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1、植物组织培养问题解答徐程浙江大学生命科学学院污染症状病毒植物病毒引起的疾病对农业和园艺都造成了巨大的损失。在组培中，无菌条件下工作尤为重要，将受病毒感染的外植体进行微繁培养将产生成千上万的带病植株。然而，“无菌”这一术语并不明确。无菌？不存在，只进行一些病毒测试？在对一种病毒进行检测后，植物就可以生产。组培中除掉病毒感染的一个方法是用分生组织进行培养。为了除掉病毒感染首先必须知道植物的哪个部位感染了病毒。病毒可以分为35个家族或组。已经发现的有700多种。不同病毒的分类病毒的检测（方法）把病毒接种到宿主上验证是否引起预定的疾病。电子显微镜显示病毒颗粒的大小和形态特征。ELISA/血清检验核酸杂
2、交/PCR聚合酶链式反应（PCR）可以扩增病毒DNA特殊片段。这些片段可以通过凝胶电泳进行分析。ELISA：酶联免疫吸附试验ELISA利用抗体检测病毒。有很多方法，其原理见下图。首先病毒结合到与ELISA盘孔内壁表面，然后加入抗病毒的抗体。抗体加入要过量这样所有的病毒颗粒都与抗体结合。而后过量的抗体可以洗去。这样剩下的抗体数量与病毒是一致的。抗体又与一种酶相结合。无色的底物加入孔中。由于酶的作用使这种底物转变为有颜色的复合物，这可以通过分光光度仪测出。颜色越深，病毒越多。分生组织培养分生组织培养可以或者也可不与母株的温热疗法(35C)结合，在培养基中加入化学抗菌剂（如virasol）。分生组织
3、选取得越小，除去某种病毒或细菌的可能性越大。细菌在培养过程中我们没有办法做到与细菌完全隔绝。有时细菌感染的症状可以在植株或培养基上观察到。通常可见的症状出现在培养后期，或是在继代几次后才出现。它们也可能不完全出现，但在驯化期早期会造成一些困难。并非所有的细菌都是致病，甚至有些是有益的。组培中常见的一些细菌农杆菌3%杆状菌13%肠杆菌12%假单胞菌19%乳酸菌11%葡萄球菌26%一般组培过程中上述细菌出现频率。Symptoms of bacteria infection(left:no bacteria;right contaminated)真菌真菌感染主要来源是：表面灭菌不充分转移操作过程中的
4、污染真菌孢子随微小的东西或牧草虫传播真菌污染可以轻易地用肉眼观察到。支原体检测支原体比较困难，因为它们不易培养，所以鉴定也非常不容易。小型节肢动物和牧草虫很多实验室都可见到小型的节肢动物或牧草虫。这是一个主要的问题。虽然这是生物是无害的，但它们会传播真菌孢子及细菌，从而给培养造成困难mitesthripsfungal contamination by mites生活史雌性螨把自己黏附在宿主上，并吮吸获得食物。从那一刻起身体开始生长并且产卵，而后这些卵发育成胚，直至成虫。10天以后，新的一代就产生了。最早出生的通常是1个雄性，然后接着出生约150个雌性。这些雌性都由这一雄性受孕。这也可以解释为什
5、么小昆虫群落会成指数增长。螨一个培养瓶中可容纳几千个螨肚子充满卵的雌螨a burst female,filled with offspring如何治疗？病毒分生组织培养，延缓生长，温热疗法细菌分裂组织培养，抗生素？真菌适当杀菌，避免小型节肢动物及牧草虫支原体支原体消除剂小型节肢喷雾杀虫剂，将器皿置于胶表面动物和牧草虫抗生素：在植物中没有专一的抗生素可供使用。所有可得到的抗生素来自于在人类和动物上已经适用的。经典的抗生素只有对细菌的抑制效应而对植物没有杀菌剂量的忍耐性。它们可以暂时抵制细菌的出现。到目前为止，没有一种清晰的诊断工具可以检测外植体不受细菌污染。检测指数病毒细菌细菌仔细观察培养基的基
6、部或许可以找到一些污染的证据，但对于生长缓慢的细菌、内部寄生植物或不在培养基上生长的那些细菌，光用肉眼看就不够了。为了检测这种不可见的污染，有必要创造有利于真菌生长的环境。很多细菌，当然不是所有的，转移到两到三种商业细菌培养基上就可以检测到。为了标定指数，需要把一系列茎的切片接种到液体培养基、琼脂固化的酵母葡萄糖培养基、沙氏葡萄糖培养基及AC培养基上，30C下孵化三周。如果可以看到污染物生长，就可以通过使用标准的细菌学方法和特定的生化测验如革兰染色、运动性、白明胶酶、氧化酶和氧化/发酵等进行纯化。另外，可以选择使用商业产品Biolog系统，它检测碳源利用情况，并可提供2448h的检测记录。然而
7、，通过使用标准化的程序却没有检测到细菌污染的事实也不一定就说明培养不受细菌污染。事实上，检测细菌的大多数程序是在病原体基础上开发的，显然在组培中还有很多污染没有被详细描述。理论上，还没有获得标准的检测程序。生态生理学保水能力水分运输气体保水能力测定叶片随时间的失水状况可以衡量植物的保水能力。图示表明，与温室中的植物相比，组培植物保水能力较差。将容器中的相对湿度降到75%，失水曲线的图形与温室植物相似。这说明水分控制是由于功能好的气孔的作用。水分运输在组培容器中水分流动非常重要。芽生存依赖的糖的浓度对水分流动不起主要作用，而琼脂浓度却起到了主要的作用。琼脂浓度越高，就有越多的水分经芽流向周围环境
8、。这些芽就具有较好的保水能力。褐化症状：分离后外植体或培养基很快转成褐色或黑色。生长受抑制，并且往往组织死亡。那些自然环境下含有高浓度单宁酸或间苯二酚的品种的生长抑制是严重的，褐化可能受取材时外植体年龄、污染的存在以及灭菌过程等的影响。Explant browning产生褐化的原因组织变黑是由于含铜的氧化酶（如多酚氧化酶和酪氨酸酶）的作用，当组织受损时可以被释放或合成，表现出氧化性。不同的组织这些酶的底物不同。酶和底物分别处于细胞的不同部位，当细胞受损或垂死时相互结合。苯酚有一个重要的属性是可以调节IAA的氧化（生长素保护剂）。苯酚的毒性可能主要是与蛋白质可逆的氢键结合。当苯酚氧化形成高活性的
9、苯醌复合物，然后循环、聚合或氧化蛋白质，不断形成黑色复合物，就产生了不可挽回的生长抑制。Polyphenolic deposits(P)contained within:1 Nepenthes pitcher cells 2 Nepenthes stem cells3 Nepenthes leaf cells4 Sarracenia pitcher cells挽救措施组织和培养基的褐化通常可以通过下列方法解决：除去已形成的酚复合物过滤或驱散：预处理：流水冲洗分离后在无菌水中浸泡23h转移到新的培养基上（分泌液被琼脂吸收，浓度增加）间隔23d转移一次，转移56次，直到酚氧化终止为止在液体培养基上
10、进行初始培养活性炭吸附：从培养基中吸收15g/L的抑制复合物，但同时也吸收其他物质（主要是有机分子）利用PVP吸收：如果被多酚或单宁抑制，蛋白质、氨基化合物和聚酰氨可恢复酶活力。但PVP不是次次灵。修改潜在的氧化还原作用（弱化剂或抗氧化剂）抗氧化剂是一种易于氧化的产品，因而它可以延长酚醌氧化的停滞阶段。常用的产品有：抗坏血酸维生素C、柠檬酸、L-半胱氨酸氢氯化物、dithiothreitol、谷胱甘肽、巯基乙醇、灭菌前或后经滤纸过滤这些复合物可以单独或配合使用。一些抗氧化剂氧化后就变成强的氧化剂，例如抗坏血酸维生素C。所以，将它们加入培养基中长时间是有害的。酚酶失活（酚氧化酶作用的抑制）酚氧化
11、酶的作用可以被以下物质抑制：螯合剂：螯合铜离子diethyldithiocarbamatedimethyldithiocarbamate降低酚酶活性和底物的可获得性在pH为6.5时，多酚氧化酶活性最高，在低于这个值时活性下降降低PGR水平（初始）降低KNO3用葡萄糖代替蔗糖黑暗黑暗或低光照Blackening of tissuePrevention of blackening体细胞变异来自于植物细胞培养和不定芽的个体高度变异的现象称为体细胞变异。体细胞克隆变异不限制于，但在愈伤组织再分化时普遍存在。变异可以是基因型，也可以是表型的。后者在起源上是可遗传或后生的。典型的遗传变化有：染色体数目的变
12、化（加倍或非整倍的），染色体结构变化（颠换、缺失、重复），DNA序列（碱基突变）。典型的和后生相关的事件：基因扩增、基因甲基化。Somoclonal variation in Rhododendron plants derived from adventitiousshoots如果看不出明显的形态遗传变化，就要用其他的方法来检测。体细胞克隆变异有利有弊：利：体细胞克隆变异最可能的益处是植物的改良。体细胞克隆变异导致产生基因额外的多变性。在离体培养过程中体细胞突变体的变异使特性大大丰富，包括抗病抗毒性、抗除草剂能力以及对环境和化学压力的忍耐力，以及次生代谢产物的增加。弊：在操作过程中体细胞变异一个严重的不足是产品非一致性。在应用组培的园艺和林业中，需要对优良的基因型进行快速繁殖。减少体细胞变异的方法：为了避免体细胞变异，可以采用不同的步骤。众所周知，增加继代次数就会增加体细胞变异的可能性，所以继代的次数必须维持在最小。定期从新的外植体引发克隆可以减少变异。另一个减少体细胞克隆变异的方法是培养基中避免使用2,4-D，因为这种激素可以诱导变异。