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1、基因工程按照人们的愿望,通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。操作环境：原理：操作对象：操作水平：结果：意义：体外环境基因重组基因分子水平赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍基因工程诞生的理论基础拼接的基础：表达的基础：1.DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）2.都遵循碱基互补配对原则3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构1.基因是控制生物性状的结构与功能单位2.遗传信息的
2、传递都遵循中心法则3.生物界几乎共用一套遗传密码回顾旧知1.基因是什么？2.基因的功能是什么？基因是有遗传效应的DNA片段基因通过控制蛋白质的合成，直接或间接控制生物的性状DNAmRNA蛋白质转录（RNA聚合酶）翻译DNA：组成元素:C H O N P DNA中文全称:脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸基本单位:脱氧核糖脱氧核糖核苷酸核苷酸=磷酸+脱氧核糖+含氮碱基脱氧核糖含氮碱基磷酸14325A T G C脱氧核苷酸脱氧核苷酸(4种)胞嘧啶脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸脱氧核苷酸如何链接成脱氧核苷酸链的呢？脱氧核糖A磷酸脱氧核糖G磷酸脱氧核糖T磷酸T磷酸脱氧核糖C磷酸脱
3、氧核糖A磷酸脱氧核糖氢键磷酸二酯键双螺旋结构5335DNA的结构特点：和和 交替连接，排列在外交替连接，排列在外侧，构成侧，构成 ；排列在内侧。排列在内侧。两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过 连接成连接成碱碱基对基对，且遵循，且遵循 。DNADNA是由两条单链组成的，这两条是由两条单链组成的，这两条链按链按 方式盘旋成双螺旋结方式盘旋成双螺旋结构。构。反向平行反向平行脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基基本骨架基本骨架氢键氢键碱基互补配对原则碱基互补配对原则 DNA聚合酶：解旋酶：磷酸二酯键氢键 ATGCCGTGGAATTCC ATGCCGTGGAATTCC TACGGCACCTTAAGG TA
4、CGGCACCTTAAGG 磷酸二酯键磷酸二酯键氢键氢键重组DNA技术的基本工具第1 1节1.准确切割DNA分子的“分子手术刀”2.将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”3.将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”1.“分子手术刀”限制性内切核酸酶1.来源：主要来自原核生物2.种类：数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶）3.特点：具有专一性能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开【无法识别切割RNA】【即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子】4.作用部位：特定切点上的磷酸二酯键限制酶存在于原核生物中的作用是什么？主要
5、起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的几种常见的限制酶的识别序列及切割位点：特点：大多数限制酶的大多数限制酶的识别序列识别序列由由6 6个核苷酸组个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由成，少数限制酶的识别序列由4 4个、个、8 8个个或其或其他数量他数量的核苷酸组成。的核苷酸组成。呈呈现现碱碱基基互互补补对对称称，都都可可以以找找到到一一条条中中心心轴轴线线，中中轴轴线线两两侧侧的的双双链链DNADNA上上的的碱碱基基是是反向对称重复反向对称重复排列的排列的 ，称为，称为回文序列回文序列。拓展：限制酶的名字的由来拓展：限制酶的名字的由来 P72 P72E EcocoRR种加词头两个字
6、母菌株型号数字表示分离出来的第几种限制酶属名首字母EcoR：大肠杆菌（：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；型菌株中分离出的第一个限制酶；Sma：粘质沙雷氏菌：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。中分离出的第一个限制酶。1111黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。被限制酶切开的被限制酶切开的被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口，两条单链的切口，两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个带有几个带有几个带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正好，他们之间
7、正好，他们之间正好，他们之间正好互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。EcoRI 限制酶的切割：平末端平末端平末端SmaI 限制酶的作用：只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNADNA两两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平末端。（1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？（2）请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。探究活动一、用剪刀模拟EcoRI剪切目的基因(Bt基因
8、)操作5.G3.CTTAAAATTC.3G.5黏性末端黏性末端目的基因黏性末端黏性末端(3)要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。思考与讨论1.请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？不能(2)请结合右图，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？消耗2分子水。断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；2.请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割
9、产生的黏性末端是否一定不同？同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端3.请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。三4.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？含含某某种种限限制制酶酶的的细细菌菌的的DNA分分子子不不具具备备这这种种限限制制酶酶的的识识别别序序列列，或或者者甲甲基基化化酶酶将将甲甲基基转转移移到到了了限限制制酶酶所所识识别别序序列列的的碱碱基基上上，使使限限制制酶酶不不能能将将其其切开。切开。2.“分子缝合针”DNA连接酶1.作用：将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的
10、两个核苷酸之间的磷酸二酯键 2.种类：Ecoli DNA连接酶T4 DNA连接酶来源来源大肠杆菌T4噬菌体相同点相同点恢复磷酸二酯键不同点不同点只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)181802两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！DNA连接酶的缝合作用191902“分子缝合针”-DNA连接酶（1 1）Ecoli DNAEcoli DNA连接酶连接酶或或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接连接粘性末端粘性末端202002“分子缝合针”-DNA连接酶（2 2）T4 D
11、NAT4 DNA连接酶连接酶连接连接平末端，效率低平末端，效率低3.DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；DNA连接酶连接的是DNA片段。名称名称作用部位作用部位作用作用结果果限制限制酶 DNA连接接酶DNA聚合聚合酶DNA(水解水解)酶解旋解旋酶磷酸二酯键碱基对之间的氢键将DNA切成两个片段磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将双链DNA分子局部解旋为单链3.“分子运输车”基因进入受体细胞的载体1.作用：将
12、外源基因送入受体细胞,在受体细胞内对目的基因进行大量复制.2.种类：质粒、噬菌体 动物病毒 植物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞 将外源基因导入动物细胞 将外源基因导入植物细胞 3.质粒：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。4.运载体需具备的条件：能进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中有特殊的标记基因，比如：四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因，便于重组DNA分子的筛选对受体细胞无害、易分离真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上
13、进行过人工改造的。5.思考：将含有目的基因的DNA与质粒分别用同样的限制酶切割，在DNA连接酶的作用下，由两个DNA片段连结成的产物有几种？目的基因限制酶DNA连接酶载体对受体细胞无害；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因；能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、噬菌体、动植物病毒基因工程的基本工具作为载体的条件种类：磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键 种类：E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶作用：把两条双链DNA片段拼接起来 课堂小结4.DNA的粗提取与鉴定1.原理：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒
14、精初步分离DNA和蛋白质DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液溶解DNA在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色鉴定DNA2.选材：DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。（注意：（注意：不能选择不能选择哺乳动物成熟的红细胞哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞没有细胞核和线粒体，几乎不含核和线粒体，几乎不含DNADNA。）视频演示：视频演示：DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定28称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心
15、管中离心，取 。在上清液中加入体积相等的、溶液,静置23min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA。2.去除杂质3.DNA的析出1.破碎细胞洋葱研磨液上清液上清液预冷的酒精白色丝状物用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。析出DNA3.方法步骤：29将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min4.DNA的鉴定二苯胺2mol/L的NaCl空白对照组：在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。思考：如何评价结果？看提取物颜色看与二苯胺反应颜色的深浅DNA纯度DNA的量(1)通过基因工程产生
16、的变异是不定向的()(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列()(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来()(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同()判断正误(5)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因()(6)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体()(7)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同()(8)作为载体，必须要有标记基因()1.(2022天天津津耀耀华华中中学学高高二二期期中中)以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是()典题应用A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的B.片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成
17、的C.和两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键D D2.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是()A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端CC3.下列关于基因运输工具载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是()A.能够复制，以便目的基因插入其中B.具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达C.具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选D.对
18、受体细胞无害，便于重组DNA的筛选典题应用CC4.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是()插入点细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况细菌在含四环素的培养基上的生长状况能生长能生长能生长不能生长不能生长能生长A.是c；是b；是aB.是a和b；是a；是bC.是a和b；是b；是aD.是c；是a；是bA A5.科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术基因工程
19、。实施该工程的最终目的是()A.定向提取生物体的DNA分子B.定向地对DNA分子进行人工“剪切”C.在生物体外对DNA分子进行改造D.定向地改造生物的遗传性状D D6.科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列关于这一先进技术的理论依据不正确的是()A.所有生物共用一套遗传密码B.基因能控制蛋白质的合成C.兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都 遵循相同的碱基互补配对原则D.兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先D D7.据图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是()A.限制性内切核酸酶可以切断a处B.DNA聚合酶可以连接a处C.解旋酶
20、可以使b处解开D.DNA连接酶可以连接c处D D8.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是()A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNAB B9.限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。如图所示为四种限制酶BamH、EcoR、Hind以及Bgl的识别序列，箭头表示每一种限制酶的特定切割位点，切割出来的DNA片段末端可以互补黏合的是 (限制酶
21、)，其正确的末端互补序列应该为()A.BamH和EcoR；末端互补序列为 AATTB.BamH和Hind；末端互补序列为 GATCC.EcoR和Hind；末端互补序列为AATTD.BamH和Bgl；末端互补序列为GATCD D10.(2022天天津津静静海海高高二二阶阶段段练练习习)有关下图所示的黏性末端的说法，错误的是()A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲与丙的黏性 末端不互补C.DNA连接酶的作用位点是a处D.切割产生甲的限制酶识别的核苷酸序列是“CAATTG”D D11.质粒是基因工程中最常用的外源基因运载工具。下
22、列有关叙述正确的是()A.质粒只分布于原核细胞中B.在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点C.携带外源基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的DNA上才会随后者的 复制而复制D.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA分子的筛选D D12.(2022重庆重庆市市第一中学期末第一中学期末)下列关于质粒的叙述，正确的是()A.细菌质粒和真核细胞DNA的基本组成单位不同B.细菌质粒的复制过程一定是在受体细胞外独立进行的C.质粒是存在于所有细胞中的蛋白质合成的场所D.质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子D D13.(2022云云南南曲曲靖靖高高二二期期中中)如表列举了几种限制酶的识别序列及其
23、切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。如图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是()A.BamH切割的是氢键，Alu切割的是磷酸二酯键B.Sau3A和BamH切割的序列产生的片段能够相连，连接后的片段还能被 Sau3A切割C.DNA连接酶能连接，不能连接D.E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接，且连接效率低B B14.(2022安安徽徽芜芜湖湖高高二二期期中中)某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。下列叙述错误的是()a酶切割产物(bp)b酶再次
24、切割产物(bp)2 100；1 400；1 000；5001 900；200；800；600；1 000；500A.a酶与b酶切断的化学键相同B.a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接C.a酶与b酶切割该DNA分子位点分别有3个和5个D.限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子CC15.(2022甘甘肃肃金金昌昌高高二二期期中中)下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是()A.用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有4个磷酸二酯键 被断开B.限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小C.CATG和GGATCC序列被限制酶切出的黏性末端可用 DNA连接酶连接D.只有用
25、相同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组 质粒A A16.(2022河河南南洛洛阳阳高高二二期期中中)已知限制性内切核酸酶Xma和Sma的识别序列分别为CCCGGG和CCCGGG。下列有关这两种限制酶及应用的叙述，不正确的是()A.这两种限制酶作用的底物都是双链DNA，切开磷酸二酯键B.这两种限制酶切割后形成的末端不同C.Sma切割DNA后形成的末端可用E.coli DNA连接酶连接D.使用这两种酶时需注意控制反应温度、时间等CC17.(2022吉吉林林长长春春高高二二质质检检)下图所示的酶M和酶N是两种限制酶，图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未作注明。下
26、列叙述中不正确的是()A.多个片段乙与丁混合在一起，可用DNA连接酶拼接得到环状DNAB.多个片段乙与丁混合，只由两个DNA片段连接成的环状DNA分子共有4种C.一种限制酶只能识别双链DNA中某种特定的脱氧核糖核苷酸序列D.若酶M特异性剪切的DNA片段是 ，则酶N特异性剪切的DNA 片段是 B B18.根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制酶切割DNA分子后产生的DNA片段，其末端类型通常有_和 。(2)质粒载体用限制酶X(识别的序列由6个核苷酸组成)切割后产生的片段如下：该酶识别的序列为 ，切割的部位是 。黏性平末端末端G和A之间的磷酸二酯键(3)为使切割后的载体与目的基因相连，含
27、有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外，还可用限制酶Y切割，两种酶共同的特点是_ _。两种限制酶切割后形成的黏性末端相同(4)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即 DNA连接酶和 DNA连接酶，其中后者只能连接一种末端。T4E.coli(5)基因工程中除质粒外，和 也可作为载体。噬菌体动植物病毒19.为制备目的基因Y(图1)与质粒X(图2)的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性内切核酸酶Bgl与BamH的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR。请回答下列问题：(1)根据图3分别写出Bgl与BamH酶切后形成的末端序列：_ _、。(2)使用Bgl处理重组质粒，可以得到 。长度为3 300 bp的环状DNA(3)Bgl酶切后的质粒X与BamH酶切后的目的基因Y能够连接的原因是 。酶切后产生相同的黏性末端，并遵循碱基互补配对原则(4)将连接后的产物转入一种Z细菌，Z细菌对卡那霉素敏感，且不能在缺乏亮氨酸的培养基中培养。要筛选含有重组质粒的Z细菌，应选择_ _的培养基。含卡那霉素但不含亮氨酸