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1、课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶+CO+CO2 22NH2NH3 3+H+H2 2O O4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出能够分
2、解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样统计每克土壤样品中究竟含有多少这样 的细菌的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度原因：因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多 数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是是一种在体外将一种在体外
3、将少量少量DNADNA大量复制大量复制的技术，此项的技术，此项技术要求使用技术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株2 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供人为提供有利于目的菌株生长有利于目的菌株生长的条件的条件(包括营包括营养、温度、养、温度、pHpH等等)，同时，同时抑制或阻止其他微生抑制或阻止其他微生物物生长。也就是用选择性培养基筛选。生长。也就是用选择性培养基筛选。15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O
4、O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基从用途看此培养基属于哪类？从用途看此培养基属于哪类？从化学成分看此培养基属于哪类？从化学成分看此培养基属于哪类？选择培养基选择培养基合成培养基合成培养基15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2PO
5、PO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 氮源：氮源：尿素尿素15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSOMgSOMgSO44447H7H7H7H2 2 2 2OOO O2.1g2.1gNaHNaHNaHNaH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 41.4g1.4gKHKHKHKH2 2 2 2POPO
6、POPO4 4 4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：此培养基是否对微生物具有筛选作用？如果此培养基是否对微生物具有筛选作用？如果有，是如何进行筛选的？有，是如何进行筛选的？有有有有，此培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才，此培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才，此培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才，此培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素
7、，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。6 6、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是判断该培养基有选择
8、性判断该培养基有选择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种结果结果只生长分解只生长分解尿素细菌尿素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是1.1.稀释涂布平板法（稀释涂布平板法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单细胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的一个单细胞。一个单细胞。计算方法：计算方法：每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下
9、平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。.统计菌落数目：统计菌落数目：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数的细菌数。在对应稀释倍数10106 6的培养基中，得到以的培养基中，得到以下两种统计结果。下两种统计结果。1.1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为计的菌落数为230230。2.2.第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统第二位同学在该浓度下涂布了三个平
10、板，统计的菌落数分别为计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三个，该同学以这三个平板上菌落数的平均值平板上菌落数的平均值163163作为结果。作为结果。你认为哪位同学的结果更接近真实值你认为哪位同学的结果更接近真实值?你认为这你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？分析：分析：答：答：都不接近，都需要改进都不接近，都需要改进。第一位同学需要设置重。第一位同学需要设置重复实验组。第二位同学统计的三个菌落数相差太大，复实验组。第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需要重新实验。说明操作有误，需要重新实验
11、。小结小结为使结果接近真实值可将同一稀释度的为使结果接近真实值可将同一稀释度的稀释液涂布到稀释液涂布到三个或三个以上三个或三个以上的平板中培的平板中培养。养。为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数，计算出菌落的平板上进行计数，计算出菌落平均数平均数统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际数目低实际数目低。2 2、显微镜直接计数法：、显微镜直接计数法：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细
12、菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点设置对照的主要目的是排除实验组中设置对照的主要目的是排除实验组中非测试非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。信度。.设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时，落数目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6 倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌个菌 落，但是其他同学在同样的稀释度下落
13、，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同，土样不同，培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 (或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)如何设计实验证明呢？如何设计实验证明呢？小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下
14、进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用
15、的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行旁进行 三三 样品的稀释样品的稀释分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度稀释倍数稀释倍数目的目的细菌细菌10104 4、10105 5、10106 6放线菌放线菌10103 3、10104 4、10105 5真菌真菌10102 2、10103 3、10104 4原因：不同微生物在土壤中含量不
16、同原因：不同微生物在土壤中含量不同保证获得菌落数保证获得菌落数在在3030300300之间之间适于计数的平板适于计数的平板为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿尿素素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？分分析析：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线
17、线菌数约为菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。1 1：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供供选选择培养的条件。择培养的条件。.取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030303030
18、0300300300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时
19、，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上个以上菌落数目在菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，的平板，则说明稀释操作比较
20、成功，并能够进行菌落的计数，如果并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确精确，需要重新实验。，需要重新实验。微生物的培养与观察微生物的培养与观察三三.结果分析与评结果分析与评价价 P25P251.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.稀释操作是否成功：如果得到了稀释操作是否成功：如果得到
21、了2 2个或个或2 2个以上的菌落数在个以上的菌落数在3030300300的平板，则说的平板，则说明明稀释操稀释操作成作成功功。同一稀释倍数的三个重同一稀释倍数的三个重复组的复组的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精表示实验不精确，要重新实验。确，要重新实验。四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 五五.课外延课外延伸伸2 2 2 2、鉴鉴定定大肠大肠大肠大肠杆杆杆杆菌菌的方的方法：在培养基中添加法：在培养基中添加 培培培培养该细菌，如果出现养该细菌，如果出现养该细菌，如果出现养该细菌，如果出现菌菌菌菌落呈落呈落呈
22、落呈现现现现 ，则说，则说，则说，则说明有大明有大明有大明有大肠杆肠杆肠杆肠杆菌。菌。菌。菌。在以尿素为唯一氮源的在以尿素为唯一氮源的在以尿素为唯一氮源的在以尿素为唯一氮源的培养基中加入培养基中加入培养基中加入培养基中加入 指指指指示剂。培养某种细菌后，示剂。培养某种细菌后，示剂。培养某种细菌后，示剂。培养某种细菌后，如果如果如果如果PHPHPHPH升高，指示剂将升高，指示剂将升高，指示剂将升高，指示剂将变变变变 ，说明该细菌能，说明该细菌能，说明该细菌能，说明该细菌能够分解尿素。够分解尿素。够分解尿素。够分解尿素。酚红酚红酚红酚红红红1 1、鉴定分解尿素的细菌的方法、鉴定分解尿素的细菌的方法
23、伊红伊红伊红伊红-美蓝美蓝美蓝美蓝黑色且有金属光泽黑色且有金属光泽黑色且有金属光泽黑色且有金属光泽本课题知识小结本课题知识小结:1.1.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D
24、.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练C CD D3.3.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的
25、可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。4.4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C5 5、下列叙述错误的是下列叙述错误的是 A A因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离进
26、行分离B B测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同C C只有得到了只有得到了3 3个或个或3 3个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的平板，才说明稀释操作比较成功，并能够的平板，才说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数进行菌落的计数D D牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数明显大于选择牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落细菌菌落C C 根据细胞生存所需物质的种类和根据细胞生存所需物质的种
27、类和数量，用人工方法模拟合成的。数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。一些辅助物质。优点：优点：标准化生产，组分和含量相标准化生产，组分和含量相对固定对固定;成本低成本低 缺点：缺点：缺少某些成分，不能完全满缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。足体外细胞生长需要。合成培养基合成培养基:天然培养基有血清、血浆、和组天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：优点：营养成分丰富，培养效果好营养成分丰富，培养效果好缺点：缺点：来源受限来源受限;成分复杂，影响对某成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染易发生支原体污染;天然培养基：天然培养基：