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1、1.1.基因是什么？基因是什么？2.2.基因的功能是什么？基因的功能是什么？基因通过基因通过控制蛋白质的合成控制蛋白质的合成，直接或间接，直接或间接控制生物的性状控制生物的性状。转录转录DNADNAmRNAmRNA蛋白质蛋白质翻译翻译（RNARNA聚合酶）聚合酶）体现相关的生物性状体现相关的生物性状知识回顾知识回顾基因基因基因是有基因是有遗传效应遗传效应的的DNADNA片段。片段。DNADNA中文全称中文全称:组成元素组成元素:基本单位基本单位:脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖核酸核酸核酸核酸C H O N PC H O N P脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸=磷酸磷酸
2、+脱氧核糖脱氧核糖 +含氮碱基含氮碱基脱氧脱氧核糖核糖含氮碱基含氮碱基磷酸磷酸1 14 43 32 25 5A A T T G CG C脱氧核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸(4(4种种)知识回顾知识回顾DNADNA鸟嘌呤鸟嘌呤脱氧核苷酸脱氧核苷酸胞嘧啶胞嘧啶脱氧核苷酸脱氧核苷酸 胸腺嘧啶胸腺嘧啶脱氧核苷酸脱氧核苷酸腺嘌呤腺嘌呤脱氧核苷酸脱氧核苷酸脱氧脱氧脱氧脱氧核糖核糖核糖核糖A A A A磷酸磷酸磷酸磷酸脱氧脱氧脱氧脱氧核糖核糖核糖核糖GGGG磷酸磷酸磷酸磷酸脱氧脱氧脱氧脱氧核糖核糖核糖核糖T T T T磷酸磷酸磷酸磷酸T T T T磷酸磷酸磷酸磷酸脱氧脱氧脱氧脱氧核糖核糖核糖核糖C C
3、 C C磷酸磷酸磷酸磷酸脱氧脱氧脱氧脱氧核糖核糖核糖核糖A A A A磷酸磷酸磷酸磷酸脱氧脱氧脱氧脱氧核糖核糖核糖核糖氢键氢键氢键氢键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键脱氧核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸如何链接成如何链接成如何链接成如何链接成脱氧核苷酸链脱氧核苷酸链脱氧核苷酸链脱氧核苷酸链的的的的呢？呢？呢？呢？知识回顾知识回顾DNADNA双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构知识回顾知识回顾DNADNADNADNADNADNA的结构特点：的结构特点：的结构特点：的结构特点：533 35 5知识回顾知识回顾DNADNA 和和和和 交替连接，排列在交替连接，排列在交替连接，排列在交
4、替连接，排列在外侧，构成外侧，构成外侧，构成外侧，构成 ；排列在排列在排列在排列在内侧。内侧。内侧。内侧。两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过 连接成连接成连接成连接成碱基对碱基对碱基对碱基对，且遵循，且遵循，且遵循，且遵循 。DNADNADNADNA是由两条单链组成的，这两条链是由两条单链组成的，这两条链是由两条单链组成的，这两条链是由两条单链组成的，这两条链按按按按 方式盘旋成双螺旋结构。方式盘旋成双螺旋结构。方式盘旋成双螺旋结构。方式盘旋成双螺旋结构。反向平行反向平行反向平行反向平行脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸磷酸磷酸碱基碱基碱基碱基基本骨
5、架基本骨架基本骨架基本骨架氢键氢键氢键氢键碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则 ATGCCGTGGAATTCC ATGCCGTGGAATTCC TACGGCACCTTAAGG TACGGCACCTTAAGG 磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键氢键氢键氢键简图：简图：知识回顾知识回顾DNADNA操作环境及操作对象操作环境及操作对象操作环境及操作对象操作环境及操作对象原理原理原理原理操作水平操作水平操作水平操作水平结果结果结果结果体外环境；基因体外环境；基因体外环境；基因体外环境；基因分子水平分子水平分子水平分子水平概念概念基因工程基因工程基因重组基因重组基因
6、重组基因重组赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品们需要的新的生物类型和生物制品们需要的新的生物类型和生物制品们需要的新的生物类型和生物制品 基因工程基因工程基因工程基因工程是指按照人们的愿望，通过是指按照人们的愿望，通过是指按照人们的愿望，通过是指按照人们的愿望，通过转基因转基因转基因转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人
7、们需要的新的人们需要的新的人们需要的新的人们需要的新的生物类型和生物产品生物类型和生物产品生物类型和生物产品生物类型和生物产品。从技术操。从技术操。从技术操。从技术操作层面看，由于基因工程是在作层面看，由于基因工程是在作层面看，由于基因工程是在作层面看，由于基因工程是在DNADNADNADNA分子水平分子水平分子水平分子水平上进上进上进上进行设计和施工的，因此又叫作行设计和施工的，因此又叫作行设计和施工的，因此又叫作行设计和施工的，因此又叫作重组重组重组重组DNADNADNADNA技术技术技术技术。这种技术是在生物体外，通过对这种技术是在生物体外，通过对这种技术是在生物体外，通过对这种技术是在
8、生物体外，通过对DNADNADNADNA分子进行人工分子进行人工分子进行人工分子进行人工“剪切剪切剪切剪切”和和和和“拼接拼接拼接拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后，对生物的基因进行改造和重新组合，然后，对生物的基因进行改造和重新组合，然后，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞导入受体细胞导入受体细胞导入受体细胞内进行无性繁殖，内进行无性繁殖，内进行无性繁殖，内进行无性繁殖，使重组基因在使重组基因在使重组基因在使重组基因在受体细胞内表达受体细胞内表达受体细胞内表达受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。，产生出人类所需要的基因产物。，产生出人类所需要的基因产物。，产生
9、出人类所需要的基因产物。不同种生物的基因能不同种生物的基因能不同种生物的基因能不同种生物的基因能“拼接拼接拼接拼接”的理论基础：的理论基础：的理论基础：的理论基础：DNADNADNADNA都是由都是由都是由都是由4 4 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸组成组成组成组成目的基因目的基因目的基因目的基因在在在在受体细胞内受体细胞内受体细胞内受体细胞内表达原因：表达原因：表达原因：表达原因：地球上所有的生物共用地球上所有的生物共用地球上所有的生物共用地球上所有的生物共用一套密码子。一套密码子。一套密码子。一套密码子。双链双链双链双链DNADNADNADNA空间结构空间结构空间结
10、构空间结构都是都是都是都是规则的双螺旋规则的双螺旋规则的双螺旋规则的双螺旋结构结构结构结构基因工程的优点：基因工程的优点：基因工程的优点：基因工程的优点：定向改造生物遗传性状定向改造生物遗传性状定向改造生物遗传性状定向改造生物遗传性状克服远缘杂交不亲和的障碍克服远缘杂交不亲和的障碍克服远缘杂交不亲和的障碍克服远缘杂交不亲和的障碍 番番番番木木木木瓜瓜瓜瓜容容容容易易易易受受受受番番番番木木木木瓜瓜瓜瓜环环环环斑斑斑斑病病病病毒毒毒毒的的的的侵侵侵侵袭袭袭袭。当当当当番番番番木木木木瓜瓜瓜瓜被被被被这这这这种种种种病病病病毒毒毒毒感感感感染染染染后后后后，产产产产量量量量会会会会大大大大大大大大
11、下下下下降降降降。科科科科学学学学家家家家通通通通过过过过精精精精心心心心设设设设计计计计，用用用用“分分分分子子子子工工工工具具具具”培培培培育育育育出出出出了了了了转转转转基基基基因因因因番番番番木木木木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNADNADNADNA双双双双螺螺螺螺旋旋旋旋的的的的直直直直径径径径只只只只有有有有2 2 2 2 nm,nm,nm,nm,对对对对如如如如此此此此微微微微小小小小的的的的分分分分子子子子进进进进行行行行操操操操作作作作，是是是是一一一一项项项项非非非非常常常常精精精
12、精细细细细的的的的工工工工作作作作，更更更更需需需需要要要要专专专专门门门门的的的的“分分分分子子子子工工工工具具具具”。那那那那么么么么，科科科科学学学学家家家家究究究究竟竟竟竟用用用用到到到到了了了了哪哪哪哪些些些些“分分分分子工具子工具子工具子工具”？这些？这些？这些？这些“分子工具分子工具分子工具分子工具”各具有什么特征呢？各具有什么特征呢？各具有什么特征呢？各具有什么特征呢？准确切割准确切割准确切割准确切割DNADNADNADNA分子分子分子分子将将将将DNADNADNADNA片段片段片段片段连接起来连接起来连接起来连接起来“分子手术刀分子手术刀分子手术刀分子手术刀”“分子缝合针分子
13、缝合针分子缝合针分子缝合针”“分子运输车分子运输车分子运输车分子运输车”将体外重组好的将体外重组好的将体外重组好的将体外重组好的DNADNADNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞分子导入受体细胞分子导入受体细胞 第第1 1节节 重组重组DNADNA技术的基本工具技术的基本工具“分子手术刀分子手术刀”限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶DNADNA连接酶连接酶基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子缝合针分子缝合针”“分子运输车分子运输车”01限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀”1 1、来源：、来源：主要是从主要是从原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来的的
14、一类酶。一类酶。2、作用：、作用：识别识别双链双链DNA DNA 分子分子的某种的某种特定的特定的核苷酸序列核苷酸序列，并且使每一条链中并且使每一条链中特定部位特定部位的两的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。*确切来说应该是确切来说应该是催化催化磷酸二酯键断开磷酸二酯键断开*该过程该过程“特定特定”体现了酶的体现了酶的专一性专一性*限制酶只切割两个核苷酸限制酶只切割两个核苷酸之间的之间的磷酸二酯键磷酸二酯键。3.3.识别序列识别序列 大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由_个核苷酸组成，也有少数个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由限制酶的识别序列由_个
15、、个、_个或个或_的核苷酸组的核苷酸组成。成。6 6 6 64 4 4 48 8 8 8其他数量其他数量其他数量其他数量EcoREcoR5 5G-A-A-T-T-G-A-A-T-T-CC3 33 3C-T-T-A-A-C-T-T-A-A-G5G5SmaSma5 5C-C-C-G-G-C-C-C-G-G-GG3 33 3G-G-G-C-C-G-G-G-C-C-C5C5BamHBamH 5 5G-G-A-T-C-G-G-A-T-C-CC3 33 3C-C-T-A-G-C-C-T-A-G-G5G5TaqTaq5 5T-C-G-T-C-G-AA333 3A-G-C-A-G-C-T5T5*限制酶所识别的
16、序列的特限制酶所识别的序列的特限制酶所识别的序列的特限制酶所识别的序列的特点是：点是：点是：点是：呈现呈现呈现呈现碱基互补对称碱基互补对称碱基互补对称碱基互补对称，无论是无论是无论是无论是6 6 6 6个碱基还是个碱基还是个碱基还是个碱基还是4 4 4 4个碱基，个碱基，个碱基，个碱基，都可以找到一条都可以找到一条都可以找到一条都可以找到一条中心轴线中心轴线中心轴线中心轴线，中轴线两侧的双链中轴线两侧的双链中轴线两侧的双链中轴线两侧的双链DNADNADNADNA上的上的上的上的碱基是碱基是碱基是碱基是反向对称重复排列反向对称重复排列反向对称重复排列反向对称重复排列的的的的 ，称为，称为，称为，
17、称为回文序列回文序列回文序列回文序列。E EcocoR R属名属名属名属名EscherichiaEscherichiaEscherichiaEscherichia首字母首字母首字母首字母种名种名种名种名colicolicolicoli前两个字母前两个字母前两个字母前两个字母R R R R型菌株型菌株型菌株型菌株从中分离的第一个限制酶从中分离的第一个限制酶从中分离的第一个限制酶从中分离的第一个限制酶资料卡资料卡限制酶的命名限制酶的命名例如：例如：例如：例如：流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌(Haemophilus Haemophilus Haemophilus Haemophil
18、us influenzaeinfluenzaeinfluenzaeinfluenzae)d)d)d)d株株株株中先后分离中先后分离中先后分离中先后分离到到到到3 3 3 3种限制酶，则分别命名种限制酶，则分别命名种限制酶，则分别命名种限制酶，则分别命名为为为为:HinHinHinHind Id Id Id IHinHinHinHind IId IId IId IIHinHinHinHind IIId IIId IIId III4.4.切割结果切割结果 DNADNA分子经限制酶切割产生的分子经限制酶切割产生的DNADNA片段末端通常有两种形式片段末端通常有两种形式_和和_黏性末端黏性末端平末端平
19、末端（1 1）实例）实例1EcoR1EcoR限制酶切割限制酶切割 *EcoR *EcoR识别序列为识别序列为GAATTCGAATTC *EcoR *EcoR切割部位为切割部位为GAGA之间的磷酸二酯键之间的磷酸二酯键黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端*形成的黏性末端（从形成的黏性末端（从5 5往往3 3读）为读）为_*一个限制酶切割一次形成一个限制酶切割一次形成_个黏性末端个黏性末端*同一种限制酶切割形成的黏性末端同一种限制酶切割形成的黏性末端_*两个黏性末端有两个黏性末端有_个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。AATT-AATT-两两相同相同2 2（2 2）实例）实例2 2SmaSma限制酶切
20、割限制酶切割 *Sma *Sma识别序列为识别序列为CCCGGGCCCGGG *Sma *Sma切割部位为切割部位为CGCG之间的磷酸二酯键之间的磷酸二酯键平末端平末端现学现用：现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamH_ EcoRBamH_ EcoR_Hind_ Bgl _ Hind_ Bgl _ GATC-GATC-GATC-GATC-AATT-AATT-AATT-AATT-AGCT-AGCT-AGCT-AGCT-GATC-GATC-GATC-GATC-思考：思考：你从中发现什么现象了？你从中发现什么现象了？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端不同
21、的限制酶可能切割形成相同的黏性末端不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端现学现用：现学现用：以下黏性末端是由以下黏性末端是由_种限制酶作用产生的种限制酶作用产生的3 3 3 3思考：思考：你从中发现什么现象了？你从中发现什么现象了？相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的1.1.1.1.你你你你能能能能根根根根据据据据所所所所掌掌掌掌握握握握的的的的知知知知识识识识，推推推推测测测测限限限限制制制制酶酶酶酶存存存存在在在在
22、于于于于原原原原核核核核生生生生物物物物中中中中的的的的主主主主要要要要作作作作用用用用是是是是什么吗？什么吗？什么吗？什么吗？提提提提示示示示：原原原原核核核核生生生生物物物物容容容容易易易易受受受受到到到到自自自自然然然然界界界界外外外外源源源源DNADNADNADNA的的的的入入入入侵侵侵侵，所所所所以以以以它它它它在在在在长长长长期期期期的的的的进进进进化化化化过过过过程程程程中中中中形形形形成成成成了了了了一一一一套套套套完完完完善善善善的的的的防防防防御御御御机机机机制制制制。限限限限制制制制酶酶酶酶就就就就是是是是它它它它的的的的一一一一种种种种防防防防御御御御性性性性工工工工具
23、具具具。当当当当外外外外源源源源DNADNADNADNA入入入入侵侵侵侵时时时时，它它它它会会会会利利利利用用用用限限限限制制制制酶酶酶酶来来来来切切切切割割割割外外外外源源源源DNADNADNADNA，使使使使之之之之失失失失效效效效，以以以以保保保保证自身的安全。证自身的安全。证自身的安全。证自身的安全。2.2.2.2.为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA?DNA?DNA?DNA?提示：微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将提示：微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将提示：
24、微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将提示：微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的外源入侵的外源入侵的外源入侵的DNADNADNADNA降解掉。生物在长期的演化过程中，降解掉。生物在长期的演化过程中，降解掉。生物在长期的演化过程中，降解掉。生物在长期的演化过程中，含有某种限制酶的含有某种限制酶的含有某种限制酶的含有某种限制酶的细胞，其细胞，其细胞，其细胞，其DNADNADNADNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过分子中或者不具备这种
25、限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNADNADNADNA被切断，并且被切断，并且被切断，并且被切断，并且可以防止外源可以防止外源可以防止外源可以防止外源DNADNADNADNA
26、的入侵。的入侵。的入侵。的入侵。拓展思维：拓展思维：拓展思维：拓展思维：1.1.1.1.要想从一个要想从一个要想从一个要想从一个DNADNADNADNA分子中获得分子中获得分子中获得分子中获得某个特定的基因某个特定的基因某个特定的基因某个特定的基因需要有几个酶切位点？需要有几个酶切位点？需要有几个酶切位点？需要有几个酶切位点？产生几个末端？产生几个末端？产生几个末端？产生几个末端？2 24 4CTTCATG AATTCCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GAAGTACTTAA GA
27、AGTACTTAA GAAGTACTTAA GGGAT GGGAT GGGAT GGGAT T T T T GGCATCTTAAGGCATCTTAAGGCATCTTAAGGCATCTTAAAATTCCGTAG AATTCCGTAG AATTCCGTAG AATTCCGTAG GGCATCTTAAGGCATCTTAAGGCATCTTAAGGCATCTTAAAATTCCGTAG AATTCCGTAG AATTCCGTAG AATTCCGTAG CTTCATG AATTCCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA GA
28、AGTACTTAA GGGATT GAAGTACTTAA GGGATT GAAGTACTTAA GGGATT GAAGTACTTAA GGGATT CTTCATG AATTCCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GAAGTACTTAA GGGATT GAAGTACTTAA GGGATT GAAGTACTTAA GGGATT 使用使用EcoREcoR酶酶剪切剪切目的基因目的基因识别序列识别序列识别序列识别序列GAATTCGAATTCGAATTCGAATTCG A A T
29、T CG A A T T CG A A T T CG A A T T CC T T A A GC T T A A GC T T A A GC T T A A GG A A T T CG A A T T CG A A T T CG A A T T CC T T A A GC T T A A GC T T A A GC T T A A G A A T T C A A T T C A A T T C A A T T C G G G GG G G G C T T A A C T T A A C T T A A C T T A A 用同种限制酶切割用同种限制酶切割用同种限制酶切割用同种限制酶切割(Eco
30、EcoEcoEcoR)R)R)R)拓展思维：拓展思维：拓展思维：拓展思维：2.2.2.2.把两种来源不同的把两种来源不同的把两种来源不同的把两种来源不同的DNADNADNADNA进行重组，应该怎样处理？进行重组，应该怎样处理？进行重组，应该怎样处理？进行重组，应该怎样处理？缺口怎么办？缺口怎么办？缺口怎么办？缺口怎么办？种类种类种类种类EcoliEcoliEcoliEcoli DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T T T4 4 4 4 DNA DNA DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源作用作用作用作用相同点相同点相同点相同点大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌
31、T4T4T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体只能将只能将只能将只能将具有具有具有具有互补黏性末端互补黏性末端互补黏性末端互补黏性末端的的的的DNADNADNADNA片段片段片段片段连接连接连接连接起来起来起来起来既可以既可以既可以既可以“缝合缝合缝合缝合”双链双链双链双链DNADNADNADNA片段片段片段片段互互互互补的黏性末端，补的黏性末端，补的黏性末端，补的黏性末端，又可以又可以又可以又可以“缝合缝合缝合缝合”双链双链双链双链DNADNADNADNA片段的片段的片段的片段的平末端（但连接平末端（但连接平末端（但连接平末端（但连接平末端的效率相对较低）平末端的效率相对较低）平末端的效率相对较低
32、）平末端的效率相对较低）恢复恢复恢复恢复的都是的都是的都是的都是磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键 02DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”1.DNA1.DNA1.DNA1.DNA连接酶作用连接酶作用连接酶作用连接酶作用2 2 2 2.基因工程常用的基因工程常用的基因工程常用的基因工程常用的DNADNADNADNA连接酶有两种：连接酶有两种：连接酶有两种：连接酶有两种：将将将将双链双链双链双链DNADNADNADNA片段片段片段片段“缝合缝合缝合缝合”起来，恢复被限制酶切开的起来，恢复被限制酶切开的起来，恢复被限制酶切开的起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的两个核苷酸之间
33、的两个核苷酸之间的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键，形成重组，形成重组，形成重组，形成重组DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。两两两两DNADNADNADNA片段要具有片段要具有片段要具有片段要具有互补的黏性互补的黏性互补的黏性互补的黏性末端末端末端末端才能拼起来才能拼起来才能拼起来才能拼起来可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙缝隙缝隙“缝合缝合缝合缝合”起来起来起来起来，注意：注意：注意：注意：DNADNADNADNA连接酶可连接双链连接酶可连接双链连接酶可连接双链连接酶可连接双链DNADNADNADNA中的两条
34、单链缺口，但不能连接单链中的两条单链缺口，但不能连接单链中的两条单链缺口，但不能连接单链中的两条单链缺口，但不能连接单链DNADNADNADNA！Ecoli Ecoli Ecoli Ecoli DNADNADNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用 A A T A A T T T GGC CA AA AT TT TA AA AT TT TDNA聚合聚合酶DNA聚合聚合酶 DNA聚合聚合酶DNA聚合聚合酶旁栏思考：旁栏思考：DNADNA连接酶和连接酶和DNADNA聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？只能将单个核苷酸连接到已有只能将单个核苷酸连接到
35、已有的核苷酸链上的核苷酸链上，形成磷酸二酯键，形成磷酸二酯键DNA聚合酶作用示意图：聚合酶作用示意图：DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶A AT TA AG GT TC CC CG GA AA AT TT T连接两个连接两个DNADNA片段片段DNA连接酶作用示意图：连接酶作用示意图：归纳总结归纳总结3.DNA连接酶和连接酶和DNA聚合酶的比较聚合酶的比较比较项目比较项目DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶相同点相同点作用实质作用实质不不同同点点模板模板作用对象作用对象作用结果作用结果都能催化都能催化都能催化都能催化形成形成形成形成_不需要不需要_作作作作模板模板模板模板形成完整
36、的重组形成完整的重组形成完整的重组形成完整的重组DNADNADNADNA分子分子分子分子形成形成形成形成DNADNADNADNA的一条链的一条链的一条链的一条链只能将只能将只能将只能将单个核苷酸连接到单个核苷酸连接到单个核苷酸连接到单个核苷酸连接到已有已有已有已有的核苷酸链的核苷酸链的核苷酸链的核苷酸链上上上上，形成，形成，形成，形成磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键在在在在两个两个两个两个DNADNADNADNA片段片段片段片段之之之之间形成间形成间形成间形成磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键需要需要需要需要DNADNADNADNA的一条链
37、的一条链的一条链的一条链4.DNA4.DNA4.DNA4.DNA连接连接连接连接酶、酶、酶、酶、DNADNADNADNA聚合酶、限制酶、解旋酶的比聚合酶、限制酶、解旋酶的比聚合酶、限制酶、解旋酶的比聚合酶、限制酶、解旋酶的比较较较较种类种类种类种类作用作用作用作用作用部位作用部位作用部位作用部位DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶限制酶限制酶限制酶限制酶DNADNADNADNA酶酶酶酶解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶连接连接连接连接两个两个两个两个DNADNADNADNA片段片段片段片段形成形成形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键
38、将将将将单个的脱氧核苷酸单个的脱氧核苷酸单个的脱氧核苷酸单个的脱氧核苷酸连接的连接的连接的连接的已已已已有的核苷酸链有的核苷酸链有的核苷酸链有的核苷酸链上上上上形成形成形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键识别特定识别特定识别特定识别特定脱氧核苷酸序列脱氧核苷酸序列脱氧核苷酸序列脱氧核苷酸序列有特定的有特定的有特定的有特定的切割位点切割位点切割位点切割位点破坏破坏破坏破坏磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键催化催化催化催化DNADNADNADNA水解水解水解水解为为为为脱氧核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸破坏破坏破坏破坏磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键解开解开解开解开
39、DNADNADNADNA的的的的双螺旋双螺旋双螺旋双螺旋结构结构结构结构破坏破坏破坏破坏氢键氢键氢键氢键下图为下图为 DNA DNA 分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、表示限制酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA连接酶、解旋酶作用的正确连接酶、解旋酶作用的正确顺序是：（顺序是：（）A.B.A.B.C.D.C.D.B B学以致用学以致用据图所示据图所示,有关工具酶功能的叙述不正确的是有关工具酶功能的叙述不正确的是A.A.限制性核酸内切酶可以切断限制性核酸内切酶可以切断a a处处,DNA,DNA连接酶可以连接连接酶可以连接a a
40、处处B.DNAB.DNA聚合酶可以连接聚合酶可以连接a a处处C.C.解旋酶可以使解旋酶可以使b b处解开处解开D.D.连接连接c c处的酶可以为处的酶可以为DNADNA连接酶连接酶D D1.1.1.1.最常用的载体最常用的载体最常用的载体最常用的载体质粒质粒质粒质粒:一种一种一种一种裸露裸露裸露裸露的的的的、结构简单、独立于真核细胞细胞核、结构简单、独立于真核细胞细胞核、结构简单、独立于真核细胞细胞核、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核或原核细胞拟核或原核细胞拟核或原核细胞拟核DNADNADNADNA之之之之外外外外，并并并并具有自我复制能力具有自我复制能力具有自我复制能力具有自我
41、复制能力的的的的环状双链环状双链环状双链环状双链DNADNADNADNA分子分子分子分子。03基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”有多个限制酶切割位点有多个限制酶切割位点DNA分子复制的起点分子复制的起点保证保证插入目的基因大量复制插入目的基因大量复制特殊的标记基因特殊的标记基因作用：鉴别作用：鉴别和和筛选含有目的基因的受筛选含有目的基因的受体细胞体细胞抗生素的抗生素的抗性基因抗性基因、绿色荧光基因绿色荧光基因等作为等作为标记基因标记基因。2.2.载体需具备的条件载体需具备的条件拟核质粒大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因目的基因复制起点（1 1）能在宿主细胞内）能在宿主
42、细胞内稳定保存稳定保存并自我并自我复制复制。（2 2）有）有一个至一个至多个限制酶切点多个限制酶切点，以便插以便插入（携带）目的基因。入（携带）目的基因。（3 3）具有具有某些标记基因某些标记基因，以便，以便鉴定和筛鉴定和筛选选出出含目的含目的基因基因的受体细胞。的受体细胞。（4 4）对宿主细胞无害对宿主细胞无害。3 3.其他载体其他载体拟核质粒大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因目的基因复制起点在基因工程中使用的载体在基因工程中使用的载体除质粒除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等外，还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源复制方式以及
43、可以插入外源DNADNA片片段的大小也有很大差别。段的大小也有很大差别。在基因工程操作中，真正被用在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过的基础上进行过人工改造人工改造的的。农杆菌的农杆菌的TiTi质粒上多种限制酶，已知其中质粒上多种限制酶，已知其中HindHind、BamHBamH和和BglBgl识别的序列和切点分别是识别的序列和切点分别是-AACGTT-AACGTT-和和-GGATCC-GGATCC-和和-AGATCT-AGATCT-，请请回答下列问题。回答下列问题。小试牛刀小试牛刀（2 2）在在DNADNA连接酶的作用下，用限制酶连
44、接酶的作用下，用限制酶HindHind、BamHBamH切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？不能，因为它们形成黏性末端不同。不能，因为它们形成黏性末端不同。（1 1）请尝试写出限制酶作用后形成的黏性末端。）请尝试写出限制酶作用后形成的黏性末端。(3)(3)若若改用限制酶改用限制酶BamHBamH和和BglBgl切割后，用切割后，用DNADNA连接连接酶能否起来呢？酶能否起来呢？能能（4 4）DNADNA连接酶是将两个连接酶是将两个黏性末端的碱基连接吗黏性末端的碱基连接吗？不是。不是。不能。不能。（3 3）若用限制酶若用限制酶BamHBamH和和B
45、glBgl切割后，在切割后，在DNADNA连接酶连接酶作用下形成重组作用下形成重组DNADNA能否再被这两种酶所识别和切割？能否再被这两种酶所识别和切割？（提示两种酶识别序列和切割位点（提示两种酶识别序列和切割位点-GGATCC-GGATCC-和和-AGATCT-AGATCT-）是恢复两个是恢复两个DNADNA片段之间的磷酸二酯键。片段之间的磷酸二酯键。（1 1）能不能使用）能不能使用SmaSma限制酶切割限制酶切割用图中的质粒和外源用图中的质粒和外源DNADNA构建重组质粒？为什么？构建重组质粒？为什么？图图1 1、2 2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：中箭头表示相关限制酶的
46、酶切位点。请回答下列问题：不能，不能，SmaSma会破坏质粒上抗性基因和目的基因会破坏质粒上抗性基因和目的基因能力提升能力提升（2 2）某科学工作者用某科学工作者用EcoREcoR切割目的基因和载体，发现很切割目的基因和载体，发现很难得难得到需的的重组质粒，请你帮助他分析原因？到需的的重组质粒，请你帮助他分析原因？载体载体载体载体-载体连接载体连接载体连接载体连接物物物物目的基因目的基因目的基因目的基因-载体连接物载体连接物载体连接物载体连接物（重组（重组（重组（重组DNADNADNADNA）目的基因目的基因目的基因目的基因-目的基因目的基因目的基因目的基因连接物连接物连接物连接物出现目的基因
47、、质粒的自身环化、出现目的基因、质粒的自身环化、任意连接任意连接。（3 3）如果是你是科学家，能给出什么建议？说出你的理由。）如果是你是科学家，能给出什么建议？说出你的理由。避免目的基因、质粒的自身环化和避免目的基因、质粒的自身环化和反向反向连接连接，从而，从而保保证目的基因和质粒的定向连接。证目的基因和质粒的定向连接。BamHBamH和和HindHind选择限制酶的方法：选择限制酶的方法：应选择切点应选择切点位于目的基因两端位于目的基因两端的限制酶的限制酶不能不能选择位于选择位于目的基因和标记基因内部目的基因和标记基因内部的限制酶如的限制酶如SamSam因为该酶因为该酶破坏目的基因和标记基因
48、破坏目的基因和标记基因为了避免目的基因和质粒为了避免目的基因和质粒自身环化自身环化和和任意连接任意连接，使用使用不同不同的限制酶（形成的的限制酶（形成的不同不同黏性末端黏性末端）如图甲选择）如图甲选择BamHBamH和和HindHind(要确保质粒上也有这两种酶要确保质粒上也有这两种酶）小结小结若要利用某目的基因若要利用某目的基因若要利用某目的基因若要利用某目的基因(见图甲见图甲见图甲见图甲)和和和和P1P1P1P1噬菌体载体噬菌体载体噬菌体载体噬菌体载体(见图乙见图乙见图乙见图乙)构建重组构建重组构建重组构建重组DNA(DNA(DNA(DNA(见图见图见图见图丙丙丙丙)，限制性核酸内切酶的酶
49、切位点分别是，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglBglBglBgl(AGATCT)(AGATCT)(AGATCT)(AGATCT)、EcoEcoEcoEcoR(GAATTC)R(GAATTC)R(GAATTC)R(GAATTC)和和和和SauSauSauSau3A(GATC)3A(GATC)3A(GATC)3A(GATC)。下列分析合理的是。下列分析合理的是。下列分析合理的是。下列分析合理的是A.A.用用EcoEcoRR切割目的基因和切割目的基因和P1P1噬菌体载体噬菌体载体B.B.用用BglBgl和和EcoEcoRR切割
50、目的基因和切割目的基因和P1P1噬菌体载体噬菌体载体C.C.用用BglBgl和和SauSau3A3A切割目的基因和切割目的基因和P1P1噬菌体载体噬菌体载体D.D.用用EcoEcoRR和和SauSau3A3A切割目的基因和切割目的基因和P1P1噬菌体载体噬菌体载体D D基因工程中，需使用特定限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和基因工程中，需使用特定限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶筛选。已知限制酶I I的识别序列和切点是的识别序列和切点是-GGATCC-;-GGATCC-;，限制酶，限制酶II II的识别序列和切点是的识别序列和切点是-GATC-GATC-。根据图示判断下列操