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1、一、温敏突变株的特性一、温敏突变株的特性二、温敏突变株的筛选方法二、温敏突变株的筛选方法 诱变诱变 富集富集 筛选筛选 三、温敏突变株在工业中的应用三、温敏突变株在工业中的应用 第四节第四节 温敏突变株的筛选温敏突变株的筛选 1、温度敏感突变株、温度敏感突变株（temperature-sensitive mutant,TS突变株）突变株）在诱变处理后的菌群中能分离到这样一类在诱变处理后的菌群中能分离到这样一类突变株：在许可温度下能正常生长，其表型和突变株：在许可温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别，在非许可的温度下不能生长野生型没有区别，在非许可的温度下不能生长或微弱生长，表型与野生型不同
2、，这属条件致或微弱生长，表型与野生型不同，这属条件致死型突变株。死型突变株。一、温敏突变株的特性一、温敏突变株的特性n n必需基因突变：非许可温度下不生长。必需基因突变：非许可温度下不生长。n n非必需基因突变：添加某些生长因子生长。非必需基因突变：添加某些生长因子生长。2、诱变机制、诱变机制CM（非许可温度下培养）（非许可温度下培养）MM（非许可温度下培养）（非许可温度下培养）MM（许可温度下培养）（许可温度下培养）必必需需基基因因突突变变非必需基因突变非必需基因突变酶的活力、酶的活力、菌体生长和菌体生长和代谢正常代谢正常酶的活力丧失、酶的活力丧失、菌体生长停止菌体生长停止许可温度下许可温度
3、下非许可温度下非许可温度下发酵产发酵产物积累物积累和分泌和分泌 这是因为在许可温度下所合成的酶在转这是因为在许可温度下所合成的酶在转入非许可温度下的一段时间仍然保持一定的入非许可温度下的一段时间仍然保持一定的浓度并具有活性，另外在非许可温度下培养浓度并具有活性，另外在非许可温度下培养时，仍能合成少量酶。时，仍能合成少量酶。3、发酵生理性能、发酵生理性能1、诱变、诱变n n突变株主要是基因错义所致突变株主要是基因错义所致n n采用的诱变剂，要选择易于引起碱采用的诱变剂，要选择易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚硝酸、紫外线物，或亚硝酸、紫外线n n方法同
4、常规育种相同方法同常规育种相同。二、温敏突变株的筛选方法二、温敏突变株的筛选方法n n（1）抗生素法）抗生素法n n（2）过滤或离心法）过滤或离心法n n（3）H3前体法（富集大分子合成缺损前体法（富集大分子合成缺损TS）2、富集、富集离心离心加抗生素加抗生素非许可温非许可温度下培养度下培养分离分离过滤或离心过滤或离心非许可温非许可温度下培养度下培养分离分离非许可温非许可温度下培养度下培养分离分离加入加入H3尿嘧啶尿嘧啶非必需基因突变非必需基因突变必需基因突变必需基因突变3、分离筛选、分离筛选n n（1）常规法）常规法诱变后的菌悬液诱变后的菌悬液分离分离CM（许可温度下培养）（许可温度下培养）
5、MM（30许可）许可）CM MM（40不许可）不许可）影印影印诱变后的菌悬液诱变后的菌悬液分离分离CM（许可温度下培养）（许可温度下培养）诱变后的菌悬液诱变后的菌悬液分离分离CM（许可温度下培养）（许可温度下培养）标记MM（30许可）许可）非许可温度非许可温度三、温敏突变株在发酵工业中的三、温敏突变株在发酵工业中的应用应用1、在谷氨酸发酵中的应用、在谷氨酸发酵中的应用n n加入青霉素和表面活性剂加入青霉素和表面活性剂n n生物素缺陷型生物素缺陷型n n油酸或甘油缺陷型油酸或甘油缺陷型温敏型突变株：温敏型突变株：30培养菌体培养菌体大量繁殖大量繁殖37培养十几培养十几个小时个小时细胞膜的合成细胞
6、膜的合成结构发生障碍结构发生障碍2、在丝氨酸发酵中的应用在丝氨酸发酵中的应用原料原料甲醇甲醇丝氨酸丝氨酸甘氨酸甘氨酸磷酸烯醇式磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸C4二羧酸二羧酸丝氨酸羟甲基酶丝氨酸羟甲基酶8-羟基圭林、2,2-联吡啶、Co2+或Ni2+3、微生物单细胞蛋白的生产、微生物单细胞蛋白的生产 作为生产单细胞蛋白的微生物菌种，除本作为生产单细胞蛋白的微生物菌种，除本身应富含蛋白质外，还要生长速度快，底身应富含蛋白质外，还要生长速度快，底物利用率高；细胞壁易破碎，容易自溶和物利用率高；细胞壁易破碎，容易自溶和絮凝。絮凝。DNA复制缺损酵母复制缺损酵母26生长正常生长正常37细胞形态发生变化，凝细胞形
7、态发生变化，凝聚成丛状聚成丛状2生长正常生长正常37自溶自溶第五节第五节 抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育一、烈性噬菌体及其效价的测定一、烈性噬菌体及其效价的测定三、抗噬菌体菌株的选育三、抗噬菌体菌株的选育二、温和噬菌体及溶源菌二、温和噬菌体及溶源菌四、抗噬菌体菌株的特性研究四、抗噬菌体菌株的特性研究 噬菌体的生活史：噬菌体的生活史：效价：每毫升试样中所含有的侵染性的效价：每毫升试样中所含有的侵染性的噬菌体粒子数。噬菌体粒子数。1、重层琼脂法、重层琼脂法 2、单层平板法、单层平板法 3、快速测定法、快速测定法 4、斑点试验法、斑点试验法一、烈性噬菌体及其效价的测定一、烈性噬菌体及其效价的测
8、定吸附侵入增殖成熟裂解噬菌体浓度含噬菌含噬菌体样品体样品敏感菌敏感菌琼琼脂培养脂培养基基琼琼脂培养脂培养基基涂布噬涂布噬菌体菌体重层琼脂法重层琼脂法重层琼脂法重层琼脂法 单层平板法单层平板法单层平板法单层平板法快速测定法快速测定法快速测定法快速测定法斑点试验法斑点试验法斑点试验法斑点试验法二、温和噬菌体及溶源菌二、温和噬菌体及溶源菌n n1、温和噬菌体（、温和噬菌体（temperate phage）：）：如果侵入宿主后，噬菌体的如果侵入宿主后，噬菌体的DNA只整合只整合在宿主的核染色体组上，并长期随宿主在宿主的核染色体组上，并长期随宿主DNA的复制而复制，在一般情况下不进行的复制而复制，在一般
9、情况下不进行增殖和引起宿主细胞裂解。增殖和引起宿主细胞裂解。2、温和噬菌体存在的形式、温和噬菌体存在的形式（1）具有完整的颗粒形态，对细胞具有感染）具有完整的颗粒形态，对细胞具有感染力的游离状态；力的游离状态；（2）侵入细胞后，）侵入细胞后，DNA与宿主染色体结合，与宿主染色体结合，成为原噬菌体；成为原噬菌体；（3）脱离寄主染色体，在细胞内成为具有独）脱离寄主染色体，在细胞内成为具有独立繁殖能力的营养期噬菌体。立繁殖能力的营养期噬菌体。侵入侵入原噬菌体原噬菌体溶源菌溶源菌3、溶源菌的显著特性、溶源菌的显著特性（1 1）自发裂解）自发裂解）自发裂解）自发裂解（2 2）诱导）诱导）诱导）诱导（3
10、3）复愈）复愈）复愈）复愈（4 4）免疫性（）免疫性（）免疫性（）免疫性（immunityimmunity）（5 5）溶源转变（）溶源转变（）溶源转变（）溶源转变（lysogeniclysogenic conversion conversion）n n存在于细菌中放线菌中存在于细菌中放线菌中存在于细菌中放线菌中存在于细菌中放线菌中 筛选时要注意区分真正的抗性菌株和溶源菌。筛选时要注意区分真正的抗性菌株和溶源菌。筛选时要注意区分真正的抗性菌株和溶源菌。筛选时要注意区分真正的抗性菌株和溶源菌。n n溶源菌检测：溶源菌检测：溶源菌检测：溶源菌检测：少量溶源菌和大量敏感指示菌混合培养，形成少量溶源菌和
11、大量敏感指示菌混合培养，形成少量溶源菌和大量敏感指示菌混合培养，形成少量溶源菌和大量敏感指示菌混合培养，形成中央有小的溶源菌落，四周有透明圈的特殊噬菌中央有小的溶源菌落，四周有透明圈的特殊噬菌中央有小的溶源菌落，四周有透明圈的特殊噬菌中央有小的溶源菌落，四周有透明圈的特殊噬菌斑斑斑斑 三、抗噬菌体菌株选育三、抗噬菌体菌株选育噬菌体的危害1、专一性噬菌体获得和纯化、专一性噬菌体获得和纯化噬菌斑蛋白胨培养液重层琼脂法纯化2、高效价噬菌体原液的制备、高效价噬菌体原液的制备重层琼脂法纯化 对数期敏感菌10h离心 10h对数期敏感菌过滤器 3、噬菌体原液效价测定、噬菌体原液效价测定用用 含含1的的 蛋白
12、胨稀释，然后涂布重层琼脂蛋白胨稀释，然后涂布重层琼脂效价=平均每皿噬菌斑稀释倍数取样值4、菌株诱发突变和分离、菌株诱发突变和分离诱变剂噬菌体含噬菌体平板5、液体摇瓶振荡培养、液体摇瓶振荡培养培养至对数期高效价噬菌体新培养基高效价噬菌体高效价噬菌体高效价噬菌体酶活力抗性都高的菌株选育流程选育流程1、专一性噬菌体获得和纯化、专一性噬菌体获得和纯化2、高效价噬菌体原液的制备、高效价噬菌体原液的制备3、噬菌体原液效价测定、噬菌体原液效价测定4、菌株诱发突变和分离、菌株诱发突变和分离5、液体摇瓶振荡培养、液体摇瓶振荡培养6、进一步考查抗噬菌体菌株对周围环境、进一步考查抗噬菌体菌株对周围环境中存在的各种噬菌体的抗性中存在的各种噬菌体的抗性重层琼脂法多次分离重层琼脂法多次分离敏感菌敏感菌离心上清为高效价噬离心上清为高效价噬菌体菌体效价测定效价测定诱变诱变平板平板分离分离摇瓶摇瓶分离分离抗性抗性测定测定被感染后被感染后的噬菌斑的噬菌斑 敏感菌敏感菌纯纯化化高效价高效价噬菌体噬菌体的制备的制备效价效价(U/ml)=平均每皿噬菌斑数平均每皿噬菌斑数稀释倍数稀释倍数取样量取样量四、抗性菌株的特性研究四、抗性菌株的特性研究1、抗性菌株稳定性试验、抗性菌株稳定性试验2、抗性菌株的产量性能、抗性菌株的产量性能