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1、实验一、质粒实验一、质粒实验一、质粒实验一、质粒DNADNADNADNA的提取、分离和纯化的提取、分离和纯化的提取、分离和纯化的提取、分离和纯化 1 1、质粒与载体的基本知识质粒与载体的基本知识 载体（载体（vectorvector）:把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。载体的基本类型：载体的基本类型：质粒质粒（plasmid）：重组DNA技术中最常见的载体。噬菌体（phage）：Cosmid：BAC(bacterialartificialchromosome)YAC(yeastartificialchromosome)其它质粒的基本性质质粒的基
2、本性质：质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主的复制和转录系统，但质粒的复制和转录需要宿主细胞编码的某些酶和蛋白质。此外，质粒还具有编码某些酶的基因，如对抗生素的抗性等。质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型（松弛控制型（relaxedcontrol）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以
3、上。在细胞培养过程中，加适当氯霉素可使松弛型质粒的拷贝数由原来的20多个扩增至1000-3000个。质粒的不相容性（质粒的不相容性（incompatibility）利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时进入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞过程中相互竞争，只有一种质粒占优势。这样，过几代后，占小数的质粒将丢失，在细胞后代中只有二种质粒中的一种。这种现象称为质质粒粒的的不不相相容容性性（incompatibility）。但利用不同复制系统的不同质粒可在同一宿主细胞中共同存在。质粒载体的基本特性和要求质粒载体的基本特性和要求1).分子量小、多拷贝、松弛控制型2
4、).具有多种常用的限制性内切酶的单切点。3).能插入较大的外源DNA片段4).具有容易操作的检测表型。pBluescriptSK(+/-)质粒载体质粒载体（pBS）基本结构基本结构:1).ColE1origin2).Ampicillin3).Fiorigin4).MCS(多克隆位点)5).LacZback 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体（phagephage）噬菌体噬菌体为一种侵染细菌的病毒,病毒颗粒有一个包裹着48.5Kb的线性双链DNA基因组的二十面体的头部,一个长的柔韧的尾部.在感染的细胞内,噬菌体既可以以裂解性裂解性的生活周期,也可以是溶原溶原性性的生物周期(基因组整合进宿主基因组).病毒颗
5、粒内的基因组是线状的,但它的两端是单链且互补被称作 coscos末端末端(cos cos end,end,由12bp构成的粘性末端).一旦进入细胞,两个cos末端就会迅速相互结合,形成有缺口的环状基因组,细胞的DNA连接酶可修补该缺口.噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体（phagephage）在48.5Kb的基因组中,中心区域的大部分对侵染裂解都是不必要的,可以被不相关的DNA序列所替换,不过DNA的总长度必须是原长度的75%-105%之间,即37-52kb.考虑到必要区域,可克隆进入噬菌体的DNA片段大约为20kb(最大为23kb)左右.至今已用噬菌体开发出许多插入型和置换型载体插入型载体插入型载体:
6、ZAP,gt10,gt11等置换型载体置换型载体:GEM-11,GEM-12,EMBL3,EMBL4等.与一般的质粒载体不同,噬菌体转染前需要利用噬菌体外壳蛋白和噬菌体DNA加工酶组成的混合物(包装抽提物)在体外将连接好的DNA线性分子包装成噬菌体颗粒.GEM-11载体（置换型）载体（置换型）gt11sfi-Not载体及多克隆位点（插入型）载体及多克隆位点（插入型）backCosmid利用质粒分子形式,且利用了噬菌体的cos位点的特性.体外将DNA包装入噬菌体颗粒仅要求cos位点在线性DNA上有正确的距离(37-52kb).最原始的Cosmid载体是一个正常的小质粒,包含一个复制起点(ori)
7、、选择性标记及一个cos位点和一个用于克隆的限制性位点.与目的片段DNA连接后,DNA被包装进入噬菌体颗粒.感染后经cos位点配对,DNA重新环化,象正常质粒一样扩增.Cosmid载体图谱back细菌人工染色体细菌人工染色体细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomebacterial artificial chromosomebacterial artificial chromosomebacterial artificial chromosome，BAC)BAC)BAC)BAC)BACBAC是一些环状DNA分子。每个环状DNA分子中携带一个抗
8、生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子(致育因子)的严紧型控制的复制子，一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶(repE)以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座(para、parB和parC)。将外源基因组DNA片段在体外连接到约7kb的BAC载体上，然后将连接物通过电穿孔的方法导入已鉴定好的大肠杆菌重组缺陷型菌株，就构建成了单拷贝的质粒。第一代BAC载体不含那些能够用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。新型的BAC载体可以通过。互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了位点以利于克隆DNA的回收和扩增。BAC与YAC相似，没有包装限制，因此对可接
9、受的基因组DNA的大小也没有固定的限制。大多数BAC文库中克隆的平均大小约120kb，然而个别的BAC重组子中含有的基因组DNA最大可达300kb。back酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)YAC是结构上能模拟真正酵母染色体的线状DNA分子。将大片段的基因组DNA连接到YAC载体的两个“臂”上，然后将连接物通过转化的方法导入酵母菌，这样就构成了重组的YAC。每一条臂分子中都携带一个选择记号以及按适当方向排列的起端粒作用的DNA序列。另外，其中一条臂上还携带着丝粒DNA序列以及复制子序列。因此在重组的YAC中，外源基因组DNA片段的一侧为着丝粒、复制
10、子及选择标记，另一侧为第二种选择标记。通过在选择性琼脂平板上生长的菌落可鉴定出接受并稳定保持人工染色体的酵母转化子。目前使用的绝大多数YAC载体在设计上都很容易区分空载体及含有基因组DNA插入片段的载体。譬如，一些YAC载体在其克隆位点插入外源DNA后，打断了抑制型tRNA基因，导致红色而非白色酵母菌落的形成，这些红色菌落是由于酵母菌携带的dde2琥珀基因突变所致。由于YAC没有包装压力限制它们的克隆容量，因此插入片段的平均大小主要取决于基因组DNA制备的质量。大多数YAC文库中每一个克隆含有的外源DNA长度可为250400kb。而且，大小超过1Mb的哺乳类基因组DNA文库业已构建成功。bac
11、k其它载体类型其它载体类型穿梭载体穿梭载体:真核细胞/细菌质粒序列酵母附加型质粒酵母附加型质粒:可象质粒一样复制,还可整合进染色体DNA农杆菌农杆菌Ti质粒质粒:植物叶绿体叶绿体DNA:植物病毒卫星病毒卫星DNA:植物杆状病毒杆状病毒:昆虫哺乳动物病毒载体哺乳动物病毒载体:如SV40及反转录病毒2 2、质粒、质粒、质粒、质粒DNADNA的制备基本原理的制备基本原理的制备基本原理的制备基本原理从细胞中分离质粒DNA的方法都包括3个个基基本本步步骤骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA.采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，SDS和TritonX-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶可以破
12、坏菌体细胞壁和SDS或TritonX-100处理后细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细 菌 的 线 形 染 色 体 DNA变 性，而 共 价 闭 合 环 状DNA（covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA）的二条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。3 3、试剂、试剂、试剂、试剂1)LB液液体体
13、培培养养基基:蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeastextract）5g,NaCl10g,用NaOH调至pH7.2-7.5。高压下蒸汽灭菌20分钟。2)LB固体培养基固体培养基：每升液体培养基加15-20g琼脂，高压下蒸汽灭菌20分钟。3)氨苄青霉素（氨苄青霉素（Amp）母液：母液：配成50mg/ml水溶液，-20oC下保存备用。4)溶溶 液液 I：50mmol/L葡 萄 糖、25mmol/L TrisCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0).高压蒸汽灭菌15分钟,储存于4oC冰箱。5)溶液溶液II：0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母
14、液稀释)，1%SDS.6)溶液溶液III:5mol/LKAC60ml,冰醋酸11.5ml,水28.5ml.7)RNaseA母母液液：将RNaseA酶粉溶于10mmol/LTrisCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl,终浓度为10mg/ml。100加热15分钟，冷却后分装。8)饱饱和和酚酚：市售酚需重蒸。重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/LTrisCl(pH8.0)和0.1mol/LTrisCl(pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。9)氯仿：氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。10)酚酚/氯仿：氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。11)TE缓缓冲冲液
15、液：10mol/LTrisCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0).高压蒸气灭菌15分钟,储存于4冰箱。4 4、操、操、操、操 作作作作 步步步步 骤骤骤骤1 1细细菌菌的的培培养养和和收收集集：将含有质粒pBS的DH5菌株接种在LB固体培养基（含50g/ml Amp）中，37oC培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含 50g/ml Amp）中，37 培养约12小时至对数生长后期。2 2质粒质粒DNADNA的少量快速提取的少量快速提取-碱裂解法碱裂解法 1).取1.2ml培养液倒入1.5ml ependorf 管中，4下12000g离心1分。2
16、).弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。3).菌体沉淀重悬浮于100l 溶液I中（激激烈烈震震荡荡，充充分分混混匀匀），室 温下放置5-10分钟。4).加入新新配制的溶液II 200l，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠 倒ependorf管数次，以混匀内容物（千万不要震荡千万不要震荡）中，冰浴中 放置5分钟。5).加入150l预冷的溶液III，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒 ependorf管数次，以混匀内容物，冰浴中放置5-10分钟。4下 12000g离心5-10分钟。4 4、操、操、操、操 作作作作 步步步步 骤（续）骤（续）骤（续）骤（续）6).将上清液移入干净ependorf
17、管中，加入等体积的酚/氯仿(1:1)，震荡混匀，4下12000g离心3分钟。7).将上清液移入干净ependorf管中，加入等体积的氯仿，震荡混匀，4下12000g离心3分钟。8).将水相移入干净ependorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，震荡混匀后置于-20冰箱中20分钟。然后在 4下12000g离心5分钟。9).弃上清液，将管口敞开并倒置于卫生纸上，使液体流尽。加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀。4下12000g离心3分钟。10).吸去上清液，将管倒置于卫生纸上，使液体流尽，室温干燥或真空干燥10分钟.11).将沉淀溶于20l TE缓冲液（pH8.0,含20g/mlRNase A）中，储于-20 C冰箱.