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1、为了棉花姓“中国”1992年，一场史无前例的棉铃虫灾害以迅雷不及掩耳之势吞噬着中国的棉田，我国棉花产业遭遇灭顶之灾；国外公司拒绝出售抗虫棉核心技术，到1999年外国抗虫棉已占领我国95%的棉花市场份额，国内棉花品种市场迅速流失。棉花棉铃虫幼虫2002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种中棉所41，该品种能够缓解棉铃虫抗药性。我国成为世界第二个拥有抗虫基因自主知识产权的国家！第3章基因工程重组DNA技术的基本工具01基因工程的基本操作程序02基因工程的应用03蛋白质工程的原理和应用041944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序
2、列的方法。1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。1977年，桑格等科学家发
3、明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。1985年，穆里斯等人发明了PCR。1990年，人类基因组计划启动。2003年完成21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。基因工程发展历程2020年9月10日，专利
4、审判和上诉委员会（PTAB）裁定，Broad研究所张锋团队在其已获准的专利中拥有将CRISPR系统用于真核细胞的“优先权”，该专利涵盖了在实验室培养的人类或直接在人体内的应用。华人科学家张锋诺奖获得者杜德娜2020年诺贝尔化学奖颁给了埃马纽埃尔卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和詹妮弗杜德纳(Jennifer Anne Doudna），获奖原因是她们开发了一种新的基因编辑方法CRISPR/Cas9基因编辑技术。一、基因工程的概念是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA
5、分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。原理原理操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程目的目的生物体外基因DNA分子水平定向改造生物的遗传性状剪切拼接导入表达优点：定向改造生物体的性状，目的性强（与诱变育种相比）育种周期短，克服远缘杂交不亲和障碍（与杂交育种相比）基因重组番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。到社会中去那么，科学家究竟用
6、到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？培育转基因番木瓜的简要过程：环斑花叶病毒提取外壳蛋白基因普通番木瓜(无抗病特性)番木瓜细胞(含抗病基因)与运载体DNA拼接，导入番木瓜植株(有抗病特性)表达抗病基因(CP基因）1、不同生物的基因为什么能拼接？2、外源基因为什么能在受体细胞中表达？(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)DNA分子都遵循碱基互补配对原则(3)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。(1)基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。基因工程诞生的理论基础“分子手术刀”“分子缝
7、合针”“分子运输车”思考：解决培育番木瓜的关键步骤需要哪些分子工具呢？关键步骤一：抗病基因的提取出来关键步骤二：抗病基因与运载体DNA“缝合”关键步骤三：抗病基因进入番木瓜限制性内切核酸酶：DNA连接酶：工具分子手术刀分子缝合针分子运输车载体：准确切割DNA分子将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞01重组DNA技术的基本工具1、来源：主要从原核生物中分离纯化出来2、种类：数千种3、作用特点：4、作用部位:特定切点上的磷酸二酯键能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。专一性一、限制酶“分子手术刀”ATCGTAGC5353磷酸二酯键回忆：
8、磷酸二酯键 T1234512345 A一个核苷酸脱氧核糖上第3位C的羟基，与下一个核苷酸脱氧核糖上第5位C的磷酸羟基，脱水缩合成酯键，该酯键称又3,5磷酸二酯键。35335AGTCTA复习：DNA的空间结构特点：两条脱氧核苷酸长链反向平行盘旋而成双螺旋结构。脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在内侧。两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对，A与T(两个氢键)，G与C配对(三个氢键)。碱基之间这种一一对应的关系，叫做碱基互补配对原则。1推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？2为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？寻根问底自身DNA不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
9、(甲基化)限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，从而达到保护自身的目的。5.限制酶识别的特定序列有何特点:呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，或其他数量都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。EcoREcoR5 5G-A-A-T-T-G-A-A-T-T-CC3 33 3C-T-T-A-A-C-T-T-A-A-G5G5SmaSma5 5C-C-C-G-G-C-C-C-G-G-GG3 33 3G-G-G-C-C-G-G-G-C-C-C5C5BamHBamH 5 5G-G-A-T-C-G-G-A-T-C-CC3 33 3C-C
10、-T-A-G-C-C-T-A-G-G5G5TaqTaq5 5T-C-G-T-C-G-AA333 3A-G-C-A-G-C-T5T5一条链从5往3读的碱基顺序与另一条链从5往3读的顺序完全一致。【检测】下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（）AGAATTCBGGGGCCCCCTTAAGCCCCGGGGCCTGCAGDCTAAATCGACGTCGATTTAGD D6.限制酶的命名：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌(Escherichiacoli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从
11、大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。EcoR属名种名菌株数字代表第几个Sma：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。7.作用结果：形成黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的_将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是_；当限制酶在它识别序列的_切开时，产生的是_；中轴线两侧黏性末端中轴线处平末端黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割只能识别GAATTC序列,并在G和A之间切开。平末端平末端SmaI限制酶的切割只能识别CCCGGG序列,并在C和G之间切开一个限制酶切割一次断个磷酸二酯键；形成个黏性末端；有_个游离的磷酸基团；
12、消耗分子水？两2思考ATCGTAGC5353两2下列粘性末端是由同一种限制酶切割而成的是两个黏性末端否由同一种限制酶切割产生的：一看游离碱基能否相互配对二看两条链的切点是否相同。技巧：将黏性末端之一旋转180后，若完全相同且切点相同则是。BamH_EcoR_Hind_Bgl_GATCAATTAGCTGATC讨论：请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断
13、开。主要是原核生物数千种1、来源：2、种类：3、作用特点：4、结果：形成两种末端小结：“分子手术刀”限制酶黏性末端平末端同种限制酶产生的黏性末端相同不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。两个黏性末端否由同一种限制酶切割产生的：一看游离碱基能否相互配对；二看两条链的切点是否相同。黏性末端只要互补，即可重新配对。注意：限制酶切一次可产生2个末端和2个游离的磷酸基团，断2个磷酸二脂键，消耗2分子水。CGGCCGTATAATATGCGCGCTTAATCGTATAATATGCTA AEcoRIEcoRICGGCCGT T A AA A T TGCGCGCGTAATCGT T A AA A T T CTA
14、TACGGCCGTTAAATATTGCTAA如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端缺口怎么办？二、DNA连接酶“分子缝合针”将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。1、作用:两条链的骨架部分，形成磷酸二酯键连接部位：CGGCCGTTAAAATTGCTATA类型来源功能相同点差别Ecoli DNA连接酶T4 DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)2、分类：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？DNA连接酶DNA连接酶ATAGTCCGAATT连接两
15、个DNA片段DNA连接酶：CAATTDNA聚合酶GAGTATCDNA聚合酶连接单个脱氧核苷酸形成单链DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键DNA连接酶与DNA聚合酶的区别：与DNA相关的五种酶的比较名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸
16、依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链1.根据所学知识，完成以下填空：限制酶解旋酶DNA连接酶DNA聚合酶RNA聚合酶baA.切断a处的酶为_B.连接a处的酶为_C.切断b处的酶为_a：磷酸二酯键；b：氢键练习：2.以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段:你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？CTGCAGACTGCGGCGCTTAAGACGTCGCCGGTCAAATTCG和能连接形成和能连接形成和能连接形成和能连接形成反向对称3.关于下图所示黏性末端的叙述，正确的是A.与是由相同限制酶切割
17、产生的B.DNA连接酶可催化与的连接C.经酶切形成需要脱去2分子水D.DNA连接酶与DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端。B重组DNA分子的模拟制作目的要求：模拟重组模拟重组DNA分子的操作过程，说出其基本原理分子的操作过程，说出其基本原理 剪刀剪刀 透明胶条透明胶条A T A G C A T G C T A T C C A T G A A T T C G G C A T A CT A T C G T A C G A T A G G T A C T T A A G C C G T A T GT C C T A G A A T T C T C GG T A T G A A T T C C A T
18、A CA G G A T C T T A A G A G CC A T A C T T A A G G T A T G（DNA连接酶）连接酶）（限制酶（限制酶EcoR：G A A T T C）材料用具：AATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAA ATAGCATGCTATCCATGGCCGTATG目的基因目的基因 TCCTAG AGGATCTTAA AATTCCATAC GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG 要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？共产生几个游离的磷酸基团？要切2个切口，产生4个黏性(
19、平)末端，产生4个游离的磷酸基团。重组DNA分子的模拟制作 AATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAA ATAGCATGCTATCCATG目的基因目的基因 TCCTAG AGGATCTTAA AATTCCATAC GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG GCCGTATG重组DNA分子的模拟制作1、用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要形成几个磷酸二酯键？2个3、外源基因（如抗虫基因）怎样才能运送到受体细胞（如棉花细胞）？需要“分子运输车”基因进入受体细胞的载体2、不同限制酶切割的末端，是否可以用DNA连接酶进行连接？不一定1.作用:将目的基因
20、转移到受体细胞中去利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制1234能够在宿主细胞中稳定保存和自我复制；具有一个或多个限制酶切位点，便于外源基因插入；具有标记基因，便于重组DNA的鉴定和筛选；对受体细胞无害；2.载体需具备的条件三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”载体上标记基因的标记原理普通培养基不含抗生素选择培养基50g/ml四环素四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、荧光蛋白基因有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。有多个切割位点能复制并带着插入的目的基因一起复制3.常用运载体：质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细胞核或拟核外的并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。噬菌体、动植
21、物病毒等思考：思考：若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用作为载体，其原因是。噬菌体噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕利用病毒对宿主细胞的侵染性（具物种或组织特异性）真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。（1）质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点）_。_。_。（2）质粒（是/不是）一种细胞器。（3）细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别化学本质不同：细胞膜上的载体：。基因工程中的载体可能是物质,如_;也可是生物,如_；也可是噬菌体的衍生物。功能不同：细胞膜上的载体功能是。基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把_.化学
22、本质和结构相同能够自我复制具有遗传效应或都能够指导蛋白质的合成等不是蛋白质质粒动植物病毒协助细胞膜控制物质进出细胞目的基因导入受体细胞【检测】辨析填空限制酶DNA连接酶载体对受体细胞无害；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因；能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、噬菌体、动植物病毒小结基因工程的基本工具作为载体的条件种类:磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键种类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶作用：把两条双链DNA片段拼接起来 探究实践DNA的粗提取与鉴定DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精DNA在不同
23、浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。0DNA溶解度NaCl浓度0.14mol/L 2mol/L利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。1.实验原理1、了解DNA的物理化学性质；理解DNA粗提取和鉴定的原理。2、学会DNA粗提取的方法以及利用二苯胺试剂对DNA进行鉴定2.目的要求DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。选材：试剂：研磨液体积分数为95%的酒精2mol/L的NaCl溶液二苯胺试剂蒸馏水析出
24、DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用3.实验材料不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核（无DNA）。含有NaCl、EDTA、SDS、Tris-HCl缓冲液（P117）4.实验步骤(1)称取约30g洋葱,切碎,然后放入研钵中,倒入10mL研磨液,充分研磨。(2)在漏斗中垫上纱布,将洋葱研磨液过滤到烧杯中,在4冰箱中放置几分钟后,再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心中,1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。过滤能用滤纸代替吗？不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。可能含有DNA、RN
25、A以及蛋白质、脂质、糖类等。（1）取材研磨（2）去除滤液中的杂质低温放置几分钟的作用抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置23min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。（1）冷却的酒精溶液(体积分数95)作用：抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂
26、。抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出避免破坏DNA不能形成絮状沉淀。蛋白质溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。（3）DNA的析出(4)取两支20mL的试管,各加入2mol/L的NaC1溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaC1溶液中。然后,向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后,比较两支试管中溶液颜色的变化。（4）DNA的鉴定【请同学们补充完整以下实验步骤】试管编号A（对照组）B（实验组）步骤12mol/L的NaC1溶液5mL步骤2不进行任何处理步骤3步骤4沸水浴加热5min实验现象溶液不变蓝色实验结论加丝状物或沉淀物加4m
27、L的二苯胺试剂溶液逐渐变蓝DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺试剂会被染成蓝色注意事项1以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2.利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。3加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。4加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。5预冷的酒精具有以下优点：可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。刑侦破案刑侦破案拓展：DNA提取的应
28、用基因组测序基因组测序插入人胰岛素基因插入人胰岛素基因的大肠杆菌的大肠杆菌基因工程基因工程亲子鉴定亲子鉴定1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误。本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试
29、剂显色的深浅等，看看哪种实验材料，哪种提取方法的效果更好。6.结果分析与评价实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层。中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。【进一步探究】【进一步探究】一、概念检测1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种
30、工具酶。下列相关叙述正确的是（）A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端练习与应用C2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（）A.大肠杆菌的质粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用来识别特定基因的DNA探针A2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶Hind、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位
31、点如下。（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接?为什么?Xba。因为Xba与Spe切割产生了相同的黏性末端。二、拓展应用（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义?提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。二、拓展应用