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1、细胞培养AEP 对 LPS 诱导的 Raw264、7 细胞炎症模型抗炎实验一、试剂与仪器（一）细胞系一、试剂与仪器（一）细胞系 RAW264RAW264、7 7。（二）试剂胎牛血清。（二）试剂胎牛血清DMEMHyClone，美国 10000U、mL 青霉素、链霉素 Gibco，美国DMSOSigma，美国 lipopolaccharideSigma，美国甲基四唑蓝(MTT)Sigma，美国对氨基苯磺酸 Sigma，美国 N-萘乙二胺 Sigma，美国（三）仪器超净台酶标仪CO2 恒温细胞培养箱显微镜离心机（四）供试品配置LPS 溶液配置：称取 LPS 粉末 5mg，溶于 1mLDMSO 中，得
2、 5mg、mL 母液。用时将母液用培养基稀释至 2g、mL（DMSO0。1%）。MTT 溶液配置：称取 MTT50mg，溶于 10mLPBS 中，避光震荡 30min。0。22m 滤膜过滤除菌，分装于避光 EP 管中，4保存，备用。Grie 试剂配置：A 液：对氨基苯磺酸 0。5g，溶于稀醋酸（10%）150mL 中，浓度 1%。B 液：N-萘乙二胺 0。1g 用纯净水 20mL 溶解，再用醋酸（10%）稀释至 150mL，浓度 0。1%。临用前分别加入 50LA 液和50LB 液，避光显色 30min。待测化合物：AEP1，AEP2，AEP3，称取化合物固体 5-10mg，用 DMSO溶解成
3、 50mg、mL 母液。用前用培养基稀释至所测浓度。二、实验方法（一）细胞培养RAW264、7 细胞用含 10%胎牛血清和 100U、mL 青霉素、链霉素的DMEM 培养基于 37，5%CO2 条件下培养。RAW264、7 细胞培养 2-3 天或者长至 70-80%左右时进行传代，弃去培养瓶中旧培养基，加入新鲜培养基，拧紧盖子后轻拍培养瓶底部再用吸管反复吹打，将细胞吹匀后进行传代。（二）细胞毒性实验取长至 70%-80%的 RAW264、7 细胞，用滴管吹成单细胞悬液，加入含10%FBSDMEM 培养基，调整细胞浓度为 1105cell、mL，接种至 96 孔板中，100L、孔，每组 6 个复
4、孔，37和 5%CO2 培养过夜。除去旧液，除空白组外其他组给予相应浓度的含药培养基，培养24 小时。实验结束前 4 小时，除去上清，加入 150L 无血清 DMEM 培养基和 20LMTT(5mg、mL)，37和 5%CO2 培养 4 小时。4 小时后用注射器轻轻吸去上清，加入150LDMSO，漩涡震荡 15min，540nm 下用酶标仪测各孔吸光度（OD）值，重复 3 次。（三）化合物对 LPS 刺激 RAW264、7 细胞 TNF-生成的影响取长至 70%-80%的 RAW264、7 细胞，拍打培养瓶背面，吹成单细胞悬液，加入含 10%FBSDMEM 培养基调整细胞浓度为 5105cel
5、l、mL，接种于 24孔板中，每孔 1mL，375%CO2 培养过夜。吸去上清，除空白组外其余加入 1mL 含 2g、mLLPS 的 DMEM 培养基，375%CO2 孵育 2 小时后，空白组和 LPS 模型组加入 1mLDMEM 培养基，其他加入 1mL 含各浓度药物的DMEM 培养基。375%CO2 孵育 24 小时。培养结束后取上清用 PBS 稀释 20倍，用 ELSA 试剂盒测按说明书操作测上清中 TNF-含量。（四）化合物对 LPS 刺激 RAW264、7 细胞 IL-2 生成的影响取长至 70%-80%的 RAW264、7 细胞，拍打培养瓶背面，吹成单细胞悬液，加入含 10%FBS
6、DMEM 培养基调整细胞浓度为 5105cell、mL，接种于 24孔板中，每孔 1mL，375%CO2 培养过夜。吸去上清，除空白组外其余加入 1mL 含 2g、mLLPS 的 DMEM 培养基，375%CO2 孵育 2 小时后，空白组和LPS 模型组加入 1mLDMEM 培养基，其他加入 1mL 含各浓度药物的 DMEM培养基。375%CO2 孵育 24 小时。培养结束后取上清用 PBS 稀释 20 倍，用 ELSA 试剂盒测按说明书操作测上清中 IL-2 含量。（五）统计分析实验重复 3 次。实验数据以SD 表示。使用 SPSS18。0 软件对数据进行统计学分析，采用单因素方差分析(On
7、e-WayANOVA)，组间差异以LSD-t 法和 Dunnettt-tet 法进行比较；与空白组比较，显著性差异分别表示 p0。05，p0。01。AEP 抗炎机制一、试剂和仪器（一）一、试剂和仪器（一）Weternblot:Weternblot:RIPA 组织细胞快速裂解液上海基尔顿生物 BCA 蛋白定量试剂盒Thermo 蛋白预染 MarkerFermenta 丽春红(PonceauS)上海基尔顿生物 NC膜、发光液 Millipore 脱脂奶粉 BD 分装 Tween-20 吐温-20Amreco 光胶片柯达仪器miniprotean3cell 电泳仪电转仪 MK3 酶标仪水浴锅抗体TL
8、R-4p38JNKERK1、2p-IBp-p65p-IKKGAPDH羊抗兔 HRP 标记二抗碧云天羊抗鼠 HRP 标记二抗碧云天（二）RT-PCR:Trizol氯仿 HPLC 级异丙醇 HPLC 级 SYBRGreenPCR 试剂盒逆转录试剂盒仪器旋涡振荡器电动匀浆机低温冷冻离心机RatCO-2PrimerF5CCTGGTCTGATGATGTATGC3PrimerR5GTATGAGTCTGCTGGTTTGG3RatiNOSPrimerF5GTCCTACACCACACCAAAC3PrimerR5CTCCAATCTCTGCCTATCC3RatGAPDHPrimerF5ATCACTGCCACCCAGAAG3PrimerR5TCCACGACGGACACATTG3二、实验方法（一）供试品配置LPS 溶液配置：称取 LPS 粉末 5mg，溶于 1mLDMSO 中，得 5mg、mL 母液，使用时用 DMEM 培养基稀释至 2g、mL（DMSO0。1%）。待测化合物：称取化合物固体（LC-36,LC43）5-10mg，用 DMSO 溶解成 50mg、mL 母液，用前用 DMEM 培养基稀释至所测浓度。TBST 缓冲液：称取 Tribae2、42g，NaCl8。01g，溶于 800mL 去离子水中，用 HCl 调 pH 至 7。6，去离子水定容至 1000mL，加入 2mL 吐温-20混匀。