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1、质粒质粒质粒质粒DNADNA的抽提、酶切及的抽提、酶切及的抽提、酶切及的抽提、酶切及电泳鉴定电泳鉴定电泳鉴定电泳鉴定试验试验试验试验YL-1试验支配试验支配上午：质粒上午：质粒DNA 的提取与纯化的提取与纯化中午：中午：质粒质粒DNA 的酶切的酶切下午：下午：电泳鉴定电泳鉴定vv质粒质粒质粒质粒(plasmid)(plasmid)：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在的独立于染色体外、具有复制实力的小分子共价闭合的独立于染色体外、具有复制实力的小分子共价闭合的独立于染色体外、具有复制实力的小分子共
2、价闭合的独立于染色体外、具有复制实力的小分子共价闭合环状双链环状双链环状双链环状双链DNADNA。vv现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因。含抗生素抗性基因。含抗生素抗性基因。含抗生素抗性基因。vv是重组是重组是重组是重组DNADNA技术中重要的载体。技术中重要的载体。技术中重要的载体。技术中重要的载体。质粒质粒作为载体的质粒：作为载体的质粒：v 多克隆位点多克隆位点v 选择标记选择标记v 容纳较大的外源容纳较大的外源DNA质粒的特
3、性：质粒的特性：相对独立性相对独立性 独立的复制单位独立的复制单位 赐予宿主细胞一些表型赐予宿主细胞一些表型 与宿主菌染色体与宿主菌染色体DNA不同不同质粒质粒提取质粒DNA的目的与意义v基因载体基因载体/基因克隆基因克隆/基因工程：基因工程：在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。如何获得批量的纯化质粒如何获得批量的纯化质粒DNA分子？分子？（一）载体的制备（一）载体的制备：质粒质粒DNA的
4、提取与纯化的提取与纯化提取方法概述提取方法概述基本步骤基本步骤基本步骤基本步骤基本步骤基本步骤培养细菌使质粒扩增培养细菌使质粒扩增收集和裂解细菌收集和裂解细菌分离、纯化质粒分离、纯化质粒常用方法常用方法常用方法常用方法常用方法常用方法碱裂解法碱裂解法煮沸裂解煮沸裂解 试剂盒法试剂盒法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法碱裂解法分别纯化质粒碱裂解法分别纯化质粒DNA基本原理：基本原理：基本原理：基本原理：利用质粒利用质粒利用质粒利用质粒DNADNA与染色质与染色质与染色质与染色质DNADNA变性与复性的变性与复性的变性与复性的变性与复性的 差异。差异。差异。差异。当当当当菌菌菌菌体体体体在在
5、在在NaOHNaOHNaOHNaOH和和和和SDSSDSSDSSDS溶溶溶溶液液液液中中中中裂裂裂裂解解解解时时时时，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质与与与与DNADNADNADNA发发发发生生生生变变变变性性性性；当当当当加加加加入入入入中中中中和和和和液液液液后后后后，质质质质粒粒粒粒DNADNADNADNA分分分分子子子子能能能能够够够够快快快快速速速速复复复复性性性性，呈呈呈呈溶溶溶溶解解解解状状状状态态态态，离离离离心心心心时时时时留留留留在在在在上上上上清清清清中中中中；蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质与与与与染染染染色色色色体体体体DNADNADNADNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。不复性
6、而呈絮状，离心时可沉淀下来。不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。原理示意图原理示意图溶液溶液：50mmol/L葡萄糖葡萄糖,（pH8.0）10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl溶液溶液：0.2mmol/L NaOH,1%SDS 溶液溶液：pH4.8,K+=3mol/L,（pH4.8）Ac-=5mol/L 重悬细菌；保重悬细菌；保护和缓冲作用护和缓冲作用裂解细菌裂解细菌蛋白、蛋白、DNA变性变性中和中和NaOH质粒质粒DNA复性复性染色质染色质DNA、蛋白不能复性、蛋白不能复性重要试剂重要试剂碱裂解法碱裂解法提取质粒的提取质粒的流程流程离心
7、收集菌体离心收集菌体溶液溶液IIIIII中和中和溶液溶液I I充分重悬充分重悬溶液溶液IIII裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液1.取1mL菌液于1.5mL离心管中，10000rpm离心1min，弃上清。2.将细菌沉淀悬浮于100L冰预冷的 溶液I 中，振荡混匀。3.加200L簇新配制的溶液II，盖紧管盖，上下温顺颠倒离心管混匀5次（勿猛烈振荡），冰上放置2min。4.加入150L预冷的溶液III，将管温顺上下颠倒数次（6-8次）混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置3min。碱裂解法提取质粒操作步骤v 步骤步骤1中可用移液枪将残
8、留液体吸取，勿吸到沉淀。中可用移液枪将残留液体吸取，勿吸到沉淀。v 步骤步骤2中应充分悬浮，使细胞分散混匀。中应充分悬浮，使细胞分散混匀。v 步骤步骤3、4中切记动作温顺，应缓慢上下颠倒离心管混中切记动作温顺，应缓慢上下颠倒离心管混 v 匀匀，勿猛烈振荡，否则质粒简洁断裂。，勿猛烈振荡，否则质粒简洁断裂。菌液：菌液：E coli JM109菌株菌株(含含pUC19-X基因重组质粒基因重组质粒)5.12000rpm离心5min，当心吸取上清至干净的1.5mL离心管中。6.加等体积（约450L）酚:氯仿，混匀，12000rpm离心5min，取上清移至另一1.5mL离心管中。7.加1mL冰预冷无水乙
9、醇，上下颠倒混匀几次，室温放置10min；12000rpm离心5min，弃上清。8.加1mL冰预冷70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5min。9.弃上清，室温放置5-10min，晾干沉淀。10.加20L含RNase（无DNase）的TE溶解DNA，37水浴消化 15-30min以去除RNA。碱裂解法提取质粒操作步骤v 步骤步骤5、6中吸取上清液时应避开将交界面的蛋白、染中吸取上清液时应避开将交界面的蛋白、染 v 色体色体DNA也吸走。也吸走。v 不要让质粒完全干燥，否则将难以溶解。不要让质粒完全干燥，否则将难以溶解。下一步试验用下一步试验用提取质粒后分装 每人最终得到每人最终得到20L质
10、粒质粒DNA，其中，其中10L用用于酶切，于酶切，5L用于电泳，其余用于电泳，其余5L用于下次的转用于下次的转化试验，切记！化试验，切记！作好标记，作好标记，放在讲台上放在讲台上20L质粒质粒5L质粒质粒（冻存冻存）10L质粒质粒（酶切酶切）5L质粒质粒（加入加入15L TE）试验留意事项v 移液枪的正确运用移液枪的正确运用v 标记好自己的离心管标记好自己的离心管v 加不同溶液要换枪头加不同溶液要换枪头v 转移上清时不要吸到沉淀转移上清时不要吸到沉淀v 运用酚运用酚:氯仿留意平安氯仿留意平安v 离心机的运用：严格平衡离心机的运用：严格平衡留留意意（二）（二）质粒质粒DNA的酶的酶切及切及电泳鉴
11、定电泳鉴定 识别特异的识别特异的DNA序列，并在识别位点或其四周切序列，并在识别位点或其四周切割双链割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。常用限制性内切核酸酶有高度特异的碱基识别序列常用限制性内切核酸酶有高度特异的碱基识别序列和切割点。和切割点。例如例如 EcoR的切割位点：的切割位点：G A A T T C C T T A A G Hind 的切割位点：的切割位点：AA G C T T T T C G AA 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）本试验所提取的质粒为重组质粒，含有插入的目的片段。假本试验所提取的质粒为重组质粒，含有插入的目的片段
12、。假如用如用EcoR和和Hind 同时切割重组质粒（含两个单一酶切位同时切割重组质粒（含两个单一酶切位点），就产生两条带相应酶切位点的线性点），就产生两条带相应酶切位点的线性DNA分子。分子。3.4kb2.5kb0.9kbEcoRHind 运用限制性内酶切的原则限制酶的热不稳定性，选择合适的条件；限制酶的热不稳定性，选择合适的条件；限制酶的热不稳定性，选择合适的条件；限制酶的热不稳定性，选择合适的条件；避开反复冻融，保持低温（冰浴）下进行；避开反复冻融，保持低温（冰浴）下进行；避开反复冻融，保持低温（冰浴）下进行；避开反复冻融，保持低温（冰浴）下进行；酶的用量可参照酶单位的定义确定；酶的用量可
13、参照酶单位的定义确定；酶的用量可参照酶单位的定义确定；酶的用量可参照酶单位的定义确定；两种以上的酶切割两种以上的酶切割两种以上的酶切割两种以上的酶切割DNADNA时应选择合适的缓冲液；时应选择合适的缓冲液；时应选择合适的缓冲液；时应选择合适的缓冲液；酶切反应必需运用无菌离心管及吸头号，避开交叉污染。酶切反应必需运用无菌离心管及吸头号，避开交叉污染。酶切反应必需运用无菌离心管及吸头号，避开交叉污染。酶切反应必需运用无菌离心管及吸头号，避开交叉污染。质粒质粒DNA 10L 10M Buffer 2L EcoR 1L Hind 1L ddH2O 6L 20合计合计 20L准备室老师已将其配成2限制性
14、酶反应混合液 双酶切体系的建立双酶切体系的建立重组质粒的酶切反应5L质粒质粒（冻存冻存）5L质粒质粒（加入加入15L TE）酶切反应体系酶切反应体系 质粒质粒DNA 10L 2限制性酶反应混合液限制性酶反应混合液 10L20L质粒质粒10L质粒质粒（酶切酶切）共计共计20L37水浴保温水浴保温2-3h2限制性酶反应液包含：限制性酶反应液包含：10酶反应缓冲液、酶反应缓冲液、EcoR I、Hind III核酸电泳l核酸分子是两性解离分子，在核酸分子是两性解离分子，在pH8.0pH8.5时，磷酸时，磷酸全部解离，使得核酸分子带负电荷，向电场正极移动。全部解离，使得核酸分子带负电荷，向电场正极移动。
15、l 具有不同的相对分具有不同的相对分子子 l质量的质量的DNADNA片段在凝片段在凝胶中泳动速度不一样，胶中泳动速度不一样，因而可依据因而可依据DNADNA分子分子的大小或构型来使其的大小或构型来使其分别。分别。质粒的三种构型质粒的三种构型在细胞内在细胞内质粒质粒常以共价闭环常以共价闭环的超螺旋形式存在的超螺旋形式存在如果两条链中有一条的一处或多处如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子的张力，形成松弛型的环状分子如果两条链均断开，即为线如果两条链均断开，即为线状状DNA超螺旋超螺旋超螺旋超螺旋DNA DNA（CCC
16、 DNACCC DNA）开环开环开环开环DNA DNA（OC DNAOC DNA）线状线状线状线状DNA DNA (L DNA)(L DNA)电泳时，三者泳动速度大小关系（？）电泳时，三者泳动速度大小关系（？）最快中最慢重组质粒双酶切电泳酶酶切切质质粒粒线线状状质质粒粒DNA标标准准插入片段插入片段线性载体线性载体DNA 标准（Marker）是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题以及估算条带的大小。质粒DNA电泳步骤v制胶制胶v取酶切后的质粒取酶切后的质粒DNA溶液溶液20 L、酶切比照的质粒、酶切比照的质粒DNA溶液溶液20L，各
17、加，各加5上样缓冲液上样缓冲液5 L，混匀后，混匀后，用移液枪渐渐将混合物加至样品孔中；另加入用移液枪渐渐将混合物加至样品孔中；另加入v 5 L DNA Marker至另一样品孔中。至另一样品孔中。v电压电压120V，电泳约，电泳约40min-1h。点样：开环构型开环构型线性构型线性构型超螺旋构型超螺旋构型（希望得到最多）（希望得到最多）预期电泳结果预期电泳结果点样孔（如果纯化不好，就可点样孔（如果纯化不好，就可能有能有DNA-蛋白复合物残留）蛋白复合物残留）RNA残留残留酶酶切切后后提提取取的的质质粒粒2.5Kb0.9Kb小结1质粒的提取：碱裂解法分别纯化质粒质粒的提取：碱裂解法分别纯化质粒
18、DNA，利用质粒，利用质粒 DNA与染色质与染色质DNA变性与复性的差异。变性与复性的差异。2质粒的酶切：限制性核酸内切酶可以识别特异质粒的酶切：限制性核酸内切酶可以识别特异 的的DNA序序 列，并切割双链列，并切割双链DNA。本试验中。本试验中EcoR I、Hind III将将3.4 Kb的质粒双酶切为的质粒双酶切为2.5 Kb和和0.9Kb的两个片段。的两个片段。3电泳分析：利用不同的分子量的电泳分析：利用不同的分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶片段在琼脂糖凝胶 中泳动速度不一样使其分别。中泳动速度不一样使其分别。思索题1.1.碱裂解法分别纯化质粒碱裂解法分别纯化质粒DNADNA基本原理是什么？结合基本原基本原理是什么？结合基本原 理分别讲解并描述溶液理分别讲解并描述溶液、发挥怎样的作用。发挥怎样的作用。2.2.试验操作中应留意哪些步骤？否则可能产生怎样的后果？试验操作中应留意哪些步骤？否则可能产生怎样的后果？3.3.如何通过电泳分析推断得到的质粒如何通过电泳分析推断得到的质粒DNADNA的质量？的质量？4.4.假如质粒假如质粒DNADNA中残留有蛋白质或中残留有蛋白质或RNARNA，电泳后会出现什么结，电泳后会出现什么结 果？果？