基团偶联的保护基团基团偶联的保护基团DMT2、偶联反应、偶联反应通过弱碱通过弱碱-四唑的催化反应，使第二个核苷酸同已附在固相载体上的核苷四唑的催化反应，使第二个核苷酸同已附在固相载体上的核苷酸酸1的暴露的暴露5-OH缩合。缩合。3、封端反应、封端反应加入乙酸酐激发的乙酰化作用，把所有没有参与偶联反应的加入乙酸酐激发的乙酰化作用，把所有没有参与偶联反应的5-OH基团全基团全部封闭起来部封闭起来
29、4、氧化作用、氧化作用利用碘液催化作用，把核苷酸利用碘液催化作用，把核苷酸1和和2间的间的3-5亚磷酸三酯键氧化为稳定的亚磷酸三酯键氧化为稳定的3-5磷酸三酯键磷酸三酯键反复重复以上步骤反复重复以上步骤在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么DNA固相合成法在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么DNA固相合成法在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么亚磷酰胺亚磷酰胺4,4-二甲氧基三苯基二甲氧基三苯基二
30、异丙基胺二异丙基胺在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么DNADNA固相合成的原理如下：全部反应是按一个不大的固相柱子中进行的。首先固相合成的原理如下：全部反应是按一个不大的固相柱子中进行的。首先要将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护（封闭）起来，使反应按设计要将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护（封闭）起来，使反应按设计的
31、方向进行。的方向进行。5-OH5-OH用二对甲氧三苯甲基用二对甲氧三苯甲基 (DMT)(DMT)保护，碱基上的氨基用苯保护，碱基上的氨基用苯甲酸保护。然后对甲酸保护。然后对3-OH3-OH则用氨基亚磷酸化合物进行活化。则用氨基亚磷酸化合物进行活化。完全自动化的固相合成完全自动化的固相合成DNADNA片段仪器片段仪器,可在几小时或一天内合成出长度为几十可在几小时或一天内合成出长度为几十个核苷酸或一百多个核苷酸的个核苷酸或一百多个核苷酸的DNADNA片段，供实验室应用。片段，供实验室应用。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么目的基
32、因的获取目的基因的获取1.化学合成法化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)相关知识点：相关知识点：在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么1.化学合成法化学合成法由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也
33、许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNADNA基因片段基因片段克隆载体克隆载体重组重组DNADNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌存在于转化细菌内存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合2.基因组基因组DNA文库文库在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂
34、真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制3.3.cDNAcDNA文库文库 逆转录酶逆转录酶A A A A T
35、 T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么是一种在体外利用酶促反应大量获是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组得特异序列的基因组DNA或或cDNA的专的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。门技术，又称为无细胞的分子克隆。4.聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么PCR反应的基本原理反应的基本原理在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象
36、。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么第六节第六节基因定点诱变基因定点诱变在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么p基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。p根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。机突变。p位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸位点特
37、异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链，以双链DNA为模板进行的基因突为模板进行的基因突变。变。pPCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。在日常生活中，随处都可以看到浪费
38、粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么一、传统的诱变一、传统的诱变利用能够修饰利用能够修饰DNA分子的化学或物理分子的化学或物理诱变剂处理生物体诱变剂处理生物体射线（紫外线、射线（紫外线、X射线、射线、射线等）射线等）化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚、亚硝基胍等）硝基胍等）在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么不足：不足：经诱变剂处理的生物体，它的任何基因都可能发生突经诱变剂处理的生物体，它的任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难变，目的基因突变率较低
39、，筛选困难即使分离到期望表型的突变体，无法保证突变确实发即使分离到期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上生在目的基因上在基因克隆和核苷酸测序技术发展之前，无法知道基在基因克隆和核苷酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质（单碱基或因中突变的位置和性质（单碱基或DNA片段）片段）在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么定点诱变定点诱变（site-directedmutagenesis)体外特异性改变某个碱基的技术，能够取代、插体外特异性改变某个碱基的技术，能够取代、插入或缺失克隆基因或入或缺失克隆基因或DNA序
40、列中的任何一个特序列中的任何一个特定的碱基定的碱基研究基因的结构与功能的关系研究基因的结构与功能的关系获得所需功能的突变体蛋白质获得所需功能的突变体蛋白质二、基因定点诱变二、基因定点诱变在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么2寡核苷酸诱发基因定点突变的过程寡核苷酸诱发基因定点突变的过程（1）正链）正链DNA的合成的合成（2）突变引物的合成）突变引物的合成（3）异源双链）异源双链DNA分子的制备分子的制备（4）闭环异源双链）闭环异源双链DNA分子的富集分子的富集（5）转化）转化（6）突变体的筛选）突变体的筛选（7）突变基因的鉴定）
41、突变基因的鉴定寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家寡聚核苷酸定点诱变技术是由加拿大的生物化学家M史密斯史密斯（MichaelSmith）发明的。）发明的。基本原理：基本原理：应用寡聚核苷酸进行应用寡聚核苷酸进行DNA的定点诱变时，首先要把含有待突变的的定点诱变时，首先要把含有待突变的DNA片片断克隆到断克隆到MI3噬菌体载体中，噬菌体载体中，MI3噬菌体的正链可以感染具有纤毛的细菌，噬菌体的正链可以感染具有纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌的噬菌体。而存留在菌体内的则是双链状态的复制型体。而存
42、留在菌体内的则是双链状态的复制型MI3。受。受MI3噬菌体感染的噬菌体感染的细菌生长速度减慢，在细菌培养皿上会形成透明的噬菌斑。细菌生长速度减慢，在细菌培养皿上会形成透明的噬菌斑。寡聚核苷酸定点诱变技术寡聚核苷酸定点诱变技术在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么基因工程技术可使基因产生特异性位点突变，也可以基因工程技术可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。产生区域性的突变。常用的方法如盒式突变法常用的方法如盒式突变法(cassettemutagenesis)，又称，又称片段取代法片段取代法(DNAfragmentr
43、eplacement)。盒式突变的具体操作是利用目标基因中所具有的适当的限盒式突变的具体操作是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混或任何混合序列合序列)的的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。序列。1.寡核苷酸盒式诱变（寡核苷酸盒式诱变（Cassettemutagenesis）在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，利用一段人工合成的具有突变序
44、列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列取代野生型基因中的相应序列盒式取代诱变：盒式取代诱变：突变体盒子简单突变体盒子简单地取代野生型片地取代野生型片段，重组质粒全段，重组质粒全部是突变体部是突变体在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么盒式突变的两个关键问题：盒式突变的两个关键问题：1.目标基因中要有适当的限制性内切酶识别位点。目标基因中要有适当的限制性内切酶识别位点。对于天然蛋白质来说，其所含可供利用的限制性内切酶识别位点很少，可利用遗传密码的简并性在不改变氨基酸序列的前提下，通过改变某些核苷酸的序列，产生合
45、适的限制性内切酶位点，便于盒式突变的操作。2.用于取代目标基因中特定用于取代目标基因中特定DNA片段的突变片段的突变DNA片段的获片段的获得。得。目前利用PCR技术可产生具有特定限制性内切酶位点的、具有各种突变位点的盒式突变DNA片段的技术已经很成熟。如今，对目标基因进行区域性定向突变，除了上述的盒如今，对目标基因进行区域性定向突变，除了上述的盒式突变外，也完全可以通过式突变外，也完全可以通过PCR方法对给定基因序列进方法对给定基因序列进行融合和剪接，这种基因改造方法不受特定限制性内切行融合和剪接，这种基因改造方法不受特定限制性内切酶位点的存在与否的限制。酶位点的存在与否的限制。在日常生活中，
46、随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么利用掺假的寡核苷酸进利用掺假的寡核苷酸进行盒式诱变盒式取代诱行盒式诱变盒式取代诱变：变：碱基错误掺入合成掺假碱基错误掺入合成掺假的寡核苷酸群体，从转的寡核苷酸群体，从转化子中分别纯化质粒化子中分别纯化质粒DNA并测序，从中鉴定并测序，从中鉴定出单碱基置换的突变体出单碱基置换的突变体作功能测试作功能测试某种碱基的浓度是其它的某种碱基的浓度是其它的30倍倍在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么盒式取代诱变：简单易行，突变效率高盒式取代诱变：简单
47、易行，突变效率高靶靶DNA区段的两侧需要存在一对限制酶单切点区段的两侧需要存在一对限制酶单切点利用掺假的寡核苷酸进行盒式诱变盒式取代诱变：利用掺假的寡核苷酸进行盒式诱变盒式取代诱变：取代作用随机发生，群体中有的寡核苷酸分取代作用随机发生，群体中有的寡核苷酸分子是野生型，有的发生了一个或数个碱基取代子是野生型，有的发生了一个或数个碱基取代小结：小结：在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，也称为专一性位点突变。这种突变导下进行的，也称为专一性
48、位点突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出技术出现后变得更高效。现后变得更高效。(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法几种寡核苷酸介导的基因突变方法2.寡核苷酸引物诱变寡核苷酸引物诱变在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么诱变原理：诱变原理：使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸分子进行复制，随
49、后这段寡核苷酸引物便成为了新合成引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分，因此所子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列作为诱变剂的寡核苷酸序列：作为诱变剂的寡核苷酸序列：人工合成一段人工合成一段818个碱基的寡核苷酸序列，该序列中除了所需的个碱基的寡核苷酸序列，该序列中除了所需的碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子的中央部位错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子的中央部位通常采用化学合成通常采用化学合成在日常生活中，随处都可
50、以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么成功获得定点突变的原则：成功获得定点突变的原则：1、寡核苷酸引物中的错配碱基必须得到保护，避免被、寡核苷酸引物中的错配碱基必须得到保护，避免被DNA聚合酶聚合酶I5-和和3-外切酶活性切除外切酶活性切除2、用、用Klenow大片段酶及保证错配碱基大片段酶及保证错配碱基3-还有一个以还有一个以上其它碱基上其它碱基2、错配碱基的位置设计在接近诱变剂寡核苷酸分子的、错配碱基的位置设计在接近诱变剂寡核苷酸分子的中央部位