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1、基因工程的主要操作技术及原理现在学习的是第1页，共79页DNADNA提取提取oo总总总总DNADNADNADNA提取提取提取提取n n1 1 1 1、植物总植物总DNADNADNADNA提取提取提取提取n n2 2 2 2、动物总、动物总DNADNADNADNA提取提取n n3 3 3 3、大肠杆菌总、大肠杆菌总、大肠杆菌总、大肠杆菌总DNADNADNADNA提取提取n4 4、质粒、质粒DNADNA提取提取现在学习的是第2页，共79页总总DNADNA提取提取ooDNADNADNADNA的应用的应用的应用的应用oo构建基因组文库：构建基因组文库：构建基因组文库：构建基因组文库：100kb100k
2、booSouthernSouthernSouthernSouthern杂交杂交杂交杂交(包括包括RFLP)50kbRFLP)50kbRFLP)50kbRFLP)50kbooPCRPCRPCRPCR分离基因等分离基因等 50kb50kb现在学习的是第3页，共79页1.1.1.1.因材施提因材施提因材施提因材施提2.2.2.2.根据不同研究需要，保证结构的相应完整性根据不同研究需要，保证结构的相应完整性根据不同研究需要，保证结构的相应完整性根据不同研究需要，保证结构的相应完整性3.3.3.3.尽量排除其它大分子成分的污染尽量排除其它大分子成分的污染尽量排除其它大分子成分的污染尽量排除其它大分子成分
3、的污染(蛋白质、多蛋白质、多蛋白质、多蛋白质、多糖及糖及糖及糖及RNARNARNARNA等等等等)4.4.保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子机溶剂及高浓度的金属离子在在DNADNA提取过程中应做到提取过程中应做到现在学习的是第4页，共79页1 1、植物细胞总、植物细胞总DNADNA提取提取o总原则：总原则：oo取材（尽量新鲜）取材（尽量新鲜）取材（尽量新鲜）取材（尽量新鲜）-液氮研磨液氮研磨液氮研磨液氮研磨-裂解裂解裂解裂解-去蛋去蛋去蛋去蛋白和细胞物白和细胞物白和细胞物白和细胞物-浓缩。浓缩。浓缩。浓缩。现在学习的是第5页，共79
4、页（1 1）CTABCTAB法：法：CTAB(cetyltriethyl ammonium CTAB(cetyltriethyl ammonium bromide)(bromide)(十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵)oo原理：原理：原理：原理：CTAB CTAB CTAB CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中形成复合物，该复合物在高盐溶液中形成复合物，该复合物在高盐溶液中形成复合物，该复合物在高盐溶液中(0.7mo
5、l/L NaCl)(0.7mol/L NaCl)(0.7mol/L NaCl)(0.7mol/L NaCl)是可溶是可溶是可溶是可溶的，当降低溶液盐浓度到的，当降低溶液盐浓度到的，当降低溶液盐浓度到的，当降低溶液盐浓度到0.3mol/L NaCl0.3mol/L NaCl0.3mol/L NaCl0.3mol/L NaCl时，从溶液中沉淀，时，从溶液中沉淀，时，从溶液中沉淀，时，从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分
6、开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNADNADNADNA。ooCTABCTABCTABCTAB溶于乙醇或异丙醇进而除去溶于乙醇或异丙醇进而除去溶于乙醇或异丙醇进而除去溶于乙醇或异丙醇进而除去 在高离子强度的溶液中在高离子强度的溶液中在高离子强度的溶液中在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)(0.7mol/L NaCl)(0.7mol/L NaCl)(0.7mol/L NaC
7、l)，CTABCTABCTABCTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，不与蛋白质和多聚糖形成复合物，不与蛋白质和多聚糖形成复合物，不与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。能沉淀核酸。能沉淀核酸。能沉淀核酸。ooCTABCTABCTABCTAB溶液在低于溶液在低于溶液在低于溶液在低于15151515时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于冷的植物材料之前必须
8、预热，且离心时温度不要低于15151515。另外，。另外，。另外，。另外，它还能保护它还能保护它还能保护它还能保护DNADNADNADNA不受内源核酸酶的降解。不受内源核酸酶的降解。不受内源核酸酶的降解。不受内源核酸酶的降解。现在学习的是第6页，共79页高盐提取高盐提取-低盐沉淀低盐沉淀-高盐溶解高盐溶解-乙醇沉淀乙醇沉淀oo经典的经典的经典的经典的CTABCTABCTABCTAB法使用两种缓冲液，法使用两种缓冲液，法使用两种缓冲液，法使用两种缓冲液，oo高盐提取缓冲液：高盐提取缓冲液：高盐提取缓冲液：高盐提取缓冲液：1 1 1 1（冷冻干燥材料）或（冷冻干燥材料）或2 2 2 2CTABCT
9、ABCTABCTAB（新鲜材料）、（新鲜材料）、（新鲜材料）、（新鲜材料）、0.7mol0.7mol0.7mol0.7mol或或或或1.4mol/L NaCl1.4mol/L NaCl1.4mol/L NaCl1.4mol/L NaClo沉淀缓冲液：沉淀缓冲液：1 1 1 1CTABCTABCTABCTAB，不含，不含，不含，不含NaclNaclNaclNacl现在学习的是第7页，共79页操作步骤操作步骤o1、取幼嫩的植物叶片（3-5g）剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内。加入等体积的65预热的DNA提取缓冲液置于65的恒温水浴摇床上1-2h(1.5h)。o2、加入等体积的氯仿：异戊醇(
10、24：1)，轻轻上下颠倒5分钟，静置5分钟，之后于12000rpm离心10分钟。3、吸取上层水相，重复步骤2一次。o4、吸取上层水相，加入预冷2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒2分钟并置-20冰箱内10min，待DNA沉淀后于12000rpm离心收集，收集的DNA于70%乙醇中洗2-3次。将弃去乙醇风干后的DNA加适量水使其溶解。现在学习的是第8页，共79页o5、待DNA完全溶解后加入1-2l不含RNAaseA（10mg/ml），37保温1h以除去DNA中的RNA。6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿：异戊醇（24：1）轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm离心10分钟。o7、吸取上层水相并先
11、后加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍总体积的预冷的无水乙醇，接着置于-20冰箱，10分钟后10000rpm离心10分钟，弃去无水乙醇，加入70乙醇洗涤2-3次，风干，最后将DNA溶于适量（200-500l）TE中。o8、待DNA完全溶解后进行1%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA 分子量标准估计其浓度。调整浓度后的DNA置于-20备用。现在学习的是第9页，共79页CTABCTAB法的优点法的优点o能很好地去除糖类杂质对于含糖较高的材料可优能很好地去除糖类杂质对于含糖较高的材料可优先使用。先使用。oo在提取时能同时得到高质量的在提取时能同时得到高质量的在提取时能同时得到高质量的在提
12、取时能同时得到高质量的DNADNA及及及及RNARNARNARNA。可根据。可根据。可根据。可根据需要分别进行纯化，如只需要需要分别进行纯化，如只需要需要分别进行纯化，如只需要需要分别进行纯化，如只需要DNADNADNADNA，则可用，则可用，则可用，则可用RNaseRNaseRNaseRNase（核糖核酸酶）水解掉（核糖核酸酶）水解掉RNARNARNARNA。现在学习的是第10页，共79页(2)SDS(2)SDS法法 n利用高浓度的利用高浓度的SDSSDS，在较高温度，在较高温度，在较高温度，在较高温度(55(55(55(5565)65)65)65)条条条条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质
13、变性，释件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀法使蛋白质及多糖杂质沉淀法使蛋白质及多糖杂质沉淀法使蛋白质及多糖杂质沉淀(最常用的是加入最常用的是加入最常用的是加入最常用的是加入5mol5mol5mol5molL L L L的的的的KAcKAcKAcKAc于冰上保温，在低温条件下于冰上保温，在低温条件下于冰上保温，在低温
14、条件下于冰上保温，在低温条件下KACKACKACKAC与蛋白质及多糖结合成不溶物与蛋白质及多糖结合成不溶物与蛋白质及多糖结合成不溶物与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀，离心除去沉淀，离心除去沉淀，离心除去沉淀后，上清液中的后，上清液中的后，上清液中的后，上清液中的DNADNADNADNA用酚氯仿抽提，反复抽用酚氯仿抽提，反复抽用酚氯仿抽提，反复抽用酚氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的提后用乙醇沉淀水相中的提后用乙醇沉淀水相中的提后用乙醇沉淀水相中的DNADNADNADNA。现在学习的是第11页，共79页操作步骤操作步骤o1.将1g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至
15、2 ml离心管中。o2.加入1.2ml预热至65的提取缓冲液(3V)，轻缓振荡混匀，加入120l 20%SDS(达到终浓度2%)，混匀，置65水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。o3.加入0.45ml 5M的醋酸钾（1/10V），混匀，冰浴20分钟，在10000 rpm离心20 min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，取上清液转入另一离心管中。o4.加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000 rpm离心15 min。现在学习的是第12页，共79页o5.转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V冰预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，（见丝状沉淀）-20放置30分钟沉淀核酸。o6
16、.25，12000 rpm，离心10 min，收集沉淀。o7.弃上清，70乙醇洗两次。o8.凉干DNA，溶于50 l ddH2O（或TE buffer），4保存备用。现在学习的是第13页，共79页SDS SDS 法的优缺点法的优缺点oo优点：优点：优点：优点：SDSSDS法操作简单、温和，也可提取到分子量较法操作简单、温和，也可提取到分子量较法操作简单、温和，也可提取到分子量较法操作简单、温和，也可提取到分子量较高的高的高的高的DNADNADNADNA。oo缺点：产物含糖类杂质较多。缺点：产物含糖类杂质较多。缺点：产物含糖类杂质较多。缺点：产物含糖类杂质较多。oo该方法所得的该方法所得的该方法
17、所得的该方法所得的DNADNADNADNA样品也可直接用于样品也可直接用于SouthernSouthernSouthernSouthern杂交，杂交，杂交，杂交，但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并适当延长但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并适当延长但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并适当延长但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并适当延长反应时间。反应时间。反应时间。反应时间。现在学习的是第14页，共79页2 2、动物细胞总、动物细胞总DNADNA提取提取o取材，液氮研磨，裂解，去蛋白和细胞物，浓取材，液氮研磨，裂解，去蛋白和细胞物，浓缩。缩。oo裂解采用：裂解采用：裂解采用：裂解采用：
18、SDSSDSSDSSDS和蛋白酶和蛋白酶 K K K K。现在学习的是第15页，共79页操作步骤操作步骤1.1.切取组织切取组织5g5g5g5g左右左右,剔除结缔组织剔除结缔组织剔除结缔组织剔除结缔组织,吸水纸吸干血液吸水纸吸干血液吸水纸吸干血液吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵剪碎放入研钵剪碎放入研钵剪碎放入研钵(越细越好越细越好越细越好越细越好)。2.2.2.2.倒入液氮倒入液氮倒入液氮倒入液氮,磨成粉末磨成粉末磨成粉末磨成粉末,加加加加10ml10ml10ml10ml分离缓冲液。分离缓冲液。分离缓冲液。分离缓冲液。3.3.3.3.加加加加1ml 10%SDS,1ml 10%SDS,1ml 10
19、%SDS,1ml 10%SDS,混匀混匀,此时样品变得很粘稠。此时样品变得很粘稠。此时样品变得很粘稠。此时样品变得很粘稠。4.4.4.4.加加加加50ul50ul50ul50ul或或或或1mg 1mg 蛋白酶蛋白酶 K,37K,37K,37K,37保温保温保温保温1-21-2小时小时小时小时,直到直到直到直到组织完全解体。组织完全解体。组织完全解体。组织完全解体。5.5.5.5.加加加加1ml 5mol/L NaCl,1ml 5mol/L NaCl,1ml 5mol/L NaCl,1ml 5mol/L NaCl,混匀混匀混匀混匀,10000rpm,10000rpm离心数秒钟。离心数秒钟。离心数
20、秒钟。离心数秒钟。6.6.6.6.取上清液于新离心管，用等体积酚取上清液于新离心管，用等体积酚取上清液于新离心管，用等体积酚取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿氯仿氯仿氯仿:异戊醇异戊醇(25:24:1)(25:24:1)(25:24:1)(25:24:1)抽提。待分层后抽提。待分层后抽提。待分层后抽提。待分层后,10000rpm,10000rpm,10000rpm,10000rpm离心离心离心离心 5 5 5 5分钟。分钟。分钟。分钟。现在学习的是第16页，共79页7.7.7.7.取上清加取上清加取上清加取上清加1/10 1/10 1/10 1/10 体积体积3mol/L NaAc,3mol
21、/L NaAc,3mol/L NaAc,3mol/L NaAc,及及及及2 2 2 2倍体积无水倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀乙醇颠倒混合沉淀DNADNADNADNA。室温下静止。室温下静止10-2010-2010-2010-20分钟，分钟，DNADNADNADNA沉淀形成白色絮状物。沉淀形成白色絮状物。沉淀形成白色絮状物。沉淀形成白色絮状物。8.8.8.8.4444，12000 g12000 g12000 g12000 g离心离心离心离心1010分钟，弃上清。分钟，弃上清。分钟，弃上清。分钟，弃上清。9.9.9.9.70%70%70%70%乙醇洗涤；乙醇洗涤；乙醇洗涤；乙醇洗涤；4444，120
22、00 g12000 g12000 g12000 g离心离心离心离心5 5分钟，弃上分钟，弃上分钟，弃上分钟，弃上清，重复本步骤清，重复本步骤清，重复本步骤清，重复本步骤1 1次。次。次。次。10.10.自然干燥后加入自然干燥后加入1TE1TE1TE1TE或超纯水或超纯水或超纯水或超纯水30-50l30-50l，4 4 or-20or-20保存。保存。保存。保存。现在学习的是第17页，共79页3 3、大肠杆菌总、大肠杆菌总DNADNA提取提取oo基本思路：基本思路：基本思路：基本思路：oo（1 1 1 1）a culture of bacteria is grown and then a cul
23、ture of bacteria is grown and then harvested harvested o（2 2）the cells are broken open to release the cells are broken open to release their contentstheir contents现在学习的是第18页，共79页oo裂解裂解裂解裂解oo机械裂解机械裂解机械裂解机械裂解oo化学裂解：溶菌酶化学裂解：溶菌酶化学裂解：溶菌酶化学裂解：溶菌酶 or EDTA or both SDSor EDTA or both SDS现在学习的是第19页，共79页oo(3)t
24、his cell extract is treated to remove all(3)this cell extract is treated to remove all(3)this cell extract is treated to remove all(3)this cell extract is treated to remove all component except the DNAcomponent except the DNAcomponent except the DNAcomponent except the DNAn去蛋白：酚氯仿抽提去蛋白：酚氯仿抽提oo(4)The
25、 resulting DNA solution is concentrated(4)The resulting DNA solution is concentrated(4)The resulting DNA solution is concentrated(4)The resulting DNA solution is concentratedn n浓缩：乙醇，加单价阳离子，如浓缩：乙醇，加单价阳离子，如浓缩：乙醇，加单价阳离子，如浓缩：乙醇，加单价阳离子，如Na+Na+Na+Na+n n-20-20-20-20放置放置放置放置,离心。离心。离心。离心。现在学习的是第20页，共79页现在学习
26、的是第21页，共79页操作步骤操作步骤1.1.1.1.100ml 100ml 100ml 100ml 细菌过夜培养液细菌过夜培养液细菌过夜培养液细菌过夜培养液,5000rpm,5000rpm,5000rpm,5000rpm离心离心离心离心10101010分钟分钟分钟分钟,去上清液。去上清液。去上清液。去上清液。2.2.2.2.加加加加9.5ml TE9.5ml TE9.5ml TE9.5ml TE悬浮沉淀悬浮沉淀悬浮沉淀悬浮沉淀,并加并加并加并加0.5ml 10%SDS,50l 20mg/ml(0.5ml 10%SDS,50l 20mg/ml(0.5ml 10%SDS,50l 20mg/ml(
27、0.5ml 10%SDS,50l 20mg/ml(或或或或1mg1mg1mg1mg干粉干粉干粉干粉)蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶 K,K,K,K,混匀混匀混匀混匀,37,37,37,37保温保温保温保温1 1 1 1小时。小时。小时。小时。3.3.3.3.加加加加1.5ml 5mol/L NaCl,1.5ml 5mol/L NaCl,1.5ml 5mol/L NaCl,1.5ml 5mol/L NaCl,混匀。混匀。混匀。混匀。4.4.4.4.加加加加1.5ml CTAB/NaCl1.5ml CTAB/NaCl1.5ml CTAB/NaCl1.5ml CTAB/NaCl溶液溶液溶液溶液,混匀混匀混
28、匀混匀,65,65,65,65保温保温保温保温20202020分钟。分钟。分钟。分钟。5.5.5.5.用等体积酚用等体积酚用等体积酚用等体积酚:氯仿氯仿氯仿氯仿:异戊醇异戊醇异戊醇异戊醇(25:24:1)(25:24:1)(25:24:1)(25:24:1)抽提抽提抽提抽提,5000rpm,5000rpm,5000rpm,5000rpm离心离心离心离心10101010分钟分钟分钟分钟,将将将将上清液移至干净离心管。上清液移至干净离心管。上清液移至干净离心管。上清液移至干净离心管。6.6.6.6.用等体积氯仿用等体积氯仿用等体积氯仿用等体积氯仿:异戊醇异戊醇异戊醇异戊醇(24:1)(24:1)(
29、24:1)(24:1)抽提抽提抽提抽提,取上清液移至干净管中。取上清液移至干净管中。取上清液移至干净管中。取上清液移至干净管中。现在学习的是第22页，共79页操作步骤操作步骤7.7.7.7.加加加加1 1倍体积异丙醇倍体积异丙醇倍体积异丙醇倍体积异丙醇,颠倒混合颠倒混合,室温下静止室温下静止室温下静止室温下静止10101010分钟，沉分钟，沉分钟，沉分钟，沉淀淀淀淀DNADNADNADNA。8.8.8.8.4444，12000 g12000 g12000 g12000 g离心离心离心离心10101010分钟，弃上清；分钟，弃上清；分钟，弃上清；分钟，弃上清；9.9.9.9.70%70%70%7
30、0%乙醇洗涤；乙醇洗涤；4444，12000 g12000 g12000 g12000 g离心离心5 5分钟，弃上分钟，弃上清，重复本步骤清，重复本步骤1 1次次次次;10.10.自然干燥后加入自然干燥后加入1TE1TE或超纯水或超纯水30-50l30-50l，4 or 4 or 4 or 4 or-20-20-20-20保存。保存。现在学习的是第23页，共79页4 4、质粒、质粒DNADNA提取提取oo如何区分细菌和质粒如何区分细菌和质粒如何区分细菌和质粒如何区分细菌和质粒DNA?DNA?DNA?DNA?oo二者二者二者二者DNADNADNADNA分子的构型不同分子的构型不同分子的构型不同分
31、子的构型不同oo大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNADNA构型：线性的或开环的构型：线性的或开环的DNADNA分子分子分子分子 oo质粒：共价闭合环状的质粒：共价闭合环状的质粒：共价闭合环状的质粒：共价闭合环状的DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)分子分子分子分子现在学习的是第24页，共79页碱法提取质粒的原理碱法提取质粒的原理oopHpHpHpH值值值值12.012.012.012.012.612.612.612.6。oo线性的线性的线性的线性的DNADNADNADNA会被变性，两条链彻底分开。会被变性，两条链彻底
32、分开。会被变性，两条链彻底分开。会被变性，两条链彻底分开。oo而而而而cccDNAcccDNAcccDNAcccDNA则不会被变性。但氢键会被断裂，互补的两条则不会被变性。但氢键会被断裂，互补的两条则不会被变性。但氢键会被断裂，互补的两条则不会被变性。但氢键会被断裂，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。链仍然会紧密地结合在一起。链仍然会紧密地结合在一起。链仍然会紧密地结合在一起。oo中性中性中性中性pHpHpHpH值值值值cccDNA:cccDNA:cccDNA:cccDNA:迅速地复性。迅速地复性。迅速地复性。迅速地复性。oo线性的染色体线性的染色体线性的染色体线性的染色体DNA:DNA:D
33、NA:DNA:不能复性不能复性不能复性不能复性,聚集形成网状的结构。聚集形成网状的结构。聚集形成网状的结构。聚集形成网状的结构。oo离心离心离心离心:在上清液在上清液在上清液在上清液-cccDNA-cccDNA-cccDNA-cccDNA。oo沉淀中：线性沉淀中：线性沉淀中：线性沉淀中：线性DNADNADNADNA和细胞残骸蛋白。和细胞残骸蛋白。和细胞残骸蛋白。和细胞残骸蛋白。现在学习的是第25页，共79页提取的主要步骤提取的主要步骤细菌的培养细菌的培养质粒质粒DNA的分离和纯化的分离和纯化细菌的收集和裂解细菌的收集和裂解现在学习的是第26页，共79页试剂试剂1.1.1.1.溶液溶液溶液溶液:
34、50mM:50mM:50mM:50mM葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)25mM Tris-HCl(pH 8.0)25mM Tris-HCl(pH 8.0)25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10 mM EDTA(pH 8.010 mM EDTA(pH 8.010 mM EDTA(pH 8.010 mM EDTA(pH 8.0）2.2.2.2.溶液溶液溶液溶液:0.2 M NaOH:0.2 M NaOH:0.2 M NaOH:0.2 M NaOH，1%SDS1%SDS3.3.3.3.溶液溶液溶液溶液:醋酸钾（醋酸钾（醋酸钾（醋酸钾（3M KAc3
35、M KAc3M KAc3M KAc）缓冲液，）缓冲液，）缓冲液，）缓冲液，pH 4.8pH 4.8pH 4.8pH 4.84.4.4.4.TETETETE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)10mM Tris-HCl(pH 8.0)10mM Tris-HCl(pH 8.0)10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 1mM EDTA(pH 1mM EDTA(pH 1mM EDTA(pH 8.0)8.0)8.0)8.0)5.5.苯酚苯酚/氯仿氯仿氯仿氯仿/异戊醇（异戊醇（25252525:24242424:1 1 1 1）6.6.乙醇（无水乙醇、乙醇（无水乙醇、7
36、0%70%乙醇）乙醇）乙醇）乙醇）现在学习的是第27页，共79页挑取挑取LBLB固体培养基上生长的单菌落，接种于固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0mL LB2.0mL LB（含相应抗生素）液体培养基中，（含相应抗生素）液体培养基中，3737、250g250g振荡培养振荡培养过夜（约过夜（约12-14hr12-14hr）。）。用用2ml2ml离心管收集培养菌液；离心管收集培养菌液；44，12000 g12000 g离心离心1 1分钟，分钟，弃上清。弃上清。加入加入100l100l冰浴的质粒提取液冰浴的质粒提取液I I，涡旋混匀。，涡旋混匀。加加200l 200l 新配制的质粒提取液新配制的质
37、粒提取液II II，盖紧管口，轻轻颠，盖紧管口，轻轻颠倒数次，冰浴倒数次，冰浴5 5分钟。分钟。加加150l150l冰浴的质粒提取液冰浴的质粒提取液IIIIII，轻轻颠倒数次，冰浴，轻轻颠倒数次，冰浴5 5分钟。分钟。操作步骤操作步骤现在学习的是第28页，共79页操作步骤操作步骤44，12000 g12000 g离心离心510510分钟，将上清移至新离心管中，加分钟，将上清移至新离心管中，加入入10l RNA10l RNA酶酶(1g/l)(1g/l)，3737处理处理2 2小时。小时。用等体积酚用等体积酚用等体积酚用等体积酚:氯仿氯仿氯仿氯仿:异戊醇异戊醇异戊醇异戊醇(25:24:1)(25:
38、24:1)(25:24:1)(25:24:1)抽提，充分混匀；抽提，充分混匀；抽提，充分混匀；抽提，充分混匀；4444，12000 g12000 g12000 g12000 g离心离心离心离心5 5 5 5分钟，将上清移入新的离心管中。分钟，将上清移入新的离心管中。分钟，将上清移入新的离心管中。分钟，将上清移入新的离心管中。加入等体积的氯仿：异戊醇加入等体积的氯仿：异戊醇(24(24：1)1)，充分混匀；，充分混匀；44，12000 12000 g g离心离心5 5分钟，将上清移入新的离心管中。分钟，将上清移入新的离心管中。加加2 2倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，倍体积的预冷的无水乙醇，轻
39、轻混匀，-20-20放置放置3030分钟分钟11小时。小时。44，12000 g12000 g离心离心1010分钟，弃上清。分钟，弃上清。k k70%70%乙醇洗涤；乙醇洗涤；44，12000 g12000 g离心离心5 5分钟，弃上清，重复本步骤分钟，弃上清，重复本步骤1 1次。次。l l自然干燥后加入自然干燥后加入1TE1TE或超纯水或超纯水30-50l30-50l，4 or-204 or-20保存。保存。现在学习的是第29页，共79页氯化铯密度梯度离心法纯化质粒氯化铯密度梯度离心法纯化质粒DNADNA o大大肠肠杆杆菌菌染染色色体体DNADNADNADNA构构构构型型型型：线线线线性性性
40、性的的的的或或或或开开开开环环环环的的的的DNADNADNADNA分分分分子子子子因因因因其其其其具具具具有有有有游游游游离离离离的的的的末末末末端端端端而而而而易易易易于于于于解解解解旋旋旋旋，故故故故可可可可结结结结合合合合相相相相当当当当大量的大量的大量的大量的EBEBEBEB分子浮力密度小分子浮力密度小分子浮力密度小分子浮力密度小。oo质质质质粒粒粒粒共共共共价价价价闭闭闭闭合合合合环环环环状状状状的的的的DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)分分分分子子子子，由由由由于于于于没没没没有有有有游游游游离离离离的的的的末末末末端端端端，只
41、只只只能能能能发发发发生生生生有有有有限限限限的的的的解解解解旋旋旋旋反反反反应应应应，便便便便限限限限制制制制了了了了EBEBEBEB分子的结合数量，浮力密度大。分子的结合数量，浮力密度大。分子的结合数量，浮力密度大。分子的结合数量，浮力密度大。现在学习的是第30页，共79页RNARNA的提取的提取现在学习的是第31页，共79页防止防止RNARNA降解，抑制降解，抑制RNAseRNAse活性活性oo所有的组织中均存在所有的组织中均存在所有的组织中均存在所有的组织中均存在RNARNARNARNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等酶，
42、人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染。均可能被污染。均可能被污染。均可能被污染。1.1.1.1.需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。2.2.2.2.所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中 200200200200烘烤烘烤烘烤烘烤2 2 2 2小时以上。小时以上。小时以上。小时以上。3.3.3.3.材料如塑料容器等皆可用材料如塑料容器等皆可用材料如塑料容器等皆可用材料如塑料容器等皆
43、可用0.1%0.1%0.1%0.1%的焦碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯的焦碳酸二乙酯(DEPC)(DEPC)(DEPC)(DEPC)水溶液水溶液水溶液水溶液处理处理处理处理,高压灭菌。高压灭菌。高压灭菌。高压灭菌。DEPCDEPCDEPCDEPC:一种高活性的烷基化试剂。常用做核酸酶抑制剂一种高活性的烷基化试剂。常用做核酸酶抑制剂一种高活性的烷基化试剂。常用做核酸酶抑制剂一种高活性的烷基化试剂。常用做核酸酶抑制剂(特别是特别是特别是特别是用于灭活广泛存在的核糖核酸酶用于灭活广泛存在的核糖核酸酶用于灭活广泛存在的核糖核酸酶用于灭活广泛存在的核糖核酸酶)、组氨酸残基修饰剂等。、组氨酸残基修
44、饰剂等。、组氨酸残基修饰剂等。、组氨酸残基修饰剂等。现在学习的是第32页，共79页DEPCDEPC使用方法使用方法1.1.1.1.DEPCDEPCDEPCDEPC是是是是RNARNARNARNA酶的化学修饰剂酶的化学修饰剂酶的化学修饰剂酶的化学修饰剂,它和它和它和它和RNARNARNARNA酶的活性基团组氨酸酶的活性基团组氨酸酶的活性基团组氨酸酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。的咪唑环反应而抑制酶活性。的咪唑环反应而抑制酶活性。的咪唑环反应而抑制酶活性。2.2.2.2.DEPCDEPCDEPCDEPC与氨水溶液混合会产生致癌物与氨水溶液混合会产生致癌物与氨水溶液混合会产生致癌物与氨水
45、溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。因而使用时需小心。因而使用时需小心。因而使用时需小心。3.3.3.3.试剂也可用试剂也可用试剂也可用试剂也可用DEPCDEPCDEPCDEPC处理处理处理处理,加入加入加入加入DEPCDEPCDEPCDEPC至至至至0.1%0.1%0.1%0.1%浓度高压灭菌以消浓度高压灭菌以消浓度高压灭菌以消浓度高压灭菌以消除残存的除残存的除残存的除残存的DEPC,DEPC,DEPC,DEPC,否则否则否则否则DEPCDEPCDEPCDEPC也能和腺嘌呤作用而破坏也能和腺嘌呤作用而破坏也能和腺嘌呤作用而破坏也能和腺嘌呤作用而破坏mRNAmRNAmRNAmRNA活性。活
46、性。活性。活性。4.4.4.4.DEPCDEPCDEPCDEPC能与胺和巯基反应能与胺和巯基反应能与胺和巯基反应能与胺和巯基反应,因而含因而含因而含因而含TrisTrisTrisTris和和和和DTTDTTDTTDTT的试剂不能用的试剂不能用的试剂不能用的试剂不能用DEPCDEPCDEPCDEPC处理。处理。处理。处理。TrisTrisTrisTris溶液可用溶液可用溶液可用溶液可用DEPCDEPCDEPCDEPC处理的水配制然后高压灭菌。处理的水配制然后高压灭菌。处理的水配制然后高压灭菌。处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌配制的溶液如不能高压灭菌配制的溶液如不能高压灭菌配制的
47、溶液如不能高压灭菌,可用可用可用可用DEPCDEPCDEPCDEPC处理水配制。处理水配制。处理水配制。处理水配制。现在学习的是第33页，共79页提取方法提取方法oo异硫氰酸胍热苯酚法异硫氰酸胍热苯酚法异硫氰酸胍热苯酚法异硫氰酸胍热苯酚法ooTrizol Trizol Trizol Trizol 法法oomRNA 3mRNA 3mRNA 3mRNA 3 末端含有多聚末端含有多聚末端含有多聚末端含有多聚(A)+(A)+(A)+(A)+吸附纯化吸附纯化现在学习的是第34页，共79页动植物组织动植物组织mRNAmRNA提取提取oo1 1 1 1、无、无、无、无RNARNARNARNA酶灭菌水：用将高
48、温烘烤的玻璃瓶装蒸馏水，酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶装蒸馏水，酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶装蒸馏水，酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶装蒸馏水，然后加入然后加入然后加入然后加入0.1%0.1%的的的的DEPCDEPC（体积（体积（体积（体积/体积），处理过夜后体积），处理过夜后体积），处理过夜后体积），处理过夜后高压灭菌。高压灭菌。高压灭菌。高压灭菌。2 2 2 2、75%75%75%75%乙醇：用乙醇：用乙醇：用乙醇：用DEPCDEPCDEPCDEPC处理水配制处理水配制75%75%75%75%乙醇，（用乙醇，（用乙醇，（用乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶高温灭菌器皿配
49、制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。中，存放于低温冰箱。中，存放于低温冰箱。中，存放于低温冰箱。现在学习的是第35页，共79页（一）动植物总（一）动植物总RNARNA提取提取-Trizol-Trizol法法 适用范围适用范围适用范围适用范围:人类、动物、植物、微生物的组织或培人类、动物、植物、微生物的组织或培人类、动物、植物、微生物的组织或培人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，养细菌，养细菌，养细菌，(mg-g)(mg-g)(mg-g)(mg-g)oo 优点优点优点优点 ：无蛋白和：无蛋
50、白和：无蛋白和：无蛋白和DNADNADNADNA污染。污染。污染。污染。oo 用途用途用途用途 ：1.1.1.1.NorthernNorthernNorthernNorthern斑点分析，斑点杂交，斑点分析，斑点杂交，斑点分析，斑点杂交，斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+Poly(A)+Poly(A)+Poly(A)+分离。分离。分离。分离。2.2.2.2.体外翻译体外翻译体外翻译体外翻译RNaseRNaseRNaseRNase封阻分析。封阻分析。封阻分析。封阻分析。3.3.3.3.分子克隆。分子克隆。分子克隆。分子克隆。现在学习的是第36页，共79页o 组织液氮研磨组织液氮研磨组织液氮研磨