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1、.A549 细胞的培养 A549 细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以 1：21：3 传代培养都是可行的。一、所需溶液 1，细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)无 Ca、Mg NACL 8.00g；KCL 0.20g;KH2PO4 0.20g;Na2HPO4.。12H2O 1.15g 加水至 1 000mL,将 PH 调至 7.4，高压灭菌。2，消化液（1）胰酶-PBS 结晶胰酶 2.5g;高压灭菌后的 PBS 1000ml 用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过 0.22m 的滤膜过滤除菌，分装备用，放置20保存。（2）胰酶EDTA:结晶
2、胰酶 0.5g;EDTA 盐溶液 0.2g 无 Ca、Mg PBS 1 000ml 用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过 0.22m 的滤膜过滤除.菌，分装备用，放置20保存。3，细胞培养液：RPMI 1640 培养液 配制方法：（1）将一袋干粉型 RPMI 1640 培养基溶于 900ml 三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。（2）加入丙酮酸钠 0.1g，NaHCO2 2g 以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为 100U/ML 青霉素和 100U/ML 链霉素。(一般市售的青霉素为 80 万 U/瓶，将其溶解于 4ml 三蒸水中，每升培养液中加入 0.
3、5ml；市售的链霉素为 100 万 U/瓶，将其溶解于 5ml 三蒸水中，每升培养液中加入 0.5ml)。（3）调整培养液的值，用精密试纸观察.即可。（4）过滤法除菌，所使用的滤器为加压过滤，.滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。（5）分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置20保存。二、细胞的维持和培养，细胞的复苏（）准备一个盛有温水的烧杯，从液氮罐中取出存有细胞的冻存管，放于温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。（）1000000 r，3min 离心。.（）在无菌操作台中采用 75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。（）用 1ml 枪头将上清液去除，加入 1ml 预热
4、的细胞培养液将细胞吹散开，转移至 25cm2培养瓶中。（）补充 4ml 的 RPMI 1640 培养基，并且添加 10%的胎牛血清。（）倒置显微镜下观察，37、5%CO2培养。（）24h 后，更换新的培养液。（）常规传代培养。，A549 细胞更换新的培养液（）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。（）用 PBS 反复冲洗细胞 23 遍。（）加入新鲜的预热好的培养液及 10%的胎牛血清。各种液体需要量（ml）表面积 25cm2 75cm2 150cm2 洗涤 3 5 10 胰酶 12 13 25 培养液 5 10 20（）倒置显微镜下观察，37、5%CO2培养。，A549 细胞的传代（）无菌操作打
5、开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。（）向已经长满的细胞中加入消化液 1ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表.面 2遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。（）加入 1ml 消化液，在 37培养箱中孵育 5min 后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。（）加入 5ml 预热至 37的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。（）吸取一半的细胞悬液，接种到新的 25cm2培养瓶中，补足培养液，并且添加 10%20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为 510m
6、l。（）倒置显微镜下观察，37、5%CO2培养。注意事项：（）所有液体在加入细胞瓶前均应预热到 37。所有液体均应调整 PH 至 7.2 左右，均不能超过 7.4。（）细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过多，否则会损伤细胞。（）严格执行无菌操作的要求。（）尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤，可多添加些含牛血清的培养液中和。（）培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。，A549 细胞的冻存（）消化已生长融合的单层细胞。.（）用生长液悬浮细胞，并且添加 10%的 FCS 和 10%DMSO(二甲基亚砜)。分装在 2ml 容积的冻存管中。（）用本实验室自制的冻存包包裹好冻存管，放在-70冰箱中过夜。（）放入液氮中冻存。