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1、n质粒是染色体外的质粒是染色体外的DNADNA分子，大小可为分子，大小可为1kb1kb到到200kb200kb。n大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。的共生型遗传因子。n其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。一、实验原理一、实验原理实验二实验二实验二实验二 质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA的分离、纯化的分离、纯化的分离、纯化的分离、纯化可再生资源利用与加工实
2、验教学中心可再生资源利用与加工实验教学中心 质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA煮沸法煮沸法煮沸法煮沸法q煮沸法原理煮沸法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为线为线状分子，而质粒状分子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当加热处理当加热处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，容易发生变性，共价闭环的质粒共价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然构象；在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白
3、质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。相中，从而可通过离心将两者分开。质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA碱裂解法碱裂解法碱裂解法碱裂解法q碱裂解法原理碱裂解法原理当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，共容易发生变性，共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH时即恢复其天然构象；时即恢复其天然构象；SDSSDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细
4、胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以使一些蛋白质变性，所以SDSSDS处理细菌细胞后，会导致细菌细处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒胞壁的破裂，从而使质粒DNADNA以及基因组以及基因组DNADNA从细胞中同时从细胞中同时释放出来。释放出来的释放出来。释放出来的DNADNA遇到强碱性（遇到强碱性（NaOHNaOH）环境，就）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒质粒DNADNA将迅速复性，而基因组将迅速复性，而基因组DNADNA，由于分子巨大，难以，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒复性。离心后，
5、质粒DNADNA将在上清中，而基因组将在上清中，而基因组DNADNA则与细则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNADNA从细菌中提取出来。从细菌中提取出来。q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液菌种菌种：E.coli MV1184（含pUC118）、E.coli K12（含pEGFP）设备设备：eppendorf管、微量取液器(20l,200l
6、,1000l)，台式高速离心机，涡旋振荡器试剂试剂：LB液体培养基、溶液、溶液、溶液、RNA酶A、饱和酚:氯仿 1:1 二、材料、设备及试剂二、材料、设备及试剂 溶液溶液：50mM 葡萄糖；25mM TrisHCl（pH8.0）；10mM EDTA溶液溶液：（新鲜配制）0.2N NaOH；1%SDS溶液溶液：5M KAC 10ml；冰醋酸 11.5ml；水 28.5ml1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4下12000g离心30秒。2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。4、加入新配制
7、的溶液200l,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。5、加入150l预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4下12000g离心5-10分钟。6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4下12000g离心5分钟。7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟，然后4下12000g离心10分钟。8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70乙醇洗沉淀一次,4下12000g离心5-10
8、分钟。9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于20l TE缓冲液(pH8.0，含20g/ml RNaseA)中，储于-20冰箱中。三、操作步骤三、操作步骤 实验结果实验结果：获得质粒获得质粒DNA（pUC118及及pEGFP）四、注意事项四、注意事项四、注意事项四、注意事项材料准备材料准备材料准备材料准备使用处于对数期的新鲜菌体（老化使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷尽量选择高拷贝
9、的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）四、注意事项四、注意事项四、注意事项四、注意事项细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解菌体量适当。菌体量适当。培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（5 5分钟），否则质粒易被打断。分钟），否则质粒易被打断。复性时间也不宜过长，否则会有基因组复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNADNA的污染。的污染。G G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，菌、酵母质粒的提取，应先用酶
10、法或机械法处理，以破壁。以破壁。四、注意事项四、注意事项四、注意事项四、注意事项核酸分离、纯化核酸分离、纯化核酸分离、纯化核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNADNA时，时，应提供相应的缓冲体系应提供相应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和离心分离两相时，应保证一定的转速和时间时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法以相应的去杂质的方法四、注意事项四、注意事项四、注意事项四、注意事项核酸沉淀、溶解核酸沉淀
11、、溶解核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/101/10体积的体积的NaAcNaAc（pH5.2pH5.2，3M3M），有利），有利于充分沉淀于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用7070的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNADNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TETE缓冲液溶解缓冲液溶解TETE中的中的EDTAEDTA能螯和能螯和MgMg2+2+或或MnMn2+2+离子，抑制离子
12、，抑制DNaseDNasepHpH值为值为8.08.0，可防止，可防止DNADNA发生酸解发生酸解 1.1.菌体老化菌体老化2.2.碱裂解不充分碱裂解不充分3.3.菌体中无质粒菌体中无质粒4.4.溶液使用不当溶液使用不当1.1.请涂布平板培养后，重新挑请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养选新菌落进行液体培养2.2.可减少菌体用量或增加溶液可减少菌体用量或增加溶液的用量的用量3.3.不要频繁转接，每次接种时不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。使用浓度是否正确。4.4.溶液溶液在温度较低时可能出在温度较低时可能出现浑浊，置于现浑浊，置于
13、3737保温片刻保温片刻直至溶解为清亮的溶液直至溶解为清亮的溶液。五、质粒五、质粒五、质粒五、质粒DNADNADNADNA提取常见问题提取常见问题提取常见问题提取常见问题q问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？原原因因对对策策1.1.混有蛋白混有蛋白2.2.混有混有RNARNA3.3.混有基因组混有基因组DNADNA1.1.不要使用过多菌体。重新纯化不要使用过多菌体。重新纯化DNADNA，去除蛋白、多糖、多酚，去除蛋白、多糖、多酚等杂质等杂质2.2.加入加入RNaseARNaseA室温放置一段时间室温放置一段时间3.3.加入溶液加入溶液II I
14、I 和和IIIIII后后防止剧烈振荡，防止剧烈振荡，可能把基因组可能把基因组DNADNA剪切成碎片剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和时间过长会导致细胞和DNADNA的的降解，培养时间不要超过降解，培养时间不要超过1616小小时。时。五、质粒五、质粒五、质粒五、质粒DNADNADNADNA提取常见问题提取常见问题提取常见问题提取常见问题q问题二：质粒纯度不高，如何解决？问题二：质粒纯度不高，如何解决？原原因因对对策策1.1.简要叙述溶液简要叙述溶液、溶液、溶液和溶液和溶液的作用，以及实验中的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。2.2.染色体染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA分离的主要依据是什么？分离的主要依据是什么？六、问题与讨论六、问题与讨论六、问题与讨论六、问题与讨论