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1、3.2 基因工程的基本操作程序非转基因抗虫棉转基因抗虫棉从社会中来 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？与载体与载体拼接拼接 普通棉花（无抗虫特性）（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉（有抗虫特性）（有抗虫特性）导入导入抗虫基因重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的 检测与鉴定从社会中来第一步：目的基因的筛选与获取目的基因
2、：用于用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因等的基因。主要是主要是编码编码蛋白质蛋白质的的基因基因 根据不同的需要，根据不同的需要，目的基因是不同的目的基因是不同的 资料一资料一 棉花本身不具有抗虫基因。苏云金杆菌有一种抗虫基因，能棉花本身不具有抗虫基因。苏云金杆菌有一种抗虫基因，能 表达出抗虫蛋白来杀死棉铃虫。利用基因工程将抗虫基因导表达出抗虫蛋白来杀死棉铃虫。利用基因工程将抗虫基因导 入棉花细胞，培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种。入棉花细胞，培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种。资料二资料二 胰岛素是治疗糖尿病的特效药。健康人含有胰岛素基因，能胰岛
3、素是治疗糖尿病的特效药。健康人含有胰岛素基因，能 表达胰岛素，从而降低血糖浓度。大肠杆菌本身不具有胰岛表达胰岛素，从而降低血糖浓度。大肠杆菌本身不具有胰岛 素基因。素基因。19781978年，科学家将编码人胰岛素的基因导入大肠杆年，科学家将编码人胰岛素的基因导入大肠杆 菌细胞中，使大肠杆菌表达重组人胰岛素。菌细胞中，使大肠杆菌表达重组人胰岛素。什么是目的基因？第一步：目的基因的筛选与获取 实例实例如生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。如生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。人胰岛素基因、人胰岛素基因、人干扰素基因等人干扰素基因等抗虫基因、抗
4、虫基因、抗病基因、抗病基因、抗除草剂基因等抗除草剂基因等第一步：目的基因的筛选与获取 如何筛选目的基因？苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。杀死棉铃虫。苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害。研究表明，苏云金杆菌的杀虫作用与花虫害。研究表明，苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关。基因有关。Bt基因基因是培育转是培育转基因抗虫棉较为基因抗虫棉较为合适的目的基因合适的目的基因科学家不仅掌握科学家不仅掌握Bt基因的序列信
5、息，也对基因的序列信息，也对Bt基基因的表达产物因的表达产物Bt抗虫蛋白有了较为深入的抗虫蛋白有了较为深入的了解。了解。第一步：目的基因的筛选与获取 相关信息Bt抗虫蛋白会对人畜产生不良影响吗？当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。苏苏云云金金杆杆菌菌伴伴孢孢晶晶体体蛋蛋白白目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。DNA测序仪测序仪核苷酸序列比对核苷酸序列比对氨基酸氨
6、基酸序列比对序列比对序列数据库序列数据库 明确了目的基因后，该怎么获得它?第一步：目的基因的筛选与获取DNA合成仪合成仪在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。第一步：目的基因的筛选与获取摘要摘要 根据苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白根据苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1A(b)和和Cry1A(c)的氨基酸序列的氨基酸序列，采用植物采用植物偏爱密码子偏爱密码子，人工合人工合成成了全长了全长1824bp 的融合的融合GFM Cry1A Bt杀虫基因杀虫基因，并构建了带有多并构建了带有多个表达调控元件的该基因高效植物表达载体个表达调控元件的该基因高效植物表达载
7、体pGB11214AB，以及该基因和修饰以及该基因和修饰豇豇豆胰蛋豆胰蛋白酶抑制剂白酶抑制剂(CpTI)基因的双价杀虫基因植物表达载体基因的双价杀虫基因植物表达载体 pGB11214ABC。经在烟草中验证。经在烟草中验证，这两种表达载体在植物中可高效表达并赋予转基因烟草抗虫性。为我国抗虫棉的研究打这两种表达载体在植物中可高效表达并赋予转基因烟草抗虫性。为我国抗虫棉的研究打下了基础。下了基础。获取目的基因Bt基因较小，序列已知DNA自动合成仪第一步：目的基因的筛选与获取基因文库的概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，成为基因文
8、库。基因组文库一种生物的所有基因 多针对原核生物部分基因组文库一种生物的部分基因 多针对真核生物基因文库的种类：第一步：目的基因的筛选与获取基因文库的构建：第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取cDNA文库和基因组文库的比较：文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种基因的部分基因某种生物的全部基因物种间基因交流可以部分基因可以苏云金杆菌苏云金杆菌Bt基因基因？快速获得大量快速获得大量Bt基因基因PCRPCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCR是是一一项项根根据据DNA半半保保留留复复制制的的原原理理，在在体体外外提提供供参参与与DN
9、A复复制制的的各种组分与反应条件各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。利用PCR获取和扩增目的基因第一步：目的基因的筛选与获取提取提取获取目的基因的三种方法：人工合成获取从基因文库获取通过PCR技术获取DNA体内复制的条件体内复制的条件第一步：目的基因的筛选与获取DNA体内复制的条件体内复制的条件第一步：目的基因的筛选与获取引物是一小段能与引物是一小段能与DNADNA母链的一段碱基序母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。列互补配对的短单链核酸。体内复制的引物为体内复制的引物为RNARNA单链单链。第一步：目的基因的筛选与获取
10、DNA体外复制（PCR）的条件第一步：目的基因的筛选与获取解旋553355335533DNA体外复制（PCR）的条件水解产生的能量为合成水解产生的能量为合成DNADNA子子链提供能量，因此体系中不需链提供能量，因此体系中不需要添加要添加ATPATP。体外复制的引物一般为体外复制的引物一般为DNADNA单单链链。第一步：目的基因的筛选与获取耐高温的DNA聚合酶4种脱氧核苷酸引物待扩增的DNA片段55变性复性延伸温度上升到90以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成
11、新的DNA链。第一步：目的基因的筛选与获取思考：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分分子中分离出目的基因？离出目的基因？5355第一次循环第二次循环35第三次循环33第一步：目的基因的筛选与获取思考：用用PCR可以扩增可以扩增mRNA吗？吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。第二步：基因表达载体的构建 不能。游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入
12、棉花细胞呢？（核心工作）思考：各个元件各个元件有什么作用？有什么作用？因此，获取Bt基因后，还需要借助载体将其导入棉花细胞，才能使棉花植株获得抗虫特性。第二步：基因表达载体的构建目的基因：能控制表能控制表达所需要的特殊性状达所需要的特殊性状启动子：位置：基因的上游基因的上游功能：RNA聚合聚合酶酶识别识别和结合的部位，驱动基和结合的部位，驱动基因转录出因转录出mRNA。复制原点：DNA复制的起始位点复制的起始位点终止子：位置：基因的下游基因的下游功能：终止转录终止转录标记基因：便于重组便于重组DNA分子的筛选。分子的筛选。第二步：基因表达载体的构建第二步：基因表达载体的构建 如何构建抗虫棉的基
13、因表达载体？用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有Bt基因的DNA片段。将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。第二步：基因表达载体的构建同一限制酶切割获得的目的基因和载体混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有（仅考虑两两连接）切割质粒和含目的基因的DNA片段的限制酶一般是同一种酶，也可以是不同限制酶，只要获得能互补的末端即可。但有时可用两种限制酶同时切割质粒和含目的基因的DNA片段，这样可保证目的基因和质粒的定向连接，防止目的基因和质粒的自我环化。当堂练习牛刀小试癌症患者进行化疗或放疗之后，体内
14、白细胞数量大幅度降低，可以注射粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)增加白细胞的数量。在自然条件下，此细胞因子的含量很低，很难获得。某科研团队将人的GM-CSF基因导入大肠杆菌，大量生产重组GM-CSF，满足了临床需求请问构建GM-CSF表达载体需要()同一种限制性内切核酸酶 具有某些标记基因的质粒 RNA聚合酶 人GM-CSF基因 DNA连接酶 启动子 终止子 A.B.C.D.D第三步：将目的基因导入受体细胞花粉管通道法（我国科学家独创）（我国科学家独创）花粉管通道法的两种操作方式：方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中方法二：在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将D
15、NA溶液滴在花柱切面，目的基因借助花粉管通道进入胚囊。第三步：将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法目的基因目的基因Ti质粒质粒表表达达载载体体农农杆杆菌菌植植物物细细胞胞植物细胞植物细胞染色体染色体DNA新性状新性状植株植株构建转入导入插入表达第三步：将目的基因导入受体细胞植物细胞：目的基因导入受体细胞的方法：动物细胞：微生物细胞：花粉管通道法、农杆菌转化法花粉管通道法、农杆菌转化法显微注射法显微注射法Ca2+处理处理 感受态细胞感受态细胞(能吸收周围环境能吸收周围环境DNA分子的生理状态分子的生理状态)第四步：目的基因的检测与鉴定思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？结合
16、基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？目的基因检测示意图第四步：目的基因的检测与鉴定思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？DNA分子杂交技术 分子杂交技术第四步：目的基因的检测与鉴定思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？抗原-抗体杂交技术第四步：目的基因的检测与鉴定思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？个体生物学水平鉴定抗虫接种实验 采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃
17、虫，观察棉铃虫生存情况，以确定是否抗虫和抗性程度。)第四步：目的基因的检测与鉴定方法归纳：方法归纳：Bt基因基因mRNABt抗虫蛋白抗虫蛋白抗虫棉抗虫棉PCR、分子杂交技术抗原 抗体杂交技术分子水平抗虫鉴定（个体水平）当堂练习牛刀小试利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是（）A番茄细胞中检测到鱼的抗冻蛋白 B大肠杆菌中检测到人干扰素基因mRNA C山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 D酵母菌细胞中提取到人胰岛素基因A课堂小结基因工程的基本操作程序：获取质粒、噬菌体等载体筛选和获取目的基因检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达
18、其遗传特性将含有目的基因的表达载体导入受体细胞用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定到社会中去转基因抗虫棉在世界范围内被广泛种植，有效控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢？根据棉铃虫对传统农药产抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫存在对抗虫蛋白产生抗性的可能。请你查阅资料，了解以下问题。1、在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？2、科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性
19、之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？到社会中去1、在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。到社会中去科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗
20、性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作（非抗品种）轮作或套作等。（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。2、科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？练习与应用八氢番茄红素合酶（其基因用八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）表
21、示）和胡萝卜素脱饱和酶（其和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用基因用crt表示）参与表示）参与-胡萝卜素的合成。胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和和crt基因转入水稻，使水稻胚乳中富含基因转入水稻，使水稻胚乳中富含-胡萝卜素，由此生产出的大米胡萝卜素，由此生产出的大米称为称为“黄金大米黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。请根据以上信息回答下列问题。练习与应用（1）科学家在培育）科学家在培育“黄金大米黄金大米”时，将时，将ctr和和psy基因导入含基因导入含
22、pmi基因的质粒基因的质粒中，构建了质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是。该项研究的目的基因是_，标记基因是，标记基因是_，质粒，质粒pSYN12424的作用是的作用是_。（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？为什么？ctr基因和psy基因pmi基因将目的基因送入水稻细胞不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。1、转Bt基因抗虫棉可以有效地用于棉铃虫的防治。有科学家预言，此转基因抗虫棉独立种植若干代以后，也将出现不抗虫的植株。目前，在农业
23、生产中，大田种植转基因抗虫棉的同时，会间隔种植少量非转基因的棉花或其他作物，供棉铃虫取食。间隔种植少量非转基因棉花的主要目的是 ()A.维持棉田物种多样性 B.减缓棉铃虫抗性基因频率增加的速度 C.使食虫鸟有虫可食 D.维持棉田生态系统中的能量流动 B练习提升2、在下列基因工程的操作中，一定不进行碱基互补配对的步骤是 （）A目的基因的筛选与获取 B基因表达载体的构建 C将目的基因导入受体细胞 D目的基因的检测与鉴定C练习提升 下3、图表示科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中与棉花的DNA分子结合起来而发挥作用的过程示意图。请据图回答下列有关问题：（1）图
24、中科学家在进行操作时，要使用的酶是_ _。限制酶和DNA连接酶练习提升（2）图中由目的基因、_、_、_、复制原点等组成。（3）基因工程基本操作程序的核心是_。启动子终止子标记基因基因表达载体的构建练习提升（4）图中的是导入了目的基因的受体细胞，经植物组织培 养获得一株棉花，这株棉花是否具有抗虫特性可进行_ _水平的鉴定。个体生物学练习提升（5）转基因农作物是否会对生物多样性构成威胁，人们看法 不一。有人认为由于存在_，且植物花粉 的存活时间和传播距离有限，转基因农作物很难与其他 植物杂交，一般不会对其他生物造成危害。也有人认为，转基因作物可通过花粉散落到它的近亲作物上，造成基 因污染。将目的基因导入_（填“叶绿体”或“细胞核”）基因组可以有效地防止基因污染。生殖隔离叶绿体练习提升